肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒(pcr-螢光探針法)的製作方法
2023-06-02 07:23:51
專利名稱：肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒(pcr-螢光探針法)的製作方法
技術領域：
本發明涉及實時螢光PCR試劑盒，特別是涉及利用實時螢光PCR技術檢測肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)的試劑盒。試劑盒通過對樣本中的肺炎克雷伯菌進行檢測，可廣泛應用於肺炎克雷伯菌感染的輔助診斷。
背景技術：
肺炎克雷伯菌是臨床上最常見的革蘭陰性桿菌，是引起醫院獲得性泌尿系統感染、醫院獲得性肺炎和腹腔感染的重要病原體。同時，肺炎克雷伯菌也是社區獲得性感染如社區獲得性肺炎的潛在病原體。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)廣泛分布於自然界及人和動物的胃腸道內，是臨床標本中常見的細菌，當機體抵抗力降低時，便經呼吸道進入肺內而引起大葉或小葉融合性實變，可引起典型的原發性肺炎。肺炎克雷伯菌也能引起各種肺外感染，包括腸炎和腦膜炎(嬰兒)、泌尿道感染(兒童和成人)及敗血症。典型的肺炎克雷伯桿菌肺炎常發生於中老年男性、長期飲酒的慢性支氣管肺病患者，有較典型的臨床表現和X線徵象，結合痰培養結果，不難診斷。但在有嚴重原發疾病基礎上的發病者，臨床表現多不典型，診斷較為困難。凡在原有疾病過程中出現高熱、白細胞和中性粒細胞增多，X線胸片上出現新的浸潤病灶，而青黴素治療無效者應考慮本病。連續2次或2次以上痰培養陽性，或胸腔積液、血培養陽性可以確診。多數敗血症患者的白細胞總數明顯增多，嗜中性粒細胞增高；但血液病患者或用抗代謝藥物者白細胞數可不增加，或反有減少。利用PCR方法可以直接檢測病毒核酸，靈敏度更高。2008年I月，FDA通過第一個利用多重PCR方法，基於Luminex xTAG 技術，檢測包括呼吸道合胞病毒在內的多種呼吸道病毒核酸檢測試劑盒(xTAG RVP試劑盒)[Mahony，J.，S.Chong,et al.(2007)." Development of a respiratory virus panel test for detectionof twenty human respiratory viruses by use of multiplex PCR and a fluidmicrobead-based assay." J Clin Microbiol 45(9):2965-70]，該方法主要是在提取病毒核酸RNA或/和DNA後，經混合逆轉錄，再使用14對病毒特異引物進行多重PCR ;擴增產物經處理，與含有tag序列的21對引物再進行多重靶特異引物延伸(TSPE)反應；其後，TSPE產物與標記有ant1-tag序列的帶不同突光微球反應,通過Luminex 100流式細胞檢測儀進行檢測，記錄並分析得到結果。實時螢光定量PCR技術是上世紀90年代中期基於傳統的PCR技術發展起來的。實時螢光PCR只要加入模板和特異性引物即可實現在同一反應管內進行PCR反應，中途不需加入任何試劑，在處理大量樣品時易於操作，有助於減少殘餘汙染，設置了 UNG酶+dUTP防汙染措施有效地防範了 PCR擴增產物的汙染，避免假陽性結果，提高臨床診斷依據的可靠性，並已在多個領域得到應用。與傳統的PCR技術(終點檢測)相比，實時定量監測方法具有如下優點:實現了低拷貝數靶多核苷酸的分析，特異性和精確度更強、自動化程度更高以及汙染的可能性更小等優點，而且實時螢光PCR可以得到更高的靈敏度，與傳統的PCR技術(終點檢測)技術相比，操作更簡單，耗時更少，只需2小時即可完成全部檢測。
本發明設計的試劑盒通過對KP核酸進行直接檢測和研究，有利於加深對這種病毒的認識，不僅對於了解患病程度、預測、評價治療效果有十分重要意義，而且使得病毒感染髮病機制的研究進入量化階段，為新藥的研究與試用提供極為重要的研究手段。
發明內容
