幹細胞增殖抑制因子及其應用的製作方法

2023-06-02 07:37:26

專利名稱：幹細胞增殖抑制因子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及調節幹細胞周期的幹細胞增殖抑制因子在治療患有自身免疫病、衰老、癌症、骨髓發育不良、前白血病、白血病、銀屑病或涉及過度增殖情況的其它疾病的人或動物中的應用。本發明也涉及預先或已經接觸化療藥物、其它對已進入細胞周期的幹細胞有損害的藥物或輻射的人或動物的治療方法。最後，本發明涉及用於自體和異體移植方法或用於基因轉移的幹細胞的維持培養或擴大培養的改進。
背景技術：
在更新系統(renewing system)中的大多數終期細胞是短壽命的且在生命過程中不斷地被替代。例如，血細胞來源於具有自我更新能力的多潛能造血幹細胞(HSC)。造血幹細胞是造血細胞的一個亞群。造血細胞可以從例如骨髓、臍帶血或外周血(未活化的或用例如G-CSF的藥劑活化的)獲得；造血細胞包括幹細胞群、祖細胞、分化細胞、輔助細胞、基質細胞以及有助於形成產生成熟血細胞所必需的環境的其它細胞。由於造血幹細胞對於造血和免疫系統的所有成熟細胞的發育是必不可少的，因此在患者接受化療或其它藥物治療時，造血幹細胞的存活對於重建機體的全部功能性宿主防禦系統是必需的。
造血細胞的產生受一系列因子的調控，這些因子刺激造血細胞的生長，分化，其中一些因子如紅細胞生成素和G-CSF目前已用於臨床。然而，尚未完全表徵的調控網絡的一部分是形成了調控過程中的負向調節(negative arm)的反饋機制(Eaves et al，Blood，78110-117，1991)。
在早期的研究中，Lord和其同事們發現在正常的鼠和豬骨髓提取物中存在著一種可溶性蛋白因子，它能可逆性地抑制造血幹細胞的細胞周期(Lord et al.，Br.J.Haem.，34441-446，1976)。這種活性抑制物(分子量50～100kD)被命名為幹細胞抑制因子(SCl)。
由於體內檢測需要大量的受照射的小鼠這一固有的困難，初始來源的這種因子的純化沒能完成。為了克服這些困難，Pragnell和其同事們建立了一個體外檢測初級造血細胞的方法並篩選了作為活性抑制物來源的細胞系(見Graham et al.，Nature，344442-444，1990)。
由於早期的研究已鑑定出巨噬細胞是幹細胞抑制因子的可能來源(Lord et al.，Blood Cells，6581-593，1980)，因此選擇了小鼠巨噬細胞系J774.2(Graham et al.，Nature，344442-444，1990)。Graham等用該細胞系的條件培養基進行純化，分離到一種抑制性肽，它被證明與以前所描述的細胞因子，巨噬細胞炎性蛋白1-α(MIP-1α)，相同。因此，MIP-1α是從細胞系分離得到的，而不是從初級材料得到的。儘管Graham等觀察到MIP-1α抗體消除了骨髓粗提取物的活性，但其他工作者的研究表明其它抑制活性是重要的。例如，Graham等(J.Exp.Med.178925-32，1993)提出TGFβ，而不是MIP-1α是造血幹細胞的一個基本抑制因子。Eaves等(PNAS 9012015-19，1993)進一步提出在正常骨髓中MIP-1α和TGFβ兩者都處於較理想的水平，而且抑制作用需要兩個因子之間的協同作用。
其它工作者描述了另外一些幹細胞抑制因子。Frindel和其同事從胎牛骨髓和肝臟提取物中分離了一種四肽，它有幹細胞抑制活性(Lenfant et al.，PNAS 86779-782，1989)。Paukovits等(Cancer Res，50328-332，1990)表徵了一種五肽，當它以單體形式存在時是一種抑制因子，當它以二聚體形式存在時是一種幹細胞周期刺激因子。在各種離體系統中，還有一些因子也被認為是抑制性的(見Wright和Pragnell，Bailliere’s ClinicalHaematology v.5，pp 723-39，1992(Bailliere Tinadall.Paris))。
Tsyrlova等(SU156261A1)公開了幹細胞增殖抑制因子的純化方法。
至今，這些因子還沒有一個被批准用於臨床。然而，確實需要有效的幹細胞抑制因子。與化療或放療有關的主要毒性是破壞了正常增殖的細胞，導致骨髓抑制和胃腸毒性。一個有效的幹細胞抑制因子將保護這些細胞並使治療方案最優化。正如根據臨床情況，對各種刺激性細胞因子(即如下細胞因子IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、紅細胞生成素、血小板生成素、幹細胞因子，flk2/flt3配基等等，它們刺激造血細胞周期)有確定的需要一樣，對各種抑制性因子可能也有不同的臨床需要。
血紅蛋白是一種高度保守的具有約64,000道爾頓分子量的四聚體蛋白，它由兩條α鏈和兩條β鏈組成。每條鏈結合一個血紅素分子(亞鐵血紅素IX)，一個含鐵輔基。脊椎動物α和β鏈可能來源於單一的祖先基因，該基因被複製，然後分開；在鏈自身之間和不同脊椎動物之間，兩條鏈在很大程度上存在序列一致性(見

圖16A)。在人類中，16號染色體上的α鏈簇含有兩個編碼相同多肽的α基因(α1和α2)，以及編碼其它α樣鏈的基因ζ、θ和幾個非轉錄的擬基因(見圖16B人α鏈的cDNA和胺基酸序列)。11號染色體上的β鏈簇由以下基因組成一個β鏈基因和幾個β樣基因δ、ε、Gγ和Aγ，以及至少兩個非表達的擬基因(見圖16C人β鏈cDNA和胺基酸序列)。
在發育過程中，這些基因的表達發生變化。在已被深入表徵的人的造血過程中，胚胎成紅細胞成功地合成了兩個ζ鏈和兩個ε鏈的四聚體(GowerI)，兩個α鏈和兩個ε鏈的四聚體(Gower II)或兩個ζ鏈和兩個γ鏈的四聚體(Hb Portland)。隨著胚胎發生的進程，佔優勢的形式由胎兒血紅蛋白(Hb F)構成，它由兩個α鏈和兩個γ鏈組成。成人血紅蛋白(兩個α鏈和兩個β鏈)在胎兒期開始合成，在出生時大約50％的血紅蛋白具有成人的形式，大約到6月齡時轉換完成。在成人中，血紅蛋白的絕大部分(大約97％)是具有兩條α鏈和兩條β鏈的種類(Hb A)以及少量的可檢測到的Hb F或δ鏈(Hb A2)。
血紅素對血細胞生成的影響已被廣泛地研究(見S.Sassa，Seminars Hemat.25312-20，1988和N.Abraham et al.，Int.J.Cell Cloning 9185-210，1991 for reviews)。成紅細胞的成熟需要血紅素，在體外，氯化血紅素(氯化亞鐵血紅素IX-即帶有一個氯離子的血紅素)增加CFU-GEMM、BFU-E和CFU-E的增殖。同樣，氯化血紅素增加長期骨髓培養中的細胞結構(cellularity)。I.癌症的化療與放療對刺激性生長因子的大量有成果的研究導致許多這些因子(紅細胞生成素、G-CSF、GM-CSF等等)在臨床上的應用。這些因子已經降低了與化療和放療有關的死亡率和發病率。通過阻斷幹細胞進入細胞周期從而使它們避免毒副作用這樣的可選擇的策略，可以意識到對接受化療或放療的病人的其他臨床益處。II.骨髓移植骨髓移植(BMT)對於各種血液病，自身免疫病和惡性疾病是一個有用的治療措施；目前的治療包括從臍帶血或外周血(未活化的或用例如G-CSF的藥劑活化的)以及骨髓獲得造血細胞。造血細胞的間接體內(ex vivo)操作目前被用於將初級幹細胞擴增成適於移植的群體。該方法的最適化要求(1)足夠數目的能夠維持長期造血重建的幹細胞；(2)抗宿主誘導的T淋巴細胞的移植物的排除；(3)殘存惡性細胞的缺失。該方法能夠用包括幹細胞抑制因子的間接體內擴增而被最優化。
為了清除殘留的惡性細胞而用細胞毒藥物淨化造血細胞的效果受到這些化合物對正常造血細胞，尤其是幹細胞的毒性的限制。這就需要在淨化過程中對正常細胞進行有效保護；保護作用可以通過使用有效的抑制因子使幹細胞脫離細胞周期而實現。III.收集外周幹細胞對於自體移植，外周血幹細胞(PBSC)具有許多超過骨髓的潛在優點。由於涉及腫瘤或以前接受放療而沒有合適的骨髓採集部位的病人仍然能進行外周血幹細胞收集。血幹細胞的應用很好地排除了全身麻醉及對不能耐受的病人進行外科手術的需要。收集血細胞所必需的單採血液成分(apheresis)技術是行之有效的而且在大多數醫療中心可以廣泛應用。該方法的主要限制是在用藥物或生長因子(例如環磷醯胺、G-CSF、幹細胞因子)活化後在外周血中幹細胞的低正常穩定狀態頻率和高細胞周期狀態。一種有效的幹細胞抑制因子對使細胞回到靜止狀態，從而防止它們在分化過程中丟失是有用的。IV.過度增殖性失調的治療許多疾病以過度增殖狀態為特徵，在該狀態中，異常調節的幹細胞引起終期細胞過度生成。這些疾病狀態包括，但不限於，有上皮細胞過度增生的銀屑病，以出現小腸息肉為特徵的胃腸道癌前狀態。幹細胞抑制因子對於治療這種情況的疾病是有用的。V.基因轉移將遺傳信息轉移到造血細胞的能力目前正被用於臨床。對於基因治療來說，造血細胞是最有用的靶，因為間接體內操作及處理這一組織時容易進行且有廣泛的經驗，而且血細胞能滲入組織。更進一步講，通過將有功能的基因插入到人的造血系統的初級幹細胞中，可以使人的某些遺傳缺陷得以糾正。
用逆轉錄病毒載體或基因轉移的物理技術將基因導入人的造血細胞中存在幾個限制(1)造血組織中的幹細胞頻數低，必須發展高效基因轉移技術；(2)周期越短的幹細胞對於載體的易感性就越高，但是通過用生長因子刺激幹細胞增殖導致感染率的增加對長期基因表達產生相反的效應。因為，含有轉基因的細胞被迫進行不可逆分化，並喪失它們的自我更新能力。這些問題能夠通過使用幹細胞抑制因子得以改善，從而防止分化和自我更新能力的喪失。
發明概述本發明涉及屬於幹細胞增殖抑制因子的多肽(「INPROL」)及其應用。
本發明包括以如下性質為特徵的幹細胞增殖抑制因子(a)在鼠脾集落形成(CFU-S)試驗中比活(IC50)小於或等於20ng/ml(見實施例4)，(b)分子量大於10,000，小於100,000道爾頓(通過超濾)，(c)活性對胰蛋白酶降解敏感，
(d)比MIP-1α和TGFβ更疏水且可通過反相層析與二者分離(見實施例12)，(e)在水溶液中，在37℃、55℃或75℃下加熱1小時後保留生物學活性，(f)用1％鹽酸丙酮沉澱後保留生物學活性。
本發明被進一步表徵，並通過在短期預培養(見實施例5)後在體外試驗中獲得抑制作用的能力將其與其他侯選幹細胞抑制因子(例如，MIP-1α、TGFβ和各種寡肽)區分開來。
本發明也包括含有治療各種疾病的INPROL的藥物組合物。
本發明提供一個通過施用有效量的幹細胞抑制組合物而治療預先暴露於能造成幹細胞死亡或損傷的藥劑的患者的治療方法。通過這種方法保護的幹細胞可能是通常在骨髓中存在或分裂的造血幹細胞。此外，幹細胞可能是位於例如小腸或頭皮或身體的其它部位的上皮細胞，或位於生殖器官的生殖細胞。雖然動物治療也在本方法的範圍內，但本發明的方法可以被合乎需要地應用於人類。作為在此處使用的術語，「患者」或「病人」涉及動物，比如哺乳動物，包括人。
在另一方面，本發明為保護和恢復經受化療的病人的造血、免疫或其它幹細胞系統提供了方法，其包括對病人施用有效劑量的INPROL。
