豬平均日增重相關基因Resistin的分子標記及其應用的製作方法
2023-06-02 07:40:56
豬平均日增重相關基因Resistin的分子標記及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及豬分子標記製備領域，具體地指一種豬平均日增重相關基因Resistin的分子標記及其應用。本發明利用Resistin基因序列中包含一個SNP位點，位於核苷酸序列SEQ?ID?NO.1的第861bp處，該位點為T/C的鹼基突變，導致Alw26I-RFLP多態性。這個鹼基突變位於Resistin基因第3內含子中，不改變其翻譯的胺基酸序列。故在Resistin基因序列的SNP位點附近設計引物，得到分子標記序列SEQ?ID?NO.1，從而鑑定豬平均日增重性狀。本發明利用現有的PCR-RFLP技術，在Resistin基因第861bp處發現一個T-C突變，且發現此多態位點與平均日增重性狀顯著相關，對豬生長性狀的研究有一定幫助。
【專利說明】豬平均日增重相關基因Resistin的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及豬分子標記製備領域，具體地指一種豬平均日增重相關基因Resistin的分子標記及其應用。
【背景技術】
[0002]畜牧業在現代農業發展中佔據著非常重要的地位，其在農業生產中所佔有的比值通常用來衡量一個國家和地區發展程度的重要指標。豬肉作為我國最主要的肉類來源，生豬養殖產業在我國畜牧業中佔據著舉足輕重的地位。在20世紀80年代中期，我國肉類產量約2000萬噸，豬肉約佔85%，2012年豬肉產量達到了 5335萬噸，約佔肉類總量63.63%。雖然豬肉所佔比重逐漸下降，但其始終佔據主導地位。
[0003]在養豬行業中，飼料成本佔養豬總成本的65-75%。因此，降低生豬養殖中的飼料消耗，提高飼料利用效率，降低飼料成本關係到養豬企業發展乃至生存。研究發現，豬的飼料轉化效率同採食量、平均日增重、肌內脂肪等經濟性狀顯著相關(趙克斌，提高生長育肥豬飼料轉化率降低飼料成本的策略.豬業科學，2008，60-63)。因此，影響豬採食量、平均日增重、肌內脂肪等性狀的基因可作為研究豬飼料轉化效率的候選基因。
[0004]抵抗素Resistin被美國賓夕法尼亞大學Steppan等(SteppanCM,Bailey ST, Bhat S，Brown EJ, Banerjee RR, Wright CM, Patel HR, AhimaRS, Lazar MA." The hormone resistin I inks obesity to diabetes " [J].Nature, 2001, 409 (6818):307 - 312)在成熟的脂肪細胞中發現。同年，Kim等利用基因晶片分離技術分離得到鼠的Resistin基因(Sung-Eun Kim, He Huang, MingZhao,Xinjun Zhang, Aili Zhang.Wnt Stabilization of β-Catenin RevealsPrinciples for Morphogen Receptor-Scaffold Assemblies[J].Science, PublishedOnline Aprilll2013)。隨後，Rajala等運用差減篩選文庫分離脂肪細胞在不同分化階段表達的基因時，也分離出了 Resistin基因(Rajala MW, Lin Y, Ranalletta M, YanqXM, Qian H, Ginqerich R.Cell type-specific expression and coregulation ofmurine resistin and resistin-like molecule-alpha in adipose tissue[J].MolEndocrinol, 2002，16:1920 - 30)。潘穎斌等採用 PCR-SSCP 方法發現 Resistin 基因的啟動子、外顯子、內含子中均發現多態位點(潘穎斌，劉豔芬，劉鈾，高志傑，王群，何萬娟，譚敏靜.六個品種豬胰島素抵抗素基因單核苷酸多態性分析.農業生物技術學報，2008，16 (3):402-406)ο
[0005]範紅旗通過對胰島素敏感靶組織-骨骼肌細胞糖攝取功能的研究表明Resistin能顯著抑制肌細胞對葡萄糖攝取(範紅旗.Resistin對骨骼肌細胞糖攝取功能的影響及其機制分析.[碩士學位論文]，南京:南京醫科大學，2007年)。Solana等研究表明小鼠Resistin基因能與受體·酪氨酸激酶樣孤兒受體I (R0R1)在RORl細胞外特定區域結合，介導3T3-L1前體脂肪細胞分化和葡萄糖攝取(Beatriz Sanchez-Solana, JorgeLaborda, Victoriano Baladron.Mouse Resistin Modulates Adipogenesis and GlucoseUptake in3T3_LlPreadipocytes Through the RORlReceptor[J].Molecular Endocrinology, 2012，26(1): 110-127)。