本發明的目的在於提供一種實時螢光RT-PCR方法檢測肺炎克雷伯菌的試劑盒(下面簡稱KP試劑盒)，該試劑盒包括:(I) DNA提取液；PCR檢測試劑:KP PCR反應液Α、ΚΡPCR反應液B ;質控品:陰性質控品、KP陽性質控品，和(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。為了解決上述任務，本發明的具體技術路線為:(I)針對肺炎克雷伯菌保守序列設計能夠與靶多核苷酸結合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探針。(2)寡核苷酸探針標記螢光發生基團，使所說的螢光發生基團與被擴增的靶多聚核苷酸間接結合。(3)適宜於RT-PCR擴增的反應體系和螢光檢測體系。核酸擴增反應體系包括耐熱DNA聚合酶、UDG酶、2』 -脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結合的正向引物、能 夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結合併且兩末端分別結合有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩衝液。(4)從待測樣本中提取DNA，加入前述的反應體系中，直接PCR擴增。(5)確定螢光發生基團所產生的螢光量，分析循環擴增後產生的螢光量以確定靶多核苷酸的存在。本發明一個優選的實施方案，其中試劑盒的KP PCR反應液A由對應的PCR反應Buffer、正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、純水組成，其特徵在於用於靶多核苷酸擴增的正向和反向引物的序列分別是5 』 -GCGCGCACCTATTGTGTTG-3，(SEQ ID NO:1)和5』-TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3』 (SEQ ID NO:2)。根據本發明一個優選的實施方案，KP PCR反應液中用於靶多核苷酸擴增和監測體系的寡核苷酸探針的序列是5』X-CCGTCTACACCCGGGCGCC-Y 3』 (SEQ ID NO:3)，其中X/Y表示螢光標記檢測體系，包括能夠與靶多核苷酸結合併且兩末端分別結合有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針。根據本發明一個優選的實施方案，PCR檢測試劑中的KP PCR反應液B包含UNG酶、熱啟動Taq酶和dNTPs。根據本發明一個優選的實施方案，核酸擴增反應體系由(a)耐熱DNA聚合酶、(b)UDG酶、(c) 2』-脫氧核苷三磷酸、(d)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結合的正向引物、(e)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結合的反向引物、(f)能夠與靶多聚核苷酸結合併且兩末端分別結合有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針、(g)含有鎂離子的緩衝液組成。根據本發明一個優選的實施方案，陽性質控品的建立技術路線為:使用引物5，-GCGCGCACCTATTGTGTTG-3』 (SEQ ID NO:1)和引物 5，-TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3，(SEQID NO:2)定性擴增病毒核酸，擴增產物純化後克隆至PMD18-T載體中，陽性克隆測序確定目的片段是否正確插入並確定插入方向，提取重組質粒PMD18-T-KP質粒並利用紫外分光光度計測定A260，對KP-DNA進行定量以製備相應的陽性質控品；其特徵還在於陽性質控品包含下列序列或80%同源的核苷酸序列:GCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGA。根據本發明一個優選的實施方案，其中陰性質控品為生理鹽水、正常人或其它病毒感染者的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液樣本。根據本發明一個優選的實施方案，其中陽性質控品為重組質粒pMD18-T-KP或KP陽性的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液樣本，用於實際檢測中的質量控制。根據本發明一個優選的實施方案，用DNA提取試劑進行陰性質控品、待測樣本(咽拭子，鼻咽分泌物或痰液)的DNA提取，DNA提取試劑除本發明提及的方法外，還可以使用其它成熟的DNA提取方法和試劑盒。根據本發明一個優選的實施方案，將提取的DNA和陽性質控品加入到含有KP PCR反應液A和KP PCR反應液B的KP-PCR反應管中，進行RT-PCR擴增，使用螢光定量PCR檢測儀進行檢測。根據本發明一個優選的實施方案，其特徵還在於試劑盒檢測機理為有一條兩端標記有螢光基團和淬滅基團的特異性螢光探針與目標序列上遊弓I物和下遊弓I物之間的序列配對，螢光基團連接在探針的5』末端，淬滅基團則在3』末端，當完整的探針與目標序列配對時，螢光基團發射的螢光因與3』端的淬滅基團接近而被淬滅；在進行延伸反應時，聚合酶的5』外切酶活性將探針進行酶切，使得螢光基團與淬滅基團分離；隨著擴增循環數的增力口，釋放出來的螢光基團不斷積累，螢光強度與擴增產物的數量呈正比關係。