另一方面，本發明涉及對任何癌症的輔助治療方法，其中包括以實體瘤為特徵的那些癌症，該方法是通過對患癌症的病人施用有效劑量的INPROL來保護骨髓、胃腸道及其它器官的幹細胞免受化療和放療的毒性作用而完成的。
本發明的另一方面還涉及白血病的治療，包括用有效劑量的INPROL處理含有增殖性白血病細胞的造血細胞，以抑制正常幹細胞的增殖，以及用能破壞白血病細胞的細胞毒藥劑處理骨髓。該方法可以通過隨後使用刺激骨髓增殖的其它藥劑(例如集落刺激因子)處理骨髓而提高療效。在一個具體實施方案中，該方法是在體內進行的。此外，該方法對間接體內淨化和擴增用於移植的造血細胞也是有用的。
另一方面，本方法涉及治療患有由幹細胞增殖引起的任何疾病的患者。這些疾病，如銀屑病、脊髓發育不良、一些自身免疫病、老年性免疫低下均可通過對患者施用有效劑量的INPROL部分抑制幹細胞的增殖而得到治療。
本發明提供了一種可逆性保護幹細胞免於可殺傷或損害幹細胞的細胞毒藥劑對其損傷的方法。該方法包括對預先暴露於這類藥劑的患者施用有效劑量的INPROL。
本發明也提供通過下述方法從豬或其它骨髓中(見實施例12)分離的幹細胞增殖抑制因子。
(a)提取骨髓，通過過濾去除顆粒狀物質，(b)56℃加熱處理40分鐘，隨後冰浴冷卻，(c)通過4℃，10000g離心30分鐘去除沉澱，(d)將上清加入10倍體積的攪拌的冰冷的丙酮(含1％體積濃鹽酸)，4℃，保溫16小時進行酸沉澱，(e)4℃，20,000g離心30分鐘分離沉澱，用冷丙酮洗，隨後乾燥，(f)通過反相層析分離，用5-氟尿嘧啶預處理並在鼠IL-3存在下培養的骨髓細胞抑制集落形成，以及通過280nm吸收和SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳來監測活性。
本發明也提供基本上不含其它蛋白類物質的幹細胞增殖抑制因子的純化方法，該方法包括上述步驟，將在下面詳述。
本發明也提供對人或動物的治療方法，其中所說的幹細胞增殖抑制因子能起到改善由於細胞過度增殖而引起的免疫抑制的作用。
本發明也提供對人或動物的治療方法，其中所述幹細胞增殖抑制因子的施用是在將幹細胞暴露於細胞毒藥劑或輻射而誘導增殖後進行的。幹細胞通常是處於靜止期，但化療後被激活而進入細胞周期。這意味著它們對第二次化療更敏感；本方法保護它們免於這種治療。
本發明也提供
對人或動物的治療方法，其中為了加強免疫應答，所述幹細胞增殖抑制因子可作為輔劑在接種前或與接種一起施用。
本發明也提供對接受細胞毒藥物或輻射治療的人或動物的治療方法，它包括施用有效劑量的幹細胞增殖抑制因子來保護幹細胞免於傷害。
本發明也包括一種藥物組合物，它包含血紅蛋白和藥用載體。
本發明也包括一種藥物組合物，它包含(a)選自血紅蛋白α鏈、β鏈、γ鏈、δ鏈、ε鏈和ζ鏈的多肽，和(b)一種藥用載體。這種藥物組合物可以由從上述物組中選出的帶有或不帶有血紅素的單一多肽，多肽混合物或二聚體或多聚體形式的多肽組成。
本發明也包括具有如下序列的多肽Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，其中的兩個半胱氨酸殘基形成一個二硫鍵Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，其中的兩個半胱氨酸通過一個碳橋相連，和Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala，本發明也包括編碼上述已確定的肽的DNA序列，含有所述DNA序列的載體和含有所述載體的宿主細胞。通過用標準化學技術(例如固相合成)或重組技術(例如融合系統，如那些使用穀胱甘肽-S-轉移酶(D.B.Smith and K.S.Johnson，Gene 6731-40，1988)，硫氧還蛋白(LaVallie et al.，Biotechnology 11187-193，1993)或泛素(Butt et al.，PNAS 862540-4，1989；US Patent 5,391,490)的融合系統)合成這些肽類。
此外，本發明還包括抑制幹細胞增殖的方法，它包括將造血細胞與一種能結合阿片受體(優選阿片受體的μ亞類)的化合物接觸。某些肽類(被稱為「hemorphin」)已從血紅蛋白中被分離得到，其表現出阿片樣的活性(例如Brantl et al.，Eur.J.Pharm，125309-10，1986；Davis et al.，Peptides 10747-51，1989；Karelin et al.，Bioch.Biophys.Res.Comm，202410-5，1994；Zhao et al，Ann.N.γ.Acad.Sci 750452-8，1995)。各篇文獻在此引入作為參考。
本發明還包括抑制幹細胞增殖的方法，它包括用選自具有下列序列的hemorphin肽與造血細胞接觸Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，Leu-Val-Val-Tyr-Pro，Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln， 和Tyr-Pro-Trp-Thr。
以上肽類與其它阿片樣肽類，如Tyr-MIF-1家族的一些肽類(見Reed et al.Neurosci.Biobehav.Rev.18519-25，1994 forreview)，酪蛋白衍生的酪嗎啡因(Brantl et al.，Hoppe-Seyler’sZ.Physiol.Chem.3601211-16，1979；Loukas et al.，Biochem.224567-4573，1983；Fiat and Jolles，Mol Cell.Biochem.875-30，1989)，細胞色素b衍生的，被命名為cytochrophins的肽類(Brantl et al.，Eur.J.Pharm.111293-4，1985)以及來自被篩選出結合阿片受體的組合文庫的肽類有序列相似性。(見Dooley et al.，Peptide Research 8124-137，1995 forreview)。各篇文獻在此引入作為參考。
本發明也包括抑制幹細胞增殖的方法，它包括將選自Tyr-MIF-1相關的肽類，酪嗎啡因和cytochrophins的一種肽與造血細胞接觸。特別包括具有這樣序列的Tyr-MIF-1肽類。
Tyr-Pro-Try-Gly-NH2，Tyr-Pro-Lys-Gly-NH2，Tyr-Pro-Leu-Gly-NH2，和
Pro-Leu-Gly-NH2。
本發明也包括在哺乳動物中實施基因治療的方法，它包括a)從所說的哺乳動物中分離出造血細胞，b)可選地，用至少一種刺激性細胞因子間接體內地處理所述造血細胞，以誘導幹細胞增殖，c)用預先確定的基因轉染所述造血細胞，d)用INPROL間接體內地接觸所述轉染的造血細胞，e)向哺乳動物移植步驟d的造血細胞，f)可選地，在體內用INPROL處理所述的哺乳動物。
本發明也包括間接體內進行幹細胞擴增的方法，它包括用INPROL和至少一種刺激性細胞因子處理所說的造血細胞。在與刺激性細胞因子作用前、作用過程中和/或作用後，INPROL與造血細胞作用。
本發明也包括一種藥物組合物，它包括(a)INPROL和(b)至少一種抑制性化合物，它選自MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、五肽pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys，四肽N-乙醯-Ser-Asp-Lys-Pro和三肽穀胱甘肽(Gly-Cys-γGlu)。
本發明還包括一種藥物組合物，它包括(a)INPROL和(b)至少一種選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、紅細胞生成素、血小板生成素、幹細胞因子和flk2/flt3配基的刺激性化合物。
本發明描述一種幹細胞抑制因子(INPROL)，它不同於本領域已知的細胞抑制因子，如MIP-1α、TGFβ、Frindel和其同事們的四肽、Paukovits和同事們的五肽(cf.，Wright Pragnell，1992(op.cit))。通過超濾測得天然存在的INPROL的分子量超過10,000道爾頓，該分子量不同於四肽以及五肽。在反相層析系統中它比MIP-1α或TGFβ更疏水，所以明顯不同於那些細胞因子。此外，它的作用方式不同於以前所述的任何一種抑制因子，當僅在預培養階段使用時，它在體外試驗中仍具有活性。例如，MIP-1α僅在預培養階段使用時活性喪失(實施例5)。此外，天然存在的INPROL在測定「高增殖潛能細胞」(HPP-PFC)試驗中是有活性的，而MIP-1α無活性(實施例6)。
附圖簡述圖1-4顯示各階段的純化產物的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。
圖1-第1泳道是糜蛋白酶原，第2泳道是卵白蛋白，第3泳道是牛血清白蛋白，第4泳道是分子量小於30kD的級分，第5泳道是分子量為30-50kD的級分，第6泳道是分子量為50-100kD的級分。
圖2-第1泳道是(40-80％)硫酸銨沉澱，第2-5泳道是DEAE級分(第2泳道代表活性級分)。
圖3-第1泳道是硫酸銨沉澱後的上清，第2泳道是DEAE活性級分，第3-5泳道是凝膠過濾級分(第5泳道代表活性級分)。
圖4-第2泳道代表終產物。
圖5-顯示最後純化作用的反相高壓液相層析。
圖6-顯示3H-胸苷摻入(CPM)FDCP-mix系的細胞中，不含(對照＝0％抑制)和含各種濃度從豬骨髓純化的INPROL(pINPROL)。數據相對對照值而歸一化。
圖7-顯示用丙酸睪酮(TSP)、TSP+pINPROL，或載體(對照)處理小鼠後在細胞周期的S期中的細胞百分數。每組含25隻動物(每個時間點3-4隻)。
圖8-顯示用兩劑量的5-FU處理小鼠，用或不用pINPROL處理小鼠後，小鼠的存活情況。每組含30隻動物。圖9-顯示用或不用pINPROL處理的受輻射小鼠的存活情況。每組含50隻動物。
圖10A和10B-顯示用Ara-c或Ara-c+pINPROL處理1周(10A)和3周(10B)後正常骨髓長期培養細胞的再生情況。
圖11-顯示用致死劑量照射並移植用培養基(對照)或含pINPROL(25ng/ml)培養基培養4小時後的3×104骨髓細胞的小鼠的存活情況(每組75隻)。對存活情況監測30天。
圖12-顯示用致死劑量照射後，小鼠骨髓細胞培養物14天後形成的CFU-GM數，和供體骨髓細胞用pINPROL或培養基預培養4小時後CFU-GM的恢復情況。
圖13-顯示每周取出的淋巴長期培養物的懸浮細胞，該培養物被清洗，在用培養基或pINPROL預培養4小時後用IL-7(10ng/ml)鋪板。
圖14-顯示用pINPROL處理的白血病外周血細胞改善的再聚集能力。
通過含和不含pINPROL平板的粘附和非粘附LTC細胞測定長期培養初始細胞(LTC-IC)，並在第7天計數CFU-GM。數據與對照值對比使之標準化。
圖15A-顯示在53％乙腈時洗脫的純pINPROL的C4反相層析。第1泳道是粗樣品，第2泳道是分子量標準，第3泳道是純化樣品。圖15B顯示在43.9％乙腈時洗脫的MIP-1α的C4反相層析。圖15C顯示pINPROL粗樣品和反相層析後純化樣品的SDS-PAGE譜圖。