劉峰等通過進一步研究發現過表達Resistin減緩胰島β細胞RINm5F增殖,表明Resistin能夠對胰島素分泌產生抑制作用(劉峰，邱潔，張春梅，季晨博，郭錫熔.Resistin基因對胰島β細胞RINm5F增殖的影響.中國當代兒科雜誌，2010，43-46)。[0006]同時Resistin可作為信號分子調節脂肪生長發育與分布沉積。陳小東對食物限制及飽食的豬脂肪中一些脂肪分解相關的參數進行了檢測，發現豬的脂肪組織中Resistin顯著表達，且Resistin表達水平同脂肪沉積呈正相關(陳小東.脂肪細胞因子TNF-α與resistin的表達及其對豬脂肪代謝的調控作用.[博士學位論文]，武漢:華中農業大學，2004年)。Cieslak發現在波蘭大白豬群體中，Resistin基因同背膘厚顯著相關(CieslakJ, Nowacka-ffoszuk J,Bartz M, Fijak-Nowak H,Grzes M, Szydlowski M,SwitonskiM.Association studies on the porcine RETN, UCPI, UCP3and ADRB3genes polymorphismwith fatness traits[J].Meat Science,2009，83 (3):551-554)。
[0007]以上研究表明，Resistin能通過對胰島素作用，調節體內血糖含量，同時與體內脂肪細胞的增殖、分化及同脂肪的沉積水平有密切聯繫，通過調節Resistin表達量，可以控制體內能量代謝平衡。
[0008]由於豬的生長性狀與體內糖代謝及脂肪沉積有密切關係，因此可以研究Resistin基因是否對豬生長性狀產生影響。由於Resistin在調節脂類代謝、胰島素抗性、能量平衡、採食量、炎症等方面起著重要作用(楊在清，周磊，甘莉，雷霆，陳小冬.Resistin基因的表達及調控研究.全國動物生理生化第十次學術交流會論文摘要彙編，2008年)，研究Resistin與豬的能量代謝、採食量之間的關係，對於改良豬的經濟性狀有重要意義。
【發明內容】
[0009]本發明所要解決的技術問題就是提供一種豬平均日增重相關基因Resistin的分子標記，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本發明還提供了一種用於獲得所述分子標記的引物對，所述引物對為:
[0011]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0012]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'。
[0013]本發明還提供了一種分子標記的獲得方法，以具有Resistin基因的豬基因組DNA為模板，採用以下引物對:
[0014]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0015]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'。
[0016]進行PCR擴增，其所獲得的分子標記為SEQ ID N0.2。
[0017]本發明還提供了一種分子標記鑑定豬高的平均日增重性狀的方法，以待測豬的基因組DNA為模板，採用以下引物對:
[0018]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0019]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0020]進行PCR擴增，其中，具有349bp條帶的豬，其具有Resistin基因，如SEQ ID N0.1。
[0021]本發明還提供了一種分子標記在豬部分生長性狀及飼料轉化效率性狀相關分子標記輔助育種中的應用。
[0022]本發明還提供了一種分子標記的引物對在豬部分生長性狀及飼料轉化效率性狀相關分子標記輔助育種中的應用。
[0023]一種鑑定含有Resistin基因的豬的方法，包括以下步驟是:
[0024]I)引物對:
[0025]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0026]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'； [0027]2) PCR擴增條件
[0028]PCR反應總體積10 iil，其中待測豬基因組DNA模板I iil，正反向引物各0.2nmol/V-1, PCRmix5 V-1,最後加入去離子水至總體積IOy I ;
[0029]3)PCR反應條件為:95°C預變性5min後，循環30次95°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸40s ;最後72°C延伸5min ;PCR產物經2% W/V瓊脂糖凝膠電泳檢測；
[0030]4) RFLP 檢測
[0031]PCR產物酶切反應體積是10 iil，其中PCR產物5 iil，去離子水3.5 iil，IOXbufferl U 1，限制性內切酶 Alw26I 為 0.5 y 1(10U/U 1)，
[0032]將樣品混勻後離心，37°C培養箱放置12h，用3.5%ff/V瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照；