根據本發明一個優選的實施方案，針對肺炎克雷伯菌檢測中的特殊性，反應體系中引物最終濃度為0.4umol/ml,探針最終濃度為0.2umol/ml。根據本發明一個優選的實施方案，針對肺炎克雷伯菌檢測中的特殊性，反應體系中引物Mg2+最終濃度為3mM。根據本發明一個優選的實施方案，針對肺炎克雷伯菌檢測中的特殊性，反應體系中最終引物退火溫度為55攝氏度。根據本發明一個優選的實施方案，研製出用於肺炎克雷伯菌核酸檢測的試劑盒，其中KP試劑盒檢測標本的靈敏度至少可達到1.0X 102copies/ml。本發明與現有技術相比，具有如下優點:①靈敏度更高；②全封閉反應，提取DNA後，直接用於RT-PCR檢測，避免了汙染發生設置了 UNG酶+dUTP防汙染措施有效地防範了 PCR擴增產物的汙染，避免假陽性結果，提高臨床診斷依據的可靠性；④檢測速度快，整個過程僅需2小時；⑤操作簡單，可控性強，可進行大批量樣品檢測，有利於產業化。
圖1顯示KP試劑盒檢測肺炎克雷伯菌的條件設置。圖2顯示KP試劑盒檢測肺炎克雷伯菌時不同濃度樣本的擴增曲線，三個標本的Ct值均小於27，擴增曲線為S形，均能夠判定為陽性。圖3顯示KP試劑盒五個陰性標本的擴增曲線，均不具S形特徵，能夠判定為陰性。
圖4顯示KP試劑盒兩個陰性標本的擴增曲線，與螢光檢測閾值線沒有交點，能夠判定為陰性。圖5顯示陽性質控品擴增曲線。圖示擴增曲線為S型曲線，且CT值< 27，說明檢測體系有效擴增了肺炎克雷伯菌核酸。圖6顯示陰性質控品擴增曲線。圖示擴增曲線為較平直的折線，與螢光檢測閾值線沒有交點，且曲線不呈S型，說明檢測過程中沒有肺炎克雷伯菌核酸的汙染。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。實施例1:肺炎克雷伯菌的KP試劑盒檢測方法(I)標本採集、運送和保存由臨床醫師根據實際情況進行標本採集。可檢測的標本包括，咽拭子，鼻咽分泌物或痰液。採集方法如下:①咽拭子:用棉拭子取咽部分泌物，將棉拭子置入無菌玻璃管，密封送檢；②鼻咽分泌物:負壓下吸取鼻咽分泌物，密封送檢；③人痰液標本:無菌採集指導病患從呼吸道深部咳出痰(不可含有唾液)，裝於40ml無菌塑膠容器，蓋上容器蓋子，密封送檢。標本可立即用於測試，也可以保存於_70°C待測，保存期為6個月。標本運送採用0°C冰壺(2)標本處理咽拭子，鼻咽分泌物(鼻咽分泌物處理步驟同2、3、4)1.加滅菌生理鹽 水1.5ml到無菌玻璃管，充分震蕩搖勻，擠幹棉拭子，立即離心；或置4°C冰箱過夜；2.12，OOOrpm離心5分鐘；去上清，沉澱加滅菌生理鹽水Iml混勻，12，OOOrpm離心5分鐘；3.去上清，沉澱中加入50 μ I DNA提取液充分混勻，100°C恆溫處理10± I分鐘；4.12，OOOrpm 離心 5 分鐘，備用。痰液1.痰液中加入4倍體積的4% NaOH溶液，混勻後室溫或65水浴30分鐘；2.用槍頭或吸管混勻後吸取Iml至1.5ml離心管中，5，OOOrpm離心5分鐘；3.去上清，留沉澱及液體約20 μ 1，加入Iml I XPBS,混勻後12，OOOrpm離心5分鐘；4.去上清，沉澱中加入50 μ I DNA提取液充分混勻，100°C恆溫處理10± I分鐘；5.12，OOOrpm 離心 5 分鐘，備用。(3)核酸提取取出陰性質控品和處理過的標本，8，OOOrpm離心數秒，吸50 μ I至0.5ml滅菌離心管中，加入50 μ I DNA提取液充分混勻，100°C恆溫處理10± I分鐘。12，OOOrpm離心5分
鍾，備用。提取後的核酸樣品可直接用於後續PCR檢測或於_20°C保存。若保存一個月以上，最好存於_70°C。DNA提取試劑除本發明提及的方法外，還可以使用其他成熟的DNA提取方法和試劑。(4) RT-PCR 檢測取5ul上述核酸溶液加入至PCR反應液中，8000rpm離心數秒，螢光定量PCR上機。PCR反應條件設置為:50°C 2分鐘，I個循環；95°C 15分鐘，I個循環；94°C 15秒一55°C45秒(收集螢光)，40個循環。保存文件，運行(參見附圖1);設探針檢測模式設置為:Reporter Dye:FAM, Quencher Dye:N0NE, Passive Reference:N0NE。(5)結果分析分析條件設置:根據分析後圖像調節Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(用戶可根據實際情況自行調整，Start值可以在3 15、End值可設在5 20，調整陰性對照的擴增曲線平直或低於閾值線)，點擊Analysis自動獲得分析結果，在Report界面察看結果。