圖16-顯示血紅蛋白序列圖16A顯示人α血紅蛋白的cDNA和胺基酸序列，圖16B顯示人β血紅蛋白的cDNA和胺基酸序列。根據胺基酸進行計數。圖16C顯示人、鼠、豬血紅蛋白的α、β鏈的胺基酸序列的比較。
圖17-顯示pINPROL的C4反相高壓液相色譜圖(圖17A)與晶化豬血紅蛋白的C4反相高壓液相色譜圖(圖17B)的比較。
圖18-顯示晶化豬血紅蛋白的C4反相高壓液相色譜級分的SDS-PAGE凝膠。第1泳道顯示標準分子量，第2泳道顯示來自第一個峰(在47.11分鐘)的級分48-49，第3泳道顯示來自第二個峰(在49.153分鐘)的級分50-51，第4泳道顯示來自第三個峰(在52.25分鐘)的級分54-55，第5泳道顯示來自第四個峰(在53.613分鐘)的級分56-57。
圖19-顯示pINPROL(圖19A)與純化的豬β血紅蛋白(圖19B)的二維凝膠電泳的比較。
圖20-顯示純化的豬α血紅蛋白、β血紅蛋白或pINPROL在FDCP-MIX分析中的作用的比較。
圖21-顯示用淺洗脫梯度反相分離豬血紅蛋白。
為了使本文描述的發明被更充分地理解，下面將對其進行詳述。這個描述，是本發明的實例，不能被認為是特別限制本發明，本領域技術人員知道的那些變化將被認為屬於本發明的範圍。優選實施方案詳述INPROL可逆性地抑制幹細胞分裂。具體地說，在暫時抑制造血幹細胞分裂上，INPROL是有效的。因此，本發明方法可被應用於減輕化療對病人的造血、骨髓和免疫系統的不希望有的副作用，這是通過保護幹細胞免於用於消滅癌細胞或病毒感染細胞的化療藥物或輻射所造成的損害而實現的。在本發明的一個實施方案中，給病人以足夠劑量的INPROL來抑制幹細胞分裂，而化療藥物作用於患病細胞。化療藥物起作用後，由INPROL抑制的幹細胞不需要進一步處理即可回復到分裂細胞。如果想要增強造血功能的再生，可另外使用刺激性生長因子或細胞因子。
此處使用的術語「INPROL」包括如在實施例中純化的哺乳動物蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白的α鏈(帶或不帶血紅素基團)、血紅蛋白的β鏈(帶或不帶血紅素基團)、α和β鏈的混合物(帶或不帶血紅素基團)、以及具有抑制幹細胞增殖能力的這些蛋白質的片段或類似物，包括胚胎形式，胎兒形式和成人形式(例如α、β、γ、δ、ε或ζ鏈，單獨存在或是混合物，二聚體或是多聚體，含有或是不含有血紅素基團)。術語「INPROL」包括天然存在以及非天然存在(例如重組產生的)形式的這些蛋白質。
在典型的臨床情況中，病人每天靜脈注射或輸注劑量單位形式的INPROL，所用劑量為例如0.01-100mg/kg，優選0.1-1.0mg/kg，在例如標準化療或放療前4-60小時前施用INPROL。
在本發明的另一實施方案中，用INPROL預先治療可以提高化療藥物或輻射劑量，使之超出患者能夠正常耐受的劑量範圍。
大部分造血幹細胞在正常情況下處於靜止期(不在細胞周期中)。然而作為對化療誘導的造血損傷的代償反應，化療後一大部分幹細胞進入細胞周期，這使之特別易受隨後的細胞毒化療或治療性放射劑量的損害。通過抑制這些幹細胞的細胞周期，INPROL治療允許更早或更頻繁地隨後施用細胞毒化療，不管是用常規劑量還是提高的劑量。
在本發明的一個實施方案中，初次劑量的化療約24小時到10天後施用INPROL(0.1mg～6g，優選1.0～60mg)。再過4-60小時，優選24～48小時後，實施另一劑量的化療。根據療效，持續進行化療和INPROL的交替循環。化療藥物和施用方案是根據適合在標準臨床實踐中的具體腫瘤類型而選擇的。可選地，在化療或放療後，為了進一步促進造血功能重建，使用激活性生長因子，如G-CSF、幹細胞因子。
對於間接體內應用，可使用0.1ng-100ng/106細胞/ml，優選20-50ng/106細胞/ml的INPROL。
在本發明的另一實施方案中，INPROL被用於製備用於移植的自體造血細胞。用有效量的INPROL間接體內處理造血細胞以抑制幹細胞分裂，然後，對骨髓培養物施用有效量的化療藥物或輻射以清除癌細胞。對進入細胞周期的細胞有專一性的化療藥物是優選的。這樣處理後的骨髓被再輸入自身供體。任選地，用一種已知刺激造血的藥物治療病人以促進病人造血功能的重建。
在本發明的另一實施方案中，INPROL被用於治療白血病時的輔助性治療。例如，在白血病細胞不響應INPROL的疾病狀態中，用INPROL間接體內處理白血病造血幹細胞。正常幹細胞的增殖通過施用INPROL而被阻止。因此，在這期間用一個細胞周期特異性的細胞毒藥物處理增殖的白血病細胞，防止了正常幹細胞群的損傷。此外，在藥物或輻射治療過程中，選擇性地使用刺激性細胞因子如IL-3或GM-CSF，誘導白血病細胞進入細胞周期而正常幹細胞被所用的INPROL保護。用化療藥物或輻射治療病人以消滅白血病細胞，然後將淨化的骨髓移植給病人以進行造血功能的重建。
同樣地，在另一個治療嚴重病毒感染血細胞或淋巴細胞如HIV感染病人的實施方案中，造血細胞間接體內地用INPROL處理，隨後用抗病毒藥物，消滅感染細胞的藥物或基於抗體的系統清除感染細胞。隨後用成髓(myeloablative)抗病毒劑或成髓化療根除病人的病毒宿主細胞，將INPROL處理的骨髓細胞回輸給病人。
INPROL被用於治療與幹細胞過度增殖有關的疾病。例如，銀屑病是一種由皮膚上皮細胞過度增殖引起的疾病，有時用細胞毒藥物治療。其它涉及幹細胞增殖的前瘤的損害也適合用有效劑量的INPROL，它被用於完全或部分抑制幹細胞的增殖。對於這些應用，含有INPROL的局部或透過皮膚傳遞的組合物(例如油膏、洗液、凝膠或貼膏)被用於合適的部位，作為腸道用藥的替代。在大多數白血病中，白血病祖細胞(leukemia progenitor)是分化的細胞群，它不受INPROL的影響，因此，可用上述的使用INPROL的方法治療。在白血病祖細胞是非常初級的，並且對INPROL的抑制非常敏感的情況下，可以通過施用有效劑量的INPROL使白血病細胞的增殖減弱。
用標準技術對INPROL多肽產生單克隆或多克隆抗體。用在本領域中已知的許多可檢測的標記物標記這些抗體或INPROL多肽。通過以診斷目的直接將其施用給患者，這些標記的INPROL或抗INPROL抗體作為幹細胞的標誌被用於鑑定和分離幹細胞。此外，這些標記的多肽或抗體間接體內地被用於鑑定造血細胞製備物中的幹細胞，從而在淨化骨髓中的前瘤細胞時能夠去除這些幹細胞。用相似的方式，這些標記的多肽或抗體被用於鑑定和分離上皮幹細胞或其它幹細胞。此外，這些標記的或未標記的抗體，可以通過中和INPROL活性而治療性地應用或通過檢測循環的(circulating)INPROL的水平而診斷性地應用。
INPROL能用標準技術從人基因或表達重組的人INPROL的cDNA文庫中克隆。例如，用從純化蛋白中獲得的序列信息，構建能被標記(例如用32P標記)的寡核苷酸探針，用它來篩選合適的cDNA文庫(例如來自骨髓)。可選地，用抗體或合適的功能分析方法(例如實施例2所述)從合適的來源(例如骨髓)中篩選編碼INPROL的cDNA表達文庫。血紅蛋白本身，以及單獨的α，β鏈，已經用在本領域中已知的方法克隆並表達(見Pagnier et al.，Rev.Fr.Transfus.Hemobiol.35407-15，1992；Looker et al.，Nature 356258-60，1992；Methods in Enzymology Vol.231，1994)。各篇文章在此引入作為參考。
本發明包括這樣的DNA序列，它包括引入用於選定的非哺乳類宿主表達的「優選」密碼子；提供限制性內切酶的切割位點；提供附加的起始、終止或調節DNA序列，該序列有利於構建適於表達載體或產生或純化血紅蛋白的α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈。
本發明也提供編碼血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的多肽類似物或衍生物的DNA序列，這些序列從一個或更多胺基酸殘基的相同性或其位置來說不同於天然型(即缺失型類似物含有少於所有特定殘基的殘基；替代型類似物的一個或更多的特異殘基被其它殘基取代；添加型類似物中有一個或更多的胺基酸殘基被加到多肽的末端或中間部分)，但它具有天然型的部分或所有的性質。
在優選的實施方案中，INPROL是通過基因組或cDNA克隆或通過基因合成得到的外源DNA序列在原核或真核宿主中表達的表達產物(例如通過培養的細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳類細胞)。即，在優選的實施方案中，INPROL是「重組的INPROL」。在典型的酵母(例如釀酒酵母)或原核(例如大腸桿菌)宿主細胞中的表達產物與任何哺乳類的蛋白無關，在脊椎動物細胞中的表達產物(例如非人類的哺乳類(例如COS或CHO)和鳥類)與任何人類蛋白無關。根據所採用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本發明的多肽也可任選地包括起始的甲硫氨酸殘基(在第一位)。
本發明也包含如血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的多肽類似物的其它產物。這些類似物包括血紅蛋白的α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的片段。根據已知方法，人們能容易地設計和製造編碼適合多肽的微生物表達的基因，這些多肽的一級序列不同於本文從一個或更多殘基的相同性或其位置來具體說明的多肽(例如替代、末端和中間添加及缺失)。通過熟知的定點突變技術很容易地完成cDNA和基因組基因的修飾，並用於產生血紅蛋白α、β、γ、δ、ε或ζ鏈的類似物和衍生物。此類產物至少具有INPROL的生物學活性之一，但在其它方面可能不同。例如，本發明的產物包括α、β、γ、δ、ε或ζ鏈，它們通過缺失被縮短；或它們對水解更穩定(因此，可能比天然型有更明顯或長期的效應)；或它們已被改變為缺失或加入一個或更多個潛在O-糖基化和/或N-糖基化位點，或它們有一個或更多的半胱氨酸殘基缺失或被丙氨酸、絲氨酸殘基取代，而且從微生物系統中更容易以活性的形式被分離；或者它們有一個或更多的酪氨酸殘基被苯丙氨酸取代而且或多或少易與靶蛋白結合或靶細胞的受體結合。也包括的是只複製一部分連續的胺基酸序列的多肽片段或者在α、β、γ、δ、ε或ζ鏈內的二級結構，這些片段可能具有INPROL的一個特性(例如結合抗體)，沒有其它特性(例如幹細胞抑制活性)。值得注意的是，為了使本發明的任何一個或多個產物有治療用途或其它用途(如抑制因子拮抗作用的檢測)，這些產物的活性不是必需的(見Weiland et al.，Blut 44173-5，1982)。在幹細胞抑制因子或其受體過度產生的情況下，競爭性拮抗劑是有用的。