[0033]酶切產生三種基因型，TT基因型只有349bp —條帶，CC基因型有183bp和166bp兩條帶，雜合子TC基因型有349bp、183bp和166bp三條帶。
[0034]本發明原理
[0035]Resistin基因序列中包含一個SNP位點，位於核苷酸序列SEQ IDN0.1的第861bp處，該位點為T/C的鹼基突變，導致Alw261-RFLP多態性。這個鹼基突變位於Resistin基因第3內含子中，不改變其翻譯的胺基酸序列。故在Resistin基因序列的SNP位點附近設計引物，得到分子標記序列SEQ ID N0.1，從而鑑定豬平均日增重性狀。
[0036]為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施:
[0037]—種與豬部分生長性狀及飼料轉化效率性狀相關的分子標記的獲得:
[0038]I)豬Resistin基因的引物設計與部分DNA序列擴增
[0039]用豬Resistin基因序列信息(GenBank收錄號:ENSSSCG00000013575)作為引物設計的模板序列，利用生物學引物設計軟體01igo7.0設計引物，引物序列如下:
[0040]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0041]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0042]2) PCR擴增反應:
[0043]利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(購自美國invitrogen公司)從純種美系大白閹割豬實驗群體(該群體來源於湖北金林育種場，)(屠宰測定與採樣分成21個批次進行，測定個體數量共計236頭，全部為美系純種大白閹割公豬)耳組織中提取基因組DNA，具體操作方法參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書進行。
[0044]PCR反應:反應總體積為30111，其中豬0嫩模板3.0111，PCRmixl5 yl，正向引物和反向引物各0.6nm0l/iil，最後加去離子水至總體積SOiiltjPCR反應條件為:95°C預變性5min 後，循環 30 次 95°C 變性 308、581:退火308、721:延伸 40s，最後 72°C 延伸 5min。PCR產物經1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了部分Resistin片段，長度為349bp，其序列為SEQ ID N0.2 所示。
[0045]3) PCR產物的純化、測序
[0046]PCR產物的純化:在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml離心管中，然後用PCR產物純化試劑盒(購自北京百泰克公司)純化PCR產物。將純化後的DNA溶液送至上海英駿公司正反向測序。
[0047]用引物擴增豬基因組DNA得到了 349bp特異性擴增片段，如圖2所示，正反向測序結果發現該片段所在的Resistin基因(SEQ ID N0.1所示)的第861位發現一個T-C轉換(如圖3所示)，造成一個Alw26I酶切位點(T(TTA)。
[0048]一種基於與豬平均日增重相關的分子標記的檢測方法，其步驟如下:
[0049]I)引物序列
[0050]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0051]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0052]該引物擴增片段長度349bp，其序列為SEQ ID N0.2所示。
[0053]2) PCR擴增條件
[0054]PCR反應總體積10 μ 1，其中豬基因組DNA模板I μ 1，正反向引物各0.2nmol/y I,PCRmix5 μ I,最後加入去離子水至總體積10 μ I。PCR反應條件為:95°C預變性5min後,循環30次95°C變性30s、58°C·退火30s、72°C延伸40s ;最後72°C延伸5min。PCR產物經2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0055]3 ) RFLP 檢測
[0056]PCR產物酶切反應體積是10 μ 1，其中PCR產物5 μ 1，去離子水3.5 μ 1，IOXbufferly 1，限制性內切酶Alw26I為0.5 μ I (10U/μ I)，將樣品混勻後離心，37°C培養箱放置12h，用3.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
[0057]酶切產生三種基因型，TT基因型只有349bp —條帶，CC基因型有183bp和166bp兩條帶，雜合子TC基因型有349bp、183bp和166bp三條帶。
[0058]一種與豬平均日增重性狀的分子標記在與豬部分生長性狀及飼料轉化效率性狀相關的分子標記輔助育種中的應用，步驟如下:
[0059]採集樣品的平均日增重、採食量、預測採食量、剩餘採食量、飼料轉化率及肌內脂肪6項指標。根據採集樣品的群體結構，運用混合模型來統計分析Resistin基因SNP位點的基因型效應及其與飼料轉化效率性狀的關係:
[0060]Yij= μ +genotypei+ ε "+G
[0061]其中，Yij為處理後性狀值，μ為總體均值，ε ij為隨機誤差，G為批次效應，假定服從Ν(0，σ2)分布。即可分析出基因型效應，完成基因型效應的多重性比較。採用SPSS16.0軟體(AsiaAnalytics China)進行數據處理與統計分析。
[0062]統計分析發現該基因的T>C突變基因型，其中TT型與CC型的不同與平均日增重顯著相關(P=0.038)，與採食量、預測採食量及剩餘採食量不顯著相關。通過最小二乘均數對基因型為TT、CC、TC的個體進行兩兩比較，結果表明TT型基因型平均日增重高於CC型基因型個體，TC型基因型與其他兩種基因型之間無顯著差異。
[0063]與現有技術相比，本發明具有以下優點:[0064]本發明利用現有的PCR-RFLP技術，在Resistin基因第861bp處發現一個T-C突變，且發現此多態位點與平均日增重性狀顯著相關，對豬生長性狀的研究有一定幫助。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0065]圖1為本發明技術流程圖。
[0066]圖2為豬Resistin基因基因組擴增電泳結果不意圖。
[0067]M:DL2000分子量標記；
[0068]圖3為本發明中豬Resistin基因測序發現的T>C突變。
[0069]圖4為豬Resistin基因外顯子的Alw26I_RFLP的三種基因型(TT CC TC)電泳結
果示意圖。
[0070]M:50bpDNA 分子量標記；P:PCR 產物。
【具體實施方式】
[0071]為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限於以下實施例。
[0072]實施例1:
[0073]—種與豬平均日增重性狀相關的分子標記的獲得:
[0074](一)豬Resistin基因·的引物設計與部分DNA序列擴增
[0075]用豬Resistin基因序列信息(GenBank收錄號:ENSSSCG00000013575)作為引物設計的模板序列，利用生物學引物設計軟體01igo7.0設計引物，引物序列如下:
[0076]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0077]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0078](2) PCR 擴增反應:
[0079]利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(購自美國invitrogen公司)從純種美系大白閹割豬實驗群體(該群體來源於湖北金林育種場)(屠宰測定與採樣分成21個批次進行，測定個體數量共計236頭，全部為美系純種大白閹割公豬)耳組織中提取基因組DNA，具體操作方法參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書進行。
[0080]PCR反應:反應總體積為30 μ 1，其中豬DNA模板3.0 μ 1，PCRmixl5 μ 1，正向引物和反向引物各0.6nmol/μ 1，加入去離子水至總體積30 μ I。PCR反應條件為:95°C預變性5min 後，循環 30 次 95°C變性 30s、58°C退火 30s、72°C延伸 40s，最後 72°C 延伸 5min。PCR產物經I (W/V) %瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了部分Resistin片段，長度為349bp，其序列為 SEQ ID N0.2 所示。
[0081](3) PCR產物的純化、測序
[0082]PCR產物的純化:在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml離心管中，然後用PCR產物純化試劑盒(購自北京百泰克公司)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是按照IOOmg膠塊加入400 μ I GS Buffer的比例加入GSBuffer，置50°C溫育lOmin，使瓊脂糖膠塊完全溶化，每兩分鐘顛倒混勻一次；將溶化的膠液轉入到離心吸附柱，並將離心吸附柱置於廢液收集管中，1000Orpm離心30s，棄去廢液；將離心吸附柱置回廢液收集管中，加入500 μ I Wash Buffer於離心吸附柱中，1000Orpm離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用500 ill Wash Buffer溶液洗滌一次；將離心吸附柱置會廢液收集管中，最高速度離心Imin ;小心取出離心吸附柱，將其套入一個無菌的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30iU雙蒸水，室溫靜置2-10min後，最高速度離心Imin ;取出離心吸附柱，將1.5ml離心管(DNA溶液)置於_20°C保存備用。將純化後的DNA溶液送至上海英駿公司正反向測序。