(6)結果判定如果檢測樣品的擴增曲線無對數增長期或Ct值> 38，可判樣品為肺炎克雷伯菌陰性(參見附圖2和附圖3)；如果檢測樣品Ct值< 38，且曲線有明顯的對數增長期，可判樣品為肺炎克雷伯菌陽性(參見附圖4)。實施例2:肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒中質控品的配製及使用肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒中質控品包括陽性質控品和陰性質控品，用於臨床試驗中質量控制，KP陽性質控品離心後直接加樣上機，陰性質控品操作方法同待檢樣本。質量控制標準:要求在一次實驗中同時滿足以下條件——陽性質控品為陽性(參見附圖5)、陰性質控品為陰性(參見附圖6);否則，結果無效，需重新檢測。以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬於本發明的保護範圍。
序列表
<110〉中山大學達安基因股份有限公司
<120〉肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒(PCR-螢光探針法)
5
I <211〉 19 DNA <213〉人工序列 <220〉
<223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
I
gcgcgcacctattgtgttg<210〉 2
<211〉20
DNA <213〉人工序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
2
tcgctgtgcttgtcatcctt
3 19 <212〉 DNA 人工序列 <220〉
根據特定核苷 酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。
權利要求
1.一種實時螢光RT-PCR法檢測肺炎克雷伯菌的試劑盒，該試劑盒包括:(1)DNA提取液；PCR檢測試劑:KP PCR反應液A、KP PCR反應液B ;質控品:陰性質控品、KP陽性質控品，和(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中KP PCR反應液A由對應的PCR反應Buffer、正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、純水組成，其特徵在於用於靶多核苷酸擴增的正向和反向引物的序列分別是5 』 -GCGCGCACCTATTGTGTTG-3，和5』 -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3』 ； 靶多核苷酸擴增和監測體系的寡核苷酸探針的序列是5』 X-CCGTCTACACCCGGGCGCC-Y3』，其中X/Y表示螢光標記檢測體系，包括能夠與靶多核苷酸結合併且兩末端分別結合有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針。
2.根據權利要求1的試劑盒，其特徵還在於陰性質控品為生理鹽水、正常人或其它病毒感染者的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液樣本。
3.根據權利要求1的試劑盒，陽性質控品為重組質粒pGEM-T-KP或KP陽性的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液樣本，其特徵還在於陽性質控品包含下列序列或80%同源的核苷酸序列:GCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGA。
4.根據權利要求1的試劑盒，其特徵還在於RT-PCR反應酶系包含耐熱DNA聚合酶、UDG酶和dUTP。
5.根據權利要求1的試劑盒，其特徵還在於反應體系中引物最終濃度為0.4umol/ml，探針最終濃度為0.2umol/ml。
6.根據權利要求1的試劑盒，其特徵還在於反應體系中引物Mg2+最終濃度為3mM。
7.根據權利要求1的試劑盒，其特徵還在於反應體系中最終引物退火溫度為55攝氏度。
全文摘要
本發明涉及實時螢光PCR試劑盒，特別是涉及利用實時螢光PCR技術檢測肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)的試劑盒。試劑盒通過對樣本中的肺炎克雷伯菌進行檢測，可廣泛應用於肺炎克雷伯菌感染的輔助診斷。
文檔編號G01N21/64GK103160574SQ201110412000
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者李明, 肖湘文, 高秀潔, 陳華雲, 程鋼, 何蘊韶 申請人:中山大學達安基因股份有限公司