此外，源於保留了生物學活性的蛋白序列的多肽可以用標準的方法化學合成。本發明也提供編碼血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ鏈的多肽類似物或衍生物序列，從一個或更多胺基酸殘基的相同性或其位置來說，這些多肽類似物或衍生物不同於天然型(例如缺失型類似物含有少於所有特定殘基的殘基；替代型類似物，其中一個或更多的特定殘基被其它殘基取代；無論是天然存在還是在本領域中已知的其它類似物如D-胺基酸；添加型類似物，其中一個或更多的胺基酸殘基被化學修飾以增加穩定性、可溶性和/或抗蛋白水解性)，但它們具有天然型的一些或所有的性質。
通過不同方法能夠鑑定以上所述的肽序列。天然血紅蛋白活性鏈(例如α鏈)的三維結構與結構相關的無活性蛋白(例如肌紅蛋白)的比較能夠鑑別出在三維空間中具有不同構象的區域，這些區域是活性肽類的候選區域。另一方法用選擇性的蛋白水解，在此方法中，用蛋白水解酶有限地消化血紅蛋白的鏈產生可分離(例如通過反相高壓液相色譜，然後對幹細胞抑制進行分析)的肽類，通過化學合成也可產生肽類(例如固相合成)；一系列包含感興趣的血紅蛋白鏈序列(例如α鏈)的重複肽類(例如15聚體)能非常容易地產生並在幹細胞分析中被檢測。通過多步化學合成能產生組合文庫，並且選擇的胺基酸位置是可變化的，導致有許多肽類似物有待於篩選(例如Dooley et al.，Peptide Research 8124-137，1995)。另外，可以應用重組方法，用直接點突變鑑定特定血紅蛋白鏈的活性所必需的重要殘基。被認為具有幹細胞抑制因子活性區域的鏈(例如α鏈)能夠被來自相關但無活性的蛋白(例如肌紅蛋白)的區域所替換，並在幹細胞活性分析中檢測，以鑑定活性必需區。這樣鑑定的區域能夠被作為肽類表達並在幹細胞周期分析中檢測活性。
來自其它種系的同源或類似形式的INPROL被用於獸醫的不同方面，類似於上面所述的本發明的治療實施方案。
INPROL通過使細胞可逆性地處在非分裂的「靜止狀態」而作用於細胞周期幹細胞。當需要刺激靜止期的幹細胞進入分裂期時(例如在用癌症化療藥物或輻射治療病人後)給病人施用集落刺激因子和其它造血刺激物。這些因子包括但不限於M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF、巨核細胞-集落刺激因子、血小板生成素、幹細胞因子或其它細胞因子如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14或紅細胞生成素。
通過常規的化學方法並結合適當的對幹細胞抑制活性的生物分析，純化或合成了有幹細胞抑制活性的INPROL多肽或活性片段，示例見下文描述的方案。
在本發明的實施方案中，治療有效量的INPROL蛋白或其治療有效片段與藥用載體混合使用。這種INPROL組合物一般通過腸胃外注射或輸注給藥。根據要達到的治療效果可以選用皮下注射、靜脈內注射或肌肉內注射。
當全身性地施用時，用於本發明的治療組合物是以無致熱原，腸道可吸收的水溶液形式存在。具有一定pH值、等滲性、穩定性、載體蛋白等等的藥用無菌蛋白溶液，是本領域技術人員熟知的。
本發明還包括藥物組合物，其包含本發明的多肽產物與合適的稀釋劑、保護劑、增溶劑、乳化劑、輔助劑和/或在INPROL治療中有用的載體。這裡使用的「治療有效量」是指對給定情況和實施範圍提供治療效果的劑量。這樣的組合物是液體、凝膠、油膏或凍幹的或其它的幹製劑，而且包括各種緩衝成分的稀釋劑(例如Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH值和離子強度、添加劑，如防止表面吸附的白蛋白或明膠、去汙劑(例如吐溫20、吐溫80、Pluronic F68、膽酸鹽)、增溶劑(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、保護劑(例如硫抑汞、苯乙醇、對羥苯甲酸酯)、填充劑或滲透壓修飾劑(例如乳糖、甘露糖醇)、共價多聚附著物如聚乙二醇與蛋白質，與金屬離子形成的絡合物，或將這些物質摻入多聚化合物(例如多聚乳酸、多聚乙醇酸、水凝膠等)顆粒製劑內部或表面，或摻入脂質體、niosome、微乳糜顆粒、分子團、單層或多層囊泡、可注射的生物降解膠囊或微球，或蛋白基質、血影、原生質球、皮膚附貼膏或其它已知釋放或包裝藥物的方法。這些組合物將影響INPROL的物理狀態、溶解性、穩定性、體內釋放率和體內的清除率。可控的或緩釋的組合物包括親脂性容納物(例如脂肪酸、臘、油)的製劑。本發明也包括用多聚物(例如poloxamers或poloxamine)包裹的顆粒組合物及與抗組織特異性受體、配基或抗原偶聯或與組織特異性受體的配基偶聯的INPROL。本發明組合物的其它實施方案涉及保護性包衣的顆粒形式、蛋白酶抑制因子或各種途徑用藥(包括腸道、肺吸入、鼻、局部(皮膚或黏膜)和口腔)的滲透增加劑。在另一實施方案中，含有INPROL的組合物被局部施用，或通過透皮的貼膏使用。
在一實施方案中，本發明的組合物以劑量單位形式封裝於無菌小瓶或安瓿中。
本發明也包括這樣的組合物，其包含一種或更多的附加因子如化療藥物(例如5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環磷醯胺、順氯氨鉑、卡鉑阿黴素、doxyrubicin、鬼臼亞乙苷、紫杉酚、烷化劑)，抗病毒藥物(例如疊氮胸苷、無環鳥苷)，腫瘤壞死因子，細胞因子(例如白細胞介素)，抗增殖藥物，抗代謝藥物，幹擾DNA代謝的藥物。
對於治療預先暴露某種細胞毒藥物的病人或治療幹細胞過度增殖的方法中涉及的劑量方案由主治醫生確定，要考慮各種改變藥物作用的因素，例如患者病情、體重、性別、飲食，各種感染的嚴重性，給藥的時間，以及其它臨床因素。
病人暴露於細胞毒藥物或輻射後，本發明的治療方法可任選地給病人施用一種或多種淋巴因子、集落刺激因子或其它細胞因子、血細胞生成素、幹擾素或生長因子，以全面刺激由先前使用INPROL治療而被抑制的幹細胞(和其子細胞)的生長和分裂。促進造血的治療性藥物包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、Meg-CSF、M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF或紅細胞生成素。這些藥物的劑量是根據它們在臨床試驗中對化療或幹細胞移植後促進造血重建的療效中獲得的知識來選擇的。這些劑量將根據病人的身體狀況、化療藥的劑量和類型或病人受到的輻射劑量和類型的變化而調整。對接受治療的病人施用INPROL引起的幹細胞抑制的反向進程通過常規方法加以監測。
在白血病的治療中，在用細胞毒藥物治療或輻射治療中同時施用抑制正常幹細胞周期的INPROL和白血病細胞生長的刺激物(如IL-3或GM-CSF)，是有益處的。通過這個方案，在正常細胞及白血病細胞的細胞周期狀態之間和藥物敏感性之間可能達到最大的差異。
實施例1體內幹細胞增殖抑制分析為了測定幹細胞的增殖，通過3H-TdR「自殺法」測定細胞周期S期的CFU-S數目(Becker et al.，Blood 26296-308，1965)。
在靜脈內注射造血細胞後8-12天，通過受到致死劑量照射的小鼠脾中形成的宏觀集落，能夠在體內檢測未成熟的造血祖細胞-脾臟集落形成單位(CFU-S)(Till McCulloch 1961)。
對於標準CFU-S增殖檢測分析，通常採用3H-TdR「自殺法」(Becker et al.，1965)。該方法基於DNA合成過程中放射性標記的胸腺嘧啶(3H-TdR)作為合成DNA前體物質摻入細胞內。在檢測時處於細胞周期S期的CFU-S被高放射活性殺死，因此在脾臟中不能形成集落。那麼，通過注射與3H-TdR共同培養的細胞樣品和無3H-TdR共同培養的細胞樣品所形成的CFU-S數之間的差異表明初始樣品增殖CFU-S的百分數。
就抑制因子來說僅影響進入細胞周期的CFU-S，它在正常小鼠骨髓中低於總CFU-S群的7-10％。用未刺激動物的骨髓幹細胞群不能進行抑制因子實驗。
為了刺激CFU-S增殖，採用苯肼(PHZ)或亞致死劑量的輻射(Lord，1976)。
根據睪酮丙酸化物(TSP)對CFU-S細胞周期的刺激效應(Byron et al.，Nature.2281204，1970)我們建立了使用TSP的方法，它簡化了測定及不引起任何副作用。TSP誘導CFU-S增殖的刺激作用在注射後20～24小時出現，這種效應至少7天內均可觀察到。
純化抑制因子過程中所用篩選級分的方法如下小鼠、BDF1或CBF1小鼠系被用於全部實驗。
為了誘導30-35％的CFU-S進入S期，供體小鼠按10mg/100kg劑量的TSP腹腔注射0.2ml/只鼠。24小時後取股骨骨髓製備細胞懸液。然後以5～10×107/ml細胞與不同對照和實驗組分在37℃水浴中培養3.5小時。每組2管(一管用於熱實驗(有放射性)和一管冷實驗(非放射性))。
3.5小時後，3H-TdR(1毫居裡/毫升、比活18-25居裡/毫摩爾)加入熱實驗管中以每毫升細胞懸液中加入200μl體積的3H-TdR；冷實驗管中什麼也不加，在37℃連續培養30分鐘以上。
培養30分鐘後，加入10ml冷(4℃)培養基含400μg/ml非放射性胸腺嘧啶終止殺傷反應。細胞粗略洗滌(3次)，重懸細胞並稀釋至注射所用的理想濃度，通常為2-4×104細胞/只小鼠，用0.3-0.5ml。
受體小鼠每組8-10隻，注射細胞前6小時照射，不能遲於6小時。
在第9-12天取受體小鼠脾臟，用Tellesnitsky’s液固定，通過目測計數脾結節。S期細胞的百分數用公式計算%S=a-ba(100%)]]>其中a-沒有用3H-TdR的CFU-S數b-用3H-TdR的CFU-S數提供在表1中的INPROL的實驗數據表明，用INPROL處理後的細胞周期幹細胞對3H-TdR有抗性反應。對這個及以下所有的實施例，術語pINPROL是指從豬骨髓中純化的蛋白。對S期特異細胞毒藥物阿糖胞苷、羥基脲(數據未顯示)也看到了相同的保護作用。如果處理的幹細胞用含非放射性胸腺嘧啶的冷培養基洗滌，在小鼠脾臟中存活幹細胞增殖正常地形成集落。
表1pINPROL與骨髓細胞培養4小時期間對CFU-S增殖的抑制活性
*每2×104細胞的CFU-S實施例2 體外幹細胞增殖抑制分析應用下面的檢測系統(Lord et al.，The Inhibitors ofHematopoiesis，pp.227-239，1987)顯示了INPROL的直接效應。多系因子(IL-3)依賴細胞系FDCP mixA4(A4)，維持培養在IMDM培養基中，其中含20％馬血清和10％WEHI-3條件培養基作為集落刺激IL-3的來源。
用3H-TdR摻入分析檢測增殖A4細胞(5×104在100μl培養基中，其中含20％馬血清和50％的WEHI-3條件培養上清)在37℃，5％CO2中培養16小時。
開始加入INPROL或粗製的BME(骨髓提取物)(組分IV)，然後向每組加入3H-TdR(3.7KBq in 50μl at 740GBq/mmol)再繼續培養3小時。通過收穫細胞和用下列公式計算抑制百分率測定增殖率。