[0083]用引物擴增豬基因組DNA得到了 349bp特異性擴增片段，如圖2所示，正反向測序結果發現該片段所在的Resistin基因(SEQ ID N0.1所示)的第861位發現一個T-C轉換
(如圖3所示)，造成一個Alw26I酶切位點(TC^TA )。
[0084]實施例2:
[0085]一種基於與豬平均日增重性狀相關的分子標記的檢測方法，其步驟如下:
[0086]PCR-RFLP診斷方法建立
[0087](I)引物序列
[0088]正向引物:5'-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'；
[0089]反向引物:5'-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'；
[0090]該引物擴增片段長度349bp，其序列為SEQ ID N0.2所示。
[0091](2) PCR擴增條件
[0092]PCR反應總體積lOiil，其中豬基因組DNA模板liil，正反向引物各0.2nmol/u I,PCRmix5 u I,最後加入去離子水至總體積IOii I。PCR反應條件為:95°C預變性5min後,循環30次95°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸40s ;最後72°C延伸5min。PCR產物經2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0093](3) RFLP 檢測
[0094]PCR產物酶切反應體積是10 iil，其中PCR產物5 iil，去離子水3.5 iil，IOXbufferl iil，限制性內切酶Alw26I為0.5 yl (IOU/yl)，將樣品混勻後離心，37°C培養箱放置12h，用3.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
[0095]酶切產生三種基因型，TT基因型只有349bp —條帶，CC基因型有183bp和166bp兩條帶，雜合子TC基因型有349bp、183bp和166bp三條帶，如圖4所示。
[0096]實施例3:
[0097]—種與豬平均日增重性狀相關的分子標記在不同豬群體多態性檢測中的應用，其步驟是:
[0098]利用PCR-Alw26I_RFLP檢測了純種美系大白閹割豬實驗群體(該群體來源於湖北金林育種場)(236個美系純種大白閹割公豬群體)。該突變位點在實驗群體中的基因型和基因頻率如表1所示，檢測結果顯示，Resistin基因在實驗群體中存在三種基因型，其中TT型個體有104頭，TC型個體有112頭，CC型個體有20頭，酶切分型的檢測結果與測序結果相符，本發明的檢測方法可靠。此結果表明Resistin基因在純種美系大白閹割豬實驗群體中等位基因T佔優勢。 [0099]實施例4:
[0100]一種與豬平均日增重性狀相關的分子標記與部分生長性狀及飼料轉化效率性狀的關聯分析
[0101]本實施例的豬群來自本湖北金林育種場純種美系大白閹割豬，屠宰測定與採樣分成21個批次進行，測定個體數量共計236頭，全部為美系純種大白閹割公豬。
[0102]所分析的性狀主要是部分生長性狀及與飼料轉化效率性狀相關的性狀，包括:平均日增重、採食量、預測採食量、剩餘採食量、飼料轉化率及肌內脂肪6項指標。根據採集樣品的群體結構， 申請人:運用混合模型來統計分析Resistin基因SNP位點的基因型效應及其與部分生長和飼料轉化效率性狀的關係:
[0103]Yij=U +genotypei+ ε ^.+G
[0104]其中，Yij為處理後性狀值，μ為總體均值，ε ij為隨機誤差，G為批次效應,假定服從Ν(0，σ2)分布。即可分析出基因型效應，完成基因型效應的多重性比較。採用SPSS16.0軟體(軟體來自於AsiaAnalytics China)進行數據處理與統計分析。
[0105]對豬Resistin基因Alw26I_RFLP多態性位點與部分生長及飼料轉化效率性狀進行關聯分析，由表1知:在236個個體中TT型個體有104頭，TC型個體有112頭，CC型個體有20頭。
[0106]本實施例採用SPSS16.0軟體中的廣義線性模型對豬Resistin基因的T>C突變位點的多態在美系大白閹割豬群體中對部分生長及飼料轉化效率性狀進行了初步的關聯分析。初步分析結果見表1。統計分析發現該基因的T>c突變基因型，其中TT型與CC型的不同與平均日增重顯著相關(P=0.038)，與採食量、預測採食量及剩餘採食量不顯著相關。通過最小二乘均數對基因型為TT、CC、TC的個體進行兩兩比較，結果表明TT型基因型平均日增重高於CC型基因型個體，TC型基因型與其他兩種基因型之間無顯著差異。
[0107]表1Resistin基因多態性位點基因型與部分生長性狀及飼料轉化效率性狀的關
聯分析檢測
·[0108]
基因型樣木含參 ADG FI PFIRFIFCRIMF
Genotype N0.(Kg/d) (Kg) (Kg)(Kg)(%)