在正常骨髓提取物式pINPROL的階段劑量存在下生長的FDCPmix-A4細胞摻入3H-TdR被顯示在圖6，結果顯示純化的pINPROL組分至少此初始材料活性高1000倍。對於有效抑制來說，暴露時間(16小時)是一個重要因素並顯示pINPROL對幹細胞A4細胞系的直接效應。實施例3 體內注射INPROL導致CFU-S增殖抑制劑量和作用持續時間體內注射INPROL的作用研究表明INPROL能有效地阻斷CFU-S的募集進入細胞周期。因而，保護這些細胞免於進一步治療時的細胞毒效應。顯示出其臨床潛在應用價值。
本實驗方案有兩個目的體內注射時檢查INPROL對CFU-S的效應及確定涉及細胞周期幹細胞的INPROL活性的有效持續時間。
為了刺激CFU-S增殖，根據在例1中所提到的效應，注射睪酮丙酸化物(TSP)。
在0天BDF1小鼠注射TSP(10mg/100g)，24小時後，每個實驗組(4隻/每組)的小鼠腹腔內一次性注射pINPROL 0μg、5μg、10μg和15μg/小鼠。
pINPROL注射後24小時，殺死小鼠按例1所述的分析方法測定進入細胞周期CFU-S的百分數。與未處理小鼠7％的細胞周期CFU-S相比TSP注射誘導大約50％的CFU-S進入細胞周期。pINPROL在劑量低於2μg/只鼠時就能抑制由TSP誘導的增殖作用低於正常水平。
對於效應持續時間的評價，一組小鼠(每組21隻)只注射TSP，而另一組注射TSP和pINPROL(TSP注射後24h)一周內每24小時從每組中取出3隻小鼠按描述的方法(例1)測定進入周期的CFU-S及測定骨髓中CFU-S周期狀態。圖7提供的資料表明，TSP的效應持續時間至少7天。單次注射INPROL能使CFU-S進入靜止期並使它們脫離細胞周期不超過48-72小時。由於大多數用於癌症和白血病化療的藥物在體內有相當短的半衰期通常小於24小時。根據已獲得的資料INPROL在體內的效應要比化療藥物如阿糖胞苷或羥基脲在體內具有活性的有效時間長，更重要地，由於在第一次化療和放療(對幹細胞無損傷)與第二次治療(對CFU-S損傷)之間有一個較長的間隔(長於24小時，短於96小時)在兩次應用化療藥物和放射之間的間隔期內，單次注射INPROL就足夠了。對於幾個重複周期的細胞毒治療或輻射治療、根據INPROL效應的持續時間採用相同的策略。實施例4INPROL保護用5-FU處理後立即被刺激進入細胞周期的大多數初級造血幹細胞免於暴露於第二次5-FU5-FU能急劇減少骨髓池和淋巴池中的細胞數目。它通常被認為是細胞周期特異性的，把迅速增殖的細胞作為靶，因為在細胞周期的S期或導致細胞死亡前，核苷酸的類似物摻入到DNA上。單次劑量的5-FU不影響小鼠骨髓的長期存活及免疫造血重建。然而，實驗表明(Harrison et al.，Blood 781237-1240，1991)多潛能造血幹細胞(PHSC)在5-FU首次劑量後3-5天短暫的期間變得易受第二次劑量5-FU的損傷。它被解釋為正常情況下PHSC進入細胞周期太慢，以致對單次劑量的5-FU是無效的，而且由於初次5-FU的處理所造成的刺激使PHSC迅速進入細胞同期循環。我們已經提出用INPROL能使PHSC返回到慢細胞周期狀態，由此保護PHSC不受第二次5-FU治療的損傷。
用於這些實驗的小鼠是雄性BDF1小鼠。5-FU貯存液用生理鹽水配製10mg/ml。在實驗的第0天每隻處理小鼠通過尾靜脈接受5-FU 2mg/10g體重；24小時後腹腔內注射pINPROL(10μg/100g體重)，在第3天給小鼠第二次注射5-FU，通過監測實驗組(用pINPROL治療)和對照組中的小鼠死亡進行存活研究，每組30隻小鼠，存活曲線見圖8。實施例5 INPROL與MIP-1α在骨髓細胞預培養中的作用本實驗的目的是比較在體外用pINPROL和MIP-1α對小鼠骨髓細胞預培養的抑制效應。
採用下面的方法體內6-15周齡BDF1小鼠，在從股骨收集骨髓前48小時在腹腔內注射5-FU，200mg/kg體重。
體外計數一個細胞合併懸液，總量2ml含5×106細胞，含或不含pINPROL或MIP-1α，含5％馬血清，加L-穀氨醯胺的IMDM培養基，在37℃，5％CO2培養4小時，然後將細胞洗2次，重新計數，按以下最終濃度細胞鋪制甲基纖維素平板。
0.8％甲基纖維素25％馬血清20ng/ml鼠重組IL-3L-穀氨醯胺5×105細胞/mlIMDM培養基平板在37℃、5％CO2、100％溼度培養11天，計數50個細胞以上的集落。
表2組別 集落數 對照百分比對照 31.0100％pINPROL 21.25 68.5％MIP-1α 35.25 114％實施例6INPROL抑制HPP-CFC的增殖用於評價鼠重建幹細胞和早期祖細胞的一個體外分析方法是高增殖潛能集落(HPP-PFC)分析。其它相關分析方法，例如CFU-A、CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM，進行性地檢測有限的祖細胞群(M.Moore，Blood 1772122-2128，1991)。這個例子顯示用pINPROL預處理細胞抑制它們增殖，然而，在這些條件下MIP-1α卻無此作用。
用5-FU(200mg/kg，腹腔注射)處理BDF1小鼠，然後分析HPP-CFC數。通過離心洗細胞調濃度為1～5×106/ml。培養液中加入 pINPROL(25ng/ml)或者MIP-1α(200ng/ml)對照不加藥物，培養細胞4小時，培養後，洗細胞並鋪制瓊脂平板(0.3％)含30％胎牛血清和來自5637和WEHI-3B細胞系的聯合條件培養基(7.5％每種條件培養基由Sharp et al 1991推薦)在60mm平皿中鋪制平板濃度為5×104細胞/ml，第14天計數集落結果表示如下表3組別 HPP-CFU 對照的百分比(％)對照組15.5±1.2 100％pINPROL 8.3±0.7 53.5％MIP-1α 15.8±0.9 101％根據這些結果，MIP-1α僅在預培養期存在時不抑制大多數未成熟祖細胞的增殖。在這些條件下，pINPROL確實能有效地抑制增殖。表明pINPROL和MIP-1α之間在生物學活性方面存在根本差異。實施例7 INPROL對恢復輻射誘導骨髓再生障礙的治療作用骨髓再生障礙是癌症放射治療的基本限制毒性。一些生長因子(例如G-CSF、GM-CSF，紅細胞生成素)已經被證明能加速因輻射導致骨髓衰竭的恢復。通過應用幹細胞增殖抑制因子起保護作用的概念是在處理造血損傷中的一個不同和互補的方法。按照早期建立的治療方法(實施例3、4)一個致死劑量照射的小鼠模型被建立。在該領域中眾所周知，接受9Gy鈷-60照射的小鼠10-14天後開始死亡。到第30天死亡率大約50％。這個致死劑量被用於我們的模型，方法是把它分成兩次相繼的4.5Gy照射，中間間隔3天。初步數據表明，在那個模型中的存活曲線與單次用9Gy照射的存活曲線非常接近。然而，對CFU-S增殖的實驗表明，首次照射後24小時，35-50％的CFU-S被誘導增殖。第二次劑量照射前給予幹細胞抑制因子能保護這種細胞。
為了檢測這種可能性，在第0天小鼠(50隻鼠/組)接受4.5Gy照射。24小時後，一組小鼠接受pINPROL(2μg/只鼠，腹腔注射)，而另一組對照組注射生理鹽水。在第3天給予第二次劑量照射(4.5Gy)。
圖9表明，單次劑量pINPROL後提高了存活。這種模型的條件對治療任何癌症與臨床密切相關。包括以實體瘤為特徵的腫瘤。對患有癌症病人實施這種治療是在兩個連續照射劑量之間給予一個有效劑量的INPROL。因此，對癌症的治療允許使用較大劑量的輻射。把這種模式擴展到化療藥物也是可能的。實施例8 INPROL被用於自體骨髓移植骨髓移植僅是已知對幾種白血病有效治療的方法(CML、AML和其它)。對於回輸自體骨髓的內外條件將提供無白血病細胞汙染的正常幹細胞以及能夠再集居於受體造血系統並有攻擊性和有效治療的潛在自體源源。
1.長期骨髓培養L1210白血病模型對INPROL在阿糖胞苷淨化期間保護造血作用的研究根據TcksoZ等(Blood 55931-936，1980)建立的長期骨髓培養及白血病細胞系L1210，它通過2周的共培養適合長期骨髓培養。正常和白血病祖細胞同時生長出現在這些LTBMC/L1210聯合培養基中與白血病病人的骨髓中的情況相似。通過在含有或不含WEHI-3的條件培養基(鼠IL-3產生細胞系)上生長的瓊脂集落能區分正常集落形成單位(CFU)和白血病的集落形成單位。正常細胞在缺乏IL-3時進行凋亡，而白血病細胞在缺乏IL-3時能形成集落。來自LTBMC-L1210成分的懸浮細胞在IL-3存在下產生大約150個集落(正常造血集落)而當生長在沒有IL-3(白血病集落)每50,000細胞制板的情況產生70個集落。
淨化方法如下在第0天從含LTBMC-L1210的培養瓶中去掉懸浮細胞和培養基(Tsyrlova et al in LeukemiaAdvames inBiology and therapy v35.1988)換成2ml含200μg阿糖胞苷(AraC)的培養基。培養20小時後，用培養液洗去含AraC的原培養液並換成2ml新鮮培養敷對照組)或含25ng/ml終濃度的pINPROL的培養基培養4小時。這次預培養後，細胞被再次用含100μg/瓶阿糖胞苷的培養基在37℃培養3小時，每組4瓶，LTBMC-L1210培養物被洗3次並換用新鮮的LTBC培養基，繼續培養3-4周作為再生研究。
圖10所示資料，僅用阿糖胞苷處理的對照培養基中沒有細胞生長，而在INPROL保護的培養瓶中由於來自貼壁層祖細胞的增殖造血的再生出現極快。然而，來自實驗組的細胞鋪在只含有IL-3的瓊脂板上生長出大約100個CFU(集落形成單位)每50,000個細胞，至少在4周培養期間沒有發現白血病細胞生長。因此，用有效劑量的阿糖胞苷結合INPROL在體內外處理骨髓能清除癌細胞而幹細胞被受到保護。有可能把該模式擴展應用到其它形式的化療和放射治療中。
2.離體條件下通過INPROL處理提高骨髓再集居能力(MRA)和30天輻射防護作用骨髓再集居能力(MRA)，是指細胞重新集居於致死劑量照射小鼠骨髓的能力以及授予30天輻射防護的能力。是一個在體內直接測定造血抑制動物的潛在恢復能力(Visser et al Blood Cells14369-384，1988)。
對於輻射防護研究，BDF1小鼠被照射9.5Gy通過移植睪酮刺激的供體小鼠骨髓而恢復。一組受體小鼠通過用培養基預培養4小時的骨髓細胞而恢復(對照組-A組)，另一組(B組)通過用含25ng/mlpINPROL的培養基預培養4小時的骨髓細胞而恢復。兩組細胞洗滌後以每隻小鼠30,000細胞移植給被照射的動物。存活資料見圖11。三次實驗的總和以正常對照組為100％被描述。到第30天pINPROL培養增加小鼠的存活率從對照組的36.5％升至61.8％。
通過用INPROL預培養誘導的MRA增加可能是提高輻射防護作用機制之一。為了驗證這一假說，根據Visser等(op.cit)方法測定了MRA。簡述如下，供體小鼠用睪酮預處理，它們的骨髓用培養基或含pINPROL的培養基預培養4小時，然後注射給被照射的動物。在第13天取受體股骨的骨髓細胞以三個不同濃度(0.01、0.05和0.1相當於一個股骨)在含有20％馬血清、10％WEHI條件培養中鋪制瓊脂平板、第7天的細胞集落數代表MRA，就當時受體骨髓中的集落形成而言是供體的未成熟幹細胞的祖細胞。
如圖12所見，用INPROL預培養細胞的MRA比對照組多(B)。實施例9 INPROL對幹細胞的抗過度增殖效應能改變它們的分化異常CFU-S的過度增殖不僅在細胞毒藥物或放射後恢復期可見，而且也作為正常老齡化的結果。並且被認為是脊髓發育不良綜合症的一個主要特徵，它伴隨分化障礙。例如，紅系分化佔優勢而沿粒系途徑的分化被減弱。
骨髓細胞用含25ng/ml pINPROL的培養基或培養基(對照組)在37℃培養4小時，洗滌細胞，然後用含20％馬血清，2U/ml紅細胞生成素和10％WEHI條件培養基鋪制瓊脂平板，在第7天計數BFU-E和GM-CFU集落數。表4中總結了三次實驗的資料，每組每個點4隻動物，鋪制4個平皿。
由表4可見，來自用INPROL未受傷害的年青動物(BDF1小鼠8-12周齡)的正常骨髓培養不改變各種類型集落的數目或比例。用睪酮-propinate(TSP)預先處理的BDF1供體顯示與以前(例1、3、4)所見的CFU-S增殖-樣的增加，在紅系祖細胞數目上(BFU-E集落)稍有增加，GM-CFU下降，通過用INPROL預培養這些改變將全部被消除。此外，異常高水平的CFU-S增殖返回到在細胞周期S期中CFU-S的10％。CFU-S過度增殖已知是一些種系小鼠易感於病毒白血病的一個特徵，例如，Balb/c小鼠(表4)及在老齡鼠中均能觀察到這現象。在TSP處理的BDF1小鼠中所見的定型祖細胞的同樣再分布在Balb/c鼠和老齡(23-25月齡)BDF1鼠中被觀察，它們具有共同的異常高水平的CFU-S增殖。通過用INPROL預培養糾正CFU-S的增殖和分化。什麼與臨床更密切，研究表明體內注射INPROL(2μg/只小鼠)影響CFU-S的增殖及紅系(BFU-E)和GM集落的比率(表4)。
表4INPROL對CFU-S分化成定型祖細胞BFU-E和CFU-GM的影響骨髓供體 pINPROL3H-TdR殺傷 BFU-ECFU-GMCFU-S百分數年輕BDF1- 12.0±0.328.33±1.9146.22±3.44+ 15.0±1.322.00±3.7447.70±3.72老齡BDF1- 47.1±1.943.75±1.5424.0±1.33+ 11.4±0.715.25±1.4544.0±7.63TSP刺激的 - 53.2±1.632.67±2.4415.71±2.28BDF1+ 7.2±0.4 12.00±1.8335.50±1.4Balb/c - 57.0±1.947.86±2.9633.57±3.45+ 23.0±2.424.86±2.5370.60±4.96實施例10 INPROL的免疫刺激活性已經觀察到含有高比例增殖的CFU-S與INPROL一起培養不僅改變了CFU-S的細胞周期而且也改變了它們的分化。改變了佔優勢的紅系分化以有利於粒系祖細胞和淋巴系祖細胞的分化。由於細胞毒化療或放療的免疫抑制副作用以及免疫抑制伴隨過度增殖幹細胞失調和衰老，INPROL這一特性具有重要作用。
本實施例顯示了INPROL對來自根據Wittlock和Witt(Ann.Rev.Immun.3213-35，1985)建立的淋巴系長期培養(LLTC)未成熟前體細胞分化成前B細胞的直接效應通過在含IL-7的甲基纖維素中形成集落測定這種效應。
按所述方法建立LLTC並用新鮮LLTC培養基(Terry FoxLabs.，Vancouver，Canada)飼養一周兩次。每周收集一次非貼壁細胞、洗滌、用含25ng/ml plNPROL培養基或培養基本身作對照培養4小時，培養後洗滌細胞，以105細胞/ml甲基纖維素含30％胎牛血清和10ng/ml的IL-7鋪制平板。圖13顯示三周的數據。在對照組中大的前B細胞集落的數目變化隨時間的增加而增加，但用INPROL預培養總是刺激集落的生長高於對照水平4-8倍。這表明INPROL的免疫刺激特性。這可應用在糾正免疫缺陷狀態和增加想要的免疫應答，例如疫苗接種。實施例11 INPROL促進幹細胞再集居能力-長期培養物起始來自患CML的病人的細胞慢性髓性白血病(CML)是造血幹細胞的一種致死性的惡性疾病。CML的治療在慢性期採用單一藥物化療、聯合化療、脾切除或脾臟照射可以控制臨床病症和症狀，但是不能有效地延長存活。隨著CML由慢性期進展到加速期時標準的治療方法不起作用。採用不相關供體骨髓移植治療是困難的由於組織不相容性的問題。然而，不足40％適宜CML病人會有一個合適的相關供體匹配。因此，更喜歡自體移植。回輸自體骨髓移植及能夠從ph陽性病人在長期培養(LTC)中生長的髓樣前體細胞中選擇非白血病(ph陰性)的髓樣前體細胞的體內外條件提高正常幹細胞的潛在自體資源具有攻擊性及對慢性白血病的有效治療。
在骨髓移植的上下文中，造血幹細胞從廣義講可以被定義為具有產生成熟血細胞能力的細胞。我們已採用C.Eaves和A.Eaves建立的人長期培養系統用於定量計數幹細胞數目和作為處理幹細胞用於治療的一種方法。這包括接種細胞到預先建已照射過的人骨髓貼壁層上，然後這些培養物繼續培養5周，5周後收集全部克隆生成細胞成分(貼壁與非貼壁)。在這些條件下克隆生成細胞的產量與初始加入的前體細胞的數量呈線性相關的(Long Term Culture Cell(LTC-IC))單個人LTC-IC的平均產量是每個LTC-IC產生4個克隆生成前體細胞。以前的結果表明，當患有CML病人的骨髓放在相似的條件下，白血病克隆生成細胞(ph陽性)迅速下降。通過定量分析殘留正常LTC-IC，在患有CML病人中，選擇那些可能從由移植培養的自體移植物支持的加強治療中獲益是可能的(Phillups et al.，Bone Marrow Transplantation 8477-487，1991)。
下面的方法被用於檢測INPROL對建立於CML病人外周血骨髓遷移細胞中的克隆生成細胞(LTC-IC)的效應。培養物被作為長期培養引入到預先照射的基質上，健康供體以外周血被用作對照。來自CML病人的外周血細胞用或不用pINPROL(25ng/ml)預培養4小時，洗滌細胞，放在LTC-IC系統中培養5周以確定對照LTC-IC的數量。對於實驗組，其它平行培養物建立10天，用或不用plNPROL預培養生長10天後培養物中的貼壁和非貼壁細胞混合物放到預先建立的滋養物上繼續培養8周。通過鋪制貼壁與非貼壁細胞在含有合適的生長因子的甲基纖維素平板上來估計每一實驗組的培養物中LTC-IC的數目(Terry Fox Labaratories Vancouver，Canada)並計數集落形成細胞總數，用該方法獲得的LTC-IC值是由用公式評價總克隆生成細胞(CFC)含量衍化來的。
#LTC-IC＝#CFC/4圖14提供的資料表明，來自健康供體骨髓頭10天培養期間沒有LTC-IC的丟失。經5周培養後，大約有注入的30％仍然存在。CML病人的LTC-IC的數目在10天培養期間急劇下降到大約8％，進一步培養的過程中不見恢復。而用INPROL預培養的細胞LTC-IC的水平增加到初始數目的30％並維持8周。
通過這些初步的資料預計INPROL的臨床相關應用包括策略地用於選擇性促進新鮮或培養骨髓移植物的正常幹細胞成分；策略地用於增強殘留正常幹細胞在體內的再循環也包括轉移新的基因材料到人骨髓幹細胞中進一步移植給病人的方案。實施例12A 從骨髓製備物中分離幹細胞增殖免疫活性抑制因子的方法從豬肋骨分離骨髓，來自豬屍體的肋骨被分離，清除肌肉纖維和脂肪，切成碎塊，通過用Biophyzpribor製造的水壓榨機提取骨髓。通過離心2000rpm，20分鐘分離骨髓細胞。提取上清相繼易於通過超濾Amicon USA膜XM 100，PM 30，PM 50。根據電泳分析，產物的主要組成是白蛋白(見圖1)。生化純化骨髓提取物和組分的蛋白成分在純化的每一步都用10％聚丙烯醯胺凝膠分電泳分析，含0.1％SDS，直到7％SDS和0.5-1％巰基乙醇加至樣品。上樣前樣品在70℃溫育5分鐘。
電泳在20cm的膠進行5小時，然後在20℃用0.25％考馬斯亮蘭CBBC250乙醇∶水∶乙酸5∶5∶1混合液中染色1小時，用7％乙酸洗膠，換洗液幾次。通過用造血幹細胞增殖抑制的方法測定產物的活性。此後是該方法的詳述。第一階段 用硫酸銨沉澱純化根據表5中的結果選用飽和度為40-80％硫酸銨沉澱純化的蛋白活性是在25％。
表5硫酸飽和0-4040-60 60-80 80-100度(％)活性(％)37.2-35.4 37.2-1.8 37.2-12.8 37.2-26.1＝1.8％＝35.4％ ＝24.4％ ＝11.1％每步純化後用於檢測的樣品量是根據純化水平決定的而且相當於初始產物量的2×10-2mg通過公式決定活性。
改變(％)＝％Sa-％Sb其中 ％Sa是對照組中％S％Sb是用於測定組分溫育後的S％為了降低硫酸銨濃度20倍，在每次活性測前及下一步純化前實驗組分要除鹽。第二階段來自第一階段的抑制因子除鹽後使用，而且部分用於離子交換層析，這裡用DEAE 23纖維素。然後用梯度醋酸鈉緩衝液洗脫(pH＝6.0)抑制因子活性洗脫在3-5mM之間。
柱體積是1ml，洗脫流速是4ml/小時通過Millichrome色譜儀在230和280nm進行檢測。級分1(見圖2)表現最高活性被分離並洗脫在5mM醋酸鈉緩衝液中(見表6)。
表6級分 1 2 3 4 5活性 46.3-0 46.3-14.1 46.3-42.1 46.3-19.6 46.3-45.1＝46.3％ ＝32.2％＝4.2％ ＝26.7％＝1.2％電泳結果表明，主要蛋白汙染物-白蛋白(見圖3)被從該組分除去。這可使純度另外提高4倍。第三階段來自第二階段部分純化的抑制因子被直接用在G-75Sephadex柱柱體積是20ml(20×1)，洗脫率是2ml/小時，洗脫緩衝液是50mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5在色譜儀Millichrome在230和280nm進行監測。具有最高活性的組分5被分離。
表7組分1 2 3 4 5活性42.2-19.1 42.2-35.2 42.2-21.5 42.2-38.8 42.2-0＝23.1％ ＝7.0％ ＝20.7％ ＝3.4％ ＝42.2％第四階段 應用pro-REC柱的反向層析(Phamacia FPLCSystem)在Ultraslera基質上進行。用0.1％三氟醋酸在乙腈梯度洗脫液洗脫蛋白。
分子量16-17kD的產物同質性等於90％，正如在分析丙烯醯胺/SDS膠所示的結果(見圖6)。結果見圖4，對組分5測定活性，產物的終產量是5％。結果純化後分子量16kD的蛋白總量是初始產物的650ng/ml。純化過程中產物經受熱浴70℃幾分鐘，但經測定生物學活性不喪失。實施例12B 分離較大量INPROL的可選方法初步分離取新鮮死豬的肋骨清除肌纖維和脂肪，然後切成碎塊以1∶1(重量/體積)比率浸泡於磷酸鹽緩衝液。為從固體骨中分離骨髓獲得的混合物被用水壓擠碎。通過4層奶酪布濾出固體顆粒收集骨髓細胞懸液，濾出物在56℃溫育40分鐘然後在冰浴中冷卻到4℃，在4℃10000g離心30分鐘，去除最終沉澱並棄掉。
清亮的上清液中在30分鐘內滴加10倍體積攪拌的冰冷的丙酮含1％的濃鹽酸，混合物放置4℃，16小時完全形成沉澱。然後沉澱物在4℃ 20,000g離心30分鐘，用冷丙酮洗沉澱團塊，乾燥。高壓液相純化沉澱團塊用高壓液相緩衝液A溶解，至最終蛋白濃度8-10mg/ml，緩衝液A含5％乙腈和0.1％三氟醋酸。這種溶液(0.5～0.6ml)被加在250×4.6mm裝有Polisil ODS-300(10mcm)的高壓液相柱上，用相同的緩衝液A平衡柱。