CC 20 0.760±0.001 1.992=^).019 2.128±0.011-0.137=?).0072.385 士0.009 0.022±0.0003
TT 104 0.771±0.002 2.308=^).004 2.251=K).0030.057±0.0012.625士0.009 0.020士 5.15Ε-
9
TC 112 0.727士 5.36Ε- 2.179 卻.004 2.223=K).002-0.044 卻.00022.402士0.0030.026±4.73Ε-
55
p-value 0.112 0346 0.188OJb0.6090.315
TT-CC 0.038* 0.146 0.0690.9480.5170.491
TT-TC 0.721 0.115 0.7060.7800.6030.] 34
CC-TC OO^ 0(31 0.104O V ^0.340U 汾 8
[0109]注:表中的性狀均值為平均數土標準差。
[0110]ADG:平均日增重；F1:日採食量；PF1:預測日採食量；RF1:剩餘採食量；FCR:飼料轉化率；IMF:肌內脂肪。[0111]其它未詳細說明的部分均為現有技術。儘管上述實施例對本發明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據本實施例在不經創造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬於本發明保護範圍。
【權利要求】
1.一種豬平均日增重相關基因Resistin的分子標記，其特徵在於:其核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
2.用於獲得權利要求1所述分子標記的引物對，其特徵在於:所述引物對為: 正向引物:5' -CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'； 反向引物:5' -AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'。
3.按權利要求1或2所述的分子標記的獲得方法，其特徵在於:以具有Resistin基因的豬基因組DNA為模板，採用以下引物對: 正向引物:5' -CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'； 反向引物:5' -AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'。 進行PCR擴增，其所獲得的分子標記為SEQ ID N0.2。
4.按照權利要求1所述的分子標記鑑定豬高的平均日增重性狀的方法，其特徵在於:以待測豬的基因組DNA為模板，採用以下引物對: 正向引物:5' -CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'； 反向引物:5' -AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'； 進行PCR擴增，其中，具有349bp條帶的豬，其具有Resistin基因，如SEQ ID N0.1。
5.權利要求1所述的分子標記在豬部分生長性狀及飼料轉化效率性狀相關分子標記輔助育種中的應用。
6.權利要求2所述的分子標記的引物對在豬部分生長性狀及飼料轉化效率性狀相關分子標記輔助育種中的應用。
7.一種鑑定含有Resistin基因的豬的方法，其特徵在於，包括以下步驟是: 1)引物對: 正向引物:5' -CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3'； 反向引物:5' -AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3'； 2)PCR擴增條件 PCR反應總體積10 u I，其中待測豬基因組DNA模板I Ul，正反向引物各0.2nmol/ U I，PCRmix5 u I,最後加入去離子水至總體積IOii I ; 3)PCR反應條件為:95°C預變性5min後，循環30次95°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸40s ;最後72°C延伸5min ;PCR產物經2% W/V瓊脂糖凝膠電泳檢測； 4)RFLP檢測 PCR產物酶切反應體積是10 iil，其中PCR產物5 iil，去離子水3.5 iil，IOXbufferl U 1，限制性內切酶 Alw26I 為 0.5 y 1(10U/U 1)， 將樣品混勻後離心，37°C培養箱放置12h，用3.5%W/V瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照； 酶切產生三種基因型，TT基因型只有349bp —條帶，CC基因型有183bp和166bp兩條帶，雜合子TC基因型有349bp、183bp和166bp三條帶。
【文檔編號】C12N15/11GK103667279SQ201310753012
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】李長春, 鄒成, 成宏, 趙書紅, 餘梅, 李新雲 申請人:華中農業大學