用緩衝液B(9％乙腈，0.1％三氟醋酸)在緩衝液A中根據下列程序以1ml/分鐘的流率完成液脫。
時間，分鐘 緩衝液B的百分比％0 04 05252590在重新平衡柱前，用100％的緩衝液B衝洗柱5分鐘。然後再平衡柱回到初始狀態，下一份蛋白溶液才可以上柱，典型的層析圖見圖5。
分離過程中為了測定蛋白峰，在280nm監測柱子流出物，收集含有蛋白質的組分，相應的峰匯集到一起，30℃旋轉蒸發乾燥，獲得的殘留物溶於蒸餾水用於生物活性測定和SDS-PAGE(14％膠，降低條件)電泳分析。含有活性物質的峰被洗脫在70-80％的B緩衝液中，含有16kD的主要蛋白帶和痕量的快速移動蛋白象以前通過SDS-PAGE分析的那樣。
通過收集高壓液相的第二峰所獲得材料分析顯示在圖15(A和C)。含有兩個峰的材料(即圖5)這裡被稱作pINPROL製品1和只含有第二個峰組成的材料被稱之為pINPROL製品2。500μg這種有活性的純化的pINPROL製品2上C4反向層析柱(vydac)並用59.5％的乙腈在0.1％三氟醋酸的線性梯度洗脫。該物質在53％乙腈中洗脫出一個單一的峰(圖15A)。然而，在相同的條件下跑250μg的MIP-1α(R D System)，它在43.9％乙腈中洗脫出來(圖15B，注意14％乙腈前一點的早期峰是人為造成的由於有氣泡在檢測儀中)。天然INPROL在這些條件下基本上比MIP-1α更疏水。TGFβ被認為在這些條件下比對pINPROL觀察到的洗脫濃度更低(Miyazona et al.，J.Biol Chem.2636407-15，1988)。
圖15C所示洗脫的pINPROL材料的電泳膠。第一道是粗材料；第2道是分子量標記；第3道是純化的材料；有兩條主要帶，一條在大約14kD；另一條在大約35kD認為35kD的帶是一個14kD帶的多聚體形式。實施例13A 活性INPROL製備物含血紅蛋白β鏈pINPROL被製備如圖5所示(即pINPROL製品1(見例12B))該物質跑SDS-PAGE電泳並用標準技術轉移到硝酸纖維素膜上。使用標準技術用ABI 477A蛋白序列儀帶有120A Online PTH-AA分析器易於對該物質的N端序列進行分析。獲得了下面N端序列VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV... ... ... ...計算機查詢蛋白資料庫揭示該序列與豬血紅蛋白β鏈N端序列一致(圖16C)。實施例13B 活性INPROL製備物含血紅蛋白α鏈如圖15C所示，通過收集第二個主要峰純化的蛋白顯示在圖5(pINPROL製品2)結果2個主要帶附和大約15kD和30kD的分子量以及幾個小帶，用標準技術SDS-PAGE膠被轉移到硝酸纖維素膜上。切下單個帶，象例13A一樣易於N端序列分析。15kD帶N端序列如下VLSAADKANVKAAWGKVGGQ... ...
30kD帶易被限制性蛋白水解酶消化，獲得如下的內部序列**FPHFNLSHGSDQVK... ...
第一個序列顯示與豬血紅蛋白α鏈N端序列一致。而第二個序列顯示與豬血紅蛋白α鏈的43-56胺基酸殘基一致(見圖16C人、鼠、豬α、β血紅蛋白鏈的序列比較)這些帶及一些小帶的重複序列不斷地產生一定比例的α球蛋白序列。那麼圖15C中觀察到的各種帶即代表豬血紅蛋白α鏈的片段又代表集合物。實施例13C 豬INPROL的進一步表徵為了進一步比較pINPROL與豬血紅蛋白。二次結晶的豬血紅蛋白從Sigma化學公司獲得，使之經過反向高壓液相層析。如例12B中對圖15所描述的那樣。正如圖17所顯示的那樣，完整的血紅蛋白的高壓液相色譜圖與pINPROL製品1所見的色譜圖一樣。在進一步的直接比較中，圖17A(源於圖5的第二個峰)顯示的pINPROL製品2被看到與豬血紅蛋白(圖17B)兩個峰的第二個峰相互迭蓋。對於主要峰分別有52.51和52.25分鐘的滯留時間。應該注意到血紅素與血紅蛋白中第一個主要峰共遷移，這種情況下在49.153分鐘，因此，血紅素是pINPROL製品1的組分而不是製品2的組分。這被證明通過pINPROL製品在575nm缺少吸收。一個對血紅素存在的診斷波長。
豬血紅蛋白α和β鏈的預計分子量分別是15038道爾頓和16034道爾頓。正如圖18中SDS-PAGE色譜所見。頭兩個峰由較高分子量組成，第二個的兩個峰由較低分子量鏈組成。那麼頭兩峰出現表示血紅蛋白β鏈，第二個的兩個峰表示血紅蛋白α鏈。
此外，用淺洗脫梯度進行豬血紅蛋白的分離(圖21)。這些峰的N端分析表明第一個峰是豬的α鏈而第二個峰是豬的β鏈。生物分析結果證實分離的兩種血紅蛋白鏈是有生物學活性的(實施例14和例15)。
為了進一步比較pINPROL製品2和血紅蛋白β鏈進行雙向電泳(圖19)。作為第一向，等電聚焦在玻璃管中用2％pH4-8的兩性電解質進行9600伏特小時。用原肌球蛋白(分子量33kD，等電點5.2)作為內參照，它的位置用箭頭標在最終的2D膠。膠管在緩衝液中平衡並封在12％丙烯醯胺板膠上面的濃縮膠的上面。SDS板膠電泳在12.5mA/膠中進行4小時。用銀染膠並幹膠。
比較2D電泳模型揭示，只有1或2個較小的斑點不同與高壓液相純化的血紅蛋白β鏈和pINPROL製品2。用抗豬血紅蛋白抗體的Western分析，不論1D和2D電泳證實在制品中存在β血紅蛋白。因此，按照例12B製備活性pINPROL製品2基本上是豬血紅蛋白的β鏈。實施例14 血紅蛋白α、血紅蛋白β鏈或完整的血紅蛋白顯示幹細胞抑制活性為了證明血紅蛋白β鏈有INPROL活性，用例1描述的方法及象例12B純化的材料進行來自睪酮處理小鼠的骨髓細胞的自殺分析。如表8所示，正常小鼠骨髓細胞的15％被殺死而相對與睪酮處理小鼠為36％。正如所希望的，這表明睪酮處理提高了進入細胞周期細胞的百分數(因此，表示它們對殺死更敏感-實施例1)。相反，來自睪酮處理動物的細胞與pINPROL或純化血紅蛋白β鏈以40ng/ml培養表現出在細胞周期細胞的急劇下降，分別從36％降到0％和7％。對這兩個蛋白劑量高達200ng就不那麼有效了。作為陽性對照，以前特徵化的幹細胞抑制因子MIP-1α減少細胞周期細胞至13％。
在體外能進行相似的分析。用進入細胞周期狀態CFU-mix代替CFU-S。這種分析除阿糖胞苷(AraC，30mg/ml)被用作細胞周期特異毒性藥物代替高劑量3H-TdR和帶有高內源性細胞周期率的小鼠種系(Balb/c)用來代替睪酮處理BDF1小鼠外象以上對CFU-S分析描述的那樣進行(見B.I.Lord，Haemopoiesis-APractical Approach.，N.G.Testa and G.Molineux(Eds.)，IRLPress 1993；Pragnell et al.，Culture of Hematopoietic Cells，R.I.Freshney，I.B.Pragnell and M.G.Freshney(Eds.)，Wiley Liss1994)。如圖9所示，高度純化的豬β鏈或α鏈在這一分析中均是有活性的。在該分析中應注意，用pINPROL處理的細胞的細胞周期水平偶然有相反的數目。這意味著在阿糖胞苷處理池中有比在非處理池中更多的集落。
如例2所述，在3H-TdR攝入分析中pINPROL抑制鼠幹細胞系FDCP-Mix的增殖。圖20表明用這一分析方法純化的血紅蛋白α或β鏈均是有活性的，所見到抑制性＜2mg/ml。
前文提供的證據豬血紅蛋白β鏈顯示INPROL活性。其它資料(表9，圖20)表明，分離到的α鏈，以及完整的血紅蛋白作為幹細胞抑制因子也是有活性的，活性製品也包括α和β鏈的混合物(圖5)。
觀察分離的α球蛋白鏈和/或β球蛋白鏈是有活性的。表明此處描述的活性不需要一個完整的三維空間結構的血紅蛋白。α和β鏈的片段作為幹細胞增殖抑制因子也是有活性的。
表8處 理 殺死(％)WBM115TPBM236pINPROL 200ng/ml2340ng/ml 0Hbg3200ng/ml2540ng/ml 7MIP-1α 200ng/ml131NBM＝正常骨髓2TPBM＝睪酮處理小鼠骨髓3Hbg＝C4反向純化豬血紅蛋白β鏈(來自兩次結晶的豬血紅蛋白)
表9處 理 殺死(％)對照143豬α鏈2-4豬β鏈2-141對照-來自Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml(如圖21純化的)實施例15純化的INPROL、純化的豬α血紅蛋白或純化的豬β血紅蛋白在體內是有活性的為了測定純化的豬血紅蛋白在體內起作用的能力，如例1所述BDF1小鼠注射睪酮丙酸化物。24小時後，小鼠靜脈注射500ng、pINPROL或豬血紅蛋白α鏈(如圖21，從豬處周血紅細胞純化的)或相當量的載體。48小時後收集每隻鼠骨髓按例14所述進行CFU-Mix分析。如表10所示pINPROL、豬α鏈和豬β鏈在體內均有活性。降低細胞周期中的CFU-Mix的百分數至基礎水平。
表10處 理 殺死(％)對照145pINPROL25豬α鏈25豬β鏈2-5基質341對照-來自睪酮處理BDF1小鼠的骨髓2100ng/ml3基質-來自未處理BDF1小鼠骨髓實施例16 純化的人血紅蛋白α鏈、生物素化的人血紅蛋白α鏈、生物素化的人血紅蛋白β鏈、人血紅蛋白γ和人血紅蛋白δ鏈在體外均顯示幹細胞抑制活性從Sigma生化公司或用標準方法從成人外周血或臍帶血分離獲得人血紅蛋白。通過反向高壓液相用一個象上面描述的對豬α和β鏈相似的方法分離各個單獨的鏈。(見B.Masala and Manca，Methodsin Enzymology Vol.231 pp21-24，1994)得到了純化的α、β、γ和δ鏈。對於生物素化的α和β鏈用37μg的NHSLC生物素(Pierce)處理成人血紅蛋白1mg通過象上面的反向液相層析分離各鏈。
如圖1、12和13所示，純化的人α鏈、生物素化的人α鏈、生物素化的人β鏈、人γ鏈和人δ血紅蛋白鏈在CFU-Mix周期分析中所有的鏈均是有活性的。
表11處 理 殺死(％)對照149人α鏈2-1人β鏈241人γ鏈 -631對照-來自Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml表12處 理 殺死(％)對照147人y鏈212人δ鏈2-4
1對照-來自Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml表13處 理殺死(％)對照168人α鏈219生物素化的α鏈27人β鏈255生物素化的β鏈2251對照-來自Balb/c小鼠骨髓2100ng/ml實施例17 純化的人α鏈、α-β二聚物或血紅蛋白在體內是有活性的純化的人α鏈、α-β二聚物或血紅蛋白在一個象例15中描述的體內分析方法中被檢測。如表14所示，在每隻小鼠500ng的濃度時這些成分的每一個都是有活性的。
表14處 理殺死(％)對照149人α鏈 -22人α-β二聚物 14人血紅蛋白 -311對照-來自睪酮處理BDF1小鼠的骨髓實施例18 豬INPROL在體外對人單核或CD34+臍帶血細胞是有活性的為了調查來自豬骨髓純化的INPROL影響人祖細胞周期的能力，臍帶血細胞被獲得。不論是用Ficoll分離後獲得的單核細胞組分還是用CD34親和柱分離後獲得的CD34+組分被應用於該實驗。為了確保早期幹細胞處於細胞周期，細胞在體外有IL-3和幹細胞因子(SCF)(100ng/ml每種細胞因子)存在的情況下培養48小時。經預培養後，按例14中描述的方法除了鋪板後第18天計數CFU-GEMM(代替CFU-Mix)外進行細胞周期分析。如表15所示，豬INPROL抑制CFU-GEMM的細胞周期無論是在大量的單核細胞還是在CD34+組分中。
表15處 理 殺死(％)單核細胞對照 93pINPROL116CD34+細胞 對照 41pINPROL1211100ng/ml實施例19 純化的人α血紅蛋白對人CFU-GEMM是有活性的人臍帶血單核細胞被獲得並在IL-3和SCF存在的條件下培養，並用於例18所述的細胞周期分析。圖16所示，從骨髓中純化的豬INPROL和從外周血純化的人α血紅蛋白兩者在本分析中均是有活性的。
表16處 理 殺死(％)對照100pINPROL1-6人α鏈1-232100ng/ml實施例20 從人α血紅蛋白和人β血紅蛋白序列獲得的肽類是有活性的為了鑑定活性肽序列，用計算機模型程序把肌紅蛋白的三維結構(在這一分析中肌紅蛋白是無活性的)放在人血紅蛋白α鏈的天然三維結構上。兩個肽(代表胺基酸43-55和64-82區域，這些區域在結構上不同與肌紅蛋白三維空間結構)被鑑定在CFU-MIX周期分析中作為有活性的肽類。為了更緊密接近於在天然α鏈中發現的環狀物，一個43-55肽的環行衍生物(c43-55)(用二硫鍵)也被合成並發現是有活性的。這些肽類的序列如下43-55 Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Valc(43-55)Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys(其中兩個Cys殘基是二硫鍵)64-82 Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala兩個hemorphin序列，Hemorphin 10(β鏈序列的32-41位胺基酸)和Hemorphin 7(33-40位胺基酸)被檢測並且發現具有活性。
序列如下Hemorphin 10 Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Try-Thr-Gln-Arg-PheHemorphin 7 Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg
為了檢測這些序列的活性，按例14所述進行CFU-MIX細胞周期分析，如表l7-19所示，在這個分析中這些肽類都是有活性的。
表17處 理殺死(％)對照47pINPROL10肽(43-55)100ng/ml 210ng/ml181ng/ml11100ng/ml表18處 理殺死(％)對照43肽(43-55)15肽(64-82)19Hemorphin 1011Hemorphin 7101所有肽類以100ng/ml測定表19處 理殺死(％)對照47環形肽43-55101在100ng/ml濃度雖然按優選的實施方案描述了本發明，應理解本領域的技術人員會知道各種變化和變更。因此，所附權力要求包括所要保護的本發明的範圍內所有等價的變化。
權利要求
1.一種藥物組合物，它包含血紅蛋白和藥用載體。
2.一種藥物組合物，它包含(a)選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈和血紅蛋白ζ鏈的多肽，和(b)藥用載體。
3.一種藥物組合物，它包含血紅蛋白α鏈和藥用載體。
4.一種藥物組合物，它包含血紅蛋白β鏈和藥用載體。
5.權利要求3的藥物組合物，它還包含血紅蛋白β鏈。
6.一種藥物組合物，它包含至少一種選自權利要求2中所列的多肽。
7.權利要求6的藥物組合物，其中所說的組合物是兩個多肽。
8.權利要求7的藥物組合物，其中所說的兩個多肽是二聚物，它包含選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈和血紅蛋白ζ鏈的兩個多肽。
9.權利要求8的藥物組合物，它選自血紅蛋白α鏈-血紅蛋白β鏈、血紅蛋白α鏈-血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白o鏈-血紅蛋白δ鏈和血紅蛋白δ鏈-血紅蛋白δ鏈。
10.一種肽，它具有序列Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val。
11.一種環狀肽，它具有序列Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，其中兩個Cys殘基形成二硫鍵。
12.一種肽，它具有序列Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala。
13.權利要求1-12的藥物組合物，其為單位劑量形式。
14.權利要求13的藥物組合物，它包含0.1mg到6g一或兩種選自血紅蛋白α、β、γ、δ、ε和ζ鏈的化合物。
15.一種抑制幹細胞增殖的方法，它包括用幹細胞增殖抑制量的INPROL接觸造血細胞。
16.權利要求15的方法，其中所說的INPROL選自血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈、血紅蛋白γ鏈、血紅蛋白δ鏈、血紅蛋白ε鏈、血紅蛋白ζ鏈。
17.權利要求15的方法，其中所說的INPROL選自具有下列序列的肽類Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys(其中兩個半胱氨酸殘基形成一個二硫鍵)，Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，Leu-Val-Val-Tyr-Pro，Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，和Tyr-Pro-Trp-Thr。
18.一種抑制幹細胞增殖的方法，它包括用一種能結合阿片受體的化合物接觸造血細胞。
19.權利要求18的方法，其中的化合物對阿片受體的μ亞類有選擇性。
20.權利要求18的方法，其中的化合物選自具有下列序列的肽類Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，Leu-Val-Val-Tyr-Pro，Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，和Tyr-Pro-Trp-Thr。
21.一種刺激B細胞生長的方法，它包括用生長刺激量的INPROL接觸造血細胞。
22.一種治療哺乳動物癌症的方法，它包括如下步驟a)實施放療或化療，和b)施用幹細胞增殖抑制量的INPROL。
23.權利要求22的方法，其中步驟a和b被重複一次或多次。
24.權利要求22的方法，其中步驟a在步驟b之後進行。
25.權利要求22的方法，其中步驟b在步驟a之前或之後24小時內進行。
26.一種治療哺乳動物癌症的方法，它包括a)從所說的哺乳動物中移出造血細胞，b)用INPROL間接體內地處理造血細胞，c)用化療或輻射處理步驟b中的造血細胞，d)對所說的哺乳動物進行成髓治療，和e)將步驟c的造血細胞移植給所說的哺乳動物。
27.權利要求26的方法，其中所說的癌症是白血病。
28.抑制暴露於損傷或破壞幹細胞藥物的哺乳動物中的幹細胞分裂的方法，它包括施用幹細胞增殖抑制量的INPROL。
29.權利要求28的方法，其中所說的藥物是一種抗病毒藥物。
30.間接體內地維持哺乳動物造血幹細胞的方法，它包括用幹細胞增殖抑制量的INPROL接觸造血細胞。
31.權利要求30中的方法，其中所說的造血細胞選自骨髓細胞、外周血細胞、活化的外周血細胞和臍帶血細胞。
32.一種治療患有髓增殖性疾病或自身免疫疾病、上皮幹細胞過度增殖的哺乳動物的方法，它包括施用過度增殖降低量的INPROL。
33.權利要求32的方法，其中所說的髓增殖性疾病是一種骨髓發育不良綜合症。
34.一種有區別地保護化療或放療哺乳動物中的正常幹細胞而不保護癌細胞的方法，它包括施用幹細胞保護量的INPROL。
35.權利要求34的方法，其中所說的INPROL是在正常幹細胞通過暴露於細胞毒藥物或輻射而被誘導增殖後施用的。
36.一種接種哺乳動物的方法，它包括在疫苗接種前、疫苗接種期間或疫苗接種後施用作為一種輔助藥物的INPROL。
37.一種純化幹細胞增殖抑制因子的方法，所述抑制因子基本上沒有其它蛋白物質，該方法包括以下步驟a)分離骨髓並從提取物中去除顆粒物質；b)加熱提取物並去除沉澱；c)對提取物進行酸沉澱並收集沉澱物；和d)通過反相層析分離所說的抑制因子。
38.一種純化的幹細胞增殖抑制因子，其中該抑制因子按權利要求37的方法被純化為表觀上均一。
39.一種治療因幹細胞過度增殖而引起哺乳動物免疫抑制的方法，它包括給所說的哺乳動物施用過度增殖回復量的INPROL。
40.一種在哺乳動物中進行基因治療的方法，它包括a)從所說的哺乳動物中移出造血細胞；b)用一個預先確定的基因轉染該造血細胞；c)間接體內地用INPROL接觸轉染的造血細胞；d)將步驟c的造血細胞移植給所說的哺乳動物。
41.權利要求40的方法，其進一步包括在步驟(a)之後用至少一種刺激性細胞因子處理所說的造血細胞，以誘導幹細胞增殖。
42.權利要求40的方法，其進一步包括在步驟(d)之後在體內用INPROL治療哺乳動物。
43.一種間接體內地進行幹細胞擴增的方法，它包括用INPROL和至少一種刺激性細胞因子接觸造血細胞。
44.權利要求43的方法，其中所說的造血細胞選自骨髓細胞、臍帶細胞、外周血細胞、活化的外周血細胞。
45.一種藥物組合物，它包含(a)INPROL和(b)至少一種抑制性化合物，該化合物選自MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、五肽pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys，四肽N-乙醯-Ser-Asp-Lys-Pro和三肽穀胱甘肽(Gly-Cys-γGlu)。
46.一種藥物組合物，它包含(a)INPROL和(b)至少一種刺激性化合物，該化合物選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、紅細胞生成素、血小板生成素、幹細胞因子和flk2/flt3配基。
全文摘要
本發明公開並要求保護的是用於調節異常幹細胞周期和加速化療後外周血細胞恢復的幹細胞抑制因子的分離及其應用。同時公開並要求保護的是幹細胞增殖抑制因子。
文檔編號A61K48/00GK1168695SQ95196555
公開日1997年12月24日 申請日期1995年9月29日 優先權日1994年9月30日
發明者V·K·科茲洛夫, I·楚爾洛娃, S·D·沃爾帕 申請人:普羅神經細胞有限公司