組織培養方法、蕨類培養方法及植物培植體的製作方法

2023-06-02 12:10:21 2

組織培養方法、蕨類培養方法及植物培植體的製作方法
【專利摘要】本發明是關於一種組織培養方法，包含：提供一碎裂的配子體；增生一愈傷組織，是培養該碎裂的配子體，使該碎裂的配子體增生該愈傷組織；經無配生殖再生一孢子體，是培養該愈傷組織於一培養液中，使該愈傷組織再生該孢子體。此外，本發明還提供一蕨類培養方法及一植物培植體。
【專利說明】組織培養方法、蕨類培養方法及植物培植體
【技術領域】
[0001]本發明關於一種培養方法，特別是關於一種維管束植物的組織培養方法，以及由該方法所獲得的植物培植體。
【背景技術】 [0002]維管束植物，包含蕨類，其與種子植物最大的不同在於利用孢子繁殖，並且具有世代交替的周期。該些維管束植物的孢子雖可藉由各種媒介(如風、水)散播於各處進行繁殖，然而，孢子在自然環境中的競爭力與耐受力均較差，易遭環境中的菌類競爭養分而降低發芽率，以致該些維管束植物的繁殖受阻，無法被廣為應用。例如骨碎補科iJMvalUaceae)及懈蕨科iPiyrmriaceae)蕨類植物，極具有藥用及食用價值，卻因其自然繁殖的能力較差，以致族群急劇減少，難以用於產品或藥品的開發，因此，有必要發展快速且有效培養該些維管束植物的培養方法。
[0003]公知技術多以無菌孢子播種作為快速繁殖該些維管束植物的方式。孢子播種是先將孢子經消毒殺菌處理，再培養於人工培養基進行萌發，然而孢子的萌發期較長，往往耗時甚久，又因該人工培養基與自然環境的差異，造成配子體世代發育不良，以致繁殖率差且植株存活率低，因而無法有效量產該些具有世代交替周期的維管束植物。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種蕨類培養方法，促使蕨類植物進行無配生殖(apogamy)，以有效再生孢子體。
[0005]本發明的另一目的是提供一種組織培養方法，誘發維管束植物進行無性繁殖，以有效量產該些維管束植物。
[0006]本發明的另一目的是提供一種組織培養方法，誘發維管束植物直接以體胚再生孢子體，以簡化培養過程並改善孢子體發育。
[0007]本發明的另一目的是提供一種植物培植體，可進行無配生殖，直接再生孢子體，以利於維管束植物的量產。
[0008]本發明另提供一種組織培養方法，包含:提供一碎裂的配子體；增生一愈傷組織，是培養該碎裂的配子體，使該碎裂的配子體增生該愈傷組織；以及再生一孢子體，是培養該愈傷組織於一培養液中，使該愈傷組織再生該孢子體。
[0009]為達前述目的，本發明一實施例是提供一種蕨類培養方法，包含:提供一碎裂的蕨類配子體；增生一愈傷組織,是培養該碎裂的蕨類配子體,使該碎裂的蕨類配子體增生該愈傷組織；以及再生一孢子體，是培養該愈傷組織於一培養液中，使該愈傷組織再生該孢子體。
[0010]於本發明一實施例中，該增生愈傷組織包含誘發該碎裂的配子體產生該愈傷組織，以及增殖所產生的該愈傷組織。
[0011]於本發明一實施例中，該再生孢子體包含誘發該愈傷組織形成該孢子體，以及誘使形成的該孢子體進一步生長。
[0012]於本發明一實施例中，該培養液包含I至5wt%碳源。
[0013]於本發明一實施例中，該培養液包含1/2MS基礎鹽類培養基與20克/升的蔗糖。
[0014]於本發明一實施例中，該再生孢子體包含培養該愈傷組織於一第一培養液，誘發該愈傷組織形成該孢子體，以及再培養形成的該孢子體於一第二培養液，使該孢子體進一步生長，該第二培養液與該第一培養液具有不同的配方。
[0015]於本發明一實施例中，該第一培養液包含一細胞分裂素，該細胞分裂素選自由異戊烯基腺嘌呤、6-苄氨基嘌呤及激動素組成的群組。
[0016]於本發明一實施例中，再生該孢子體的步驟包含震蕩培養該愈傷組織。
[0017]於本發明一實施例中，還包含馴化該孢子體，是將該孢子體移植至一介質且培育成一植株。
[0018]於本發明一實施例中，該組織培養方法還包含馴化該孢子體，是自該培養液中分出該孢子體並進行移植。
[0019]本發明另提供一種植物培植體，複數個集結成一團塊的愈傷組織，該團塊的愈傷組織具有0.19至0.25公分的直徑。
[0020]於本發明一實施例中，該植物培植體是經以下步驟而獲得:提供一碎裂的配子體；培養該碎裂的配子體，使該碎裂的配子體誘發一愈傷組織產生；以及增殖產生的該愈傷組織，使該愈傷組織集結成球狀，以獲得該植物培植體。
[0021]為讓本發明的上述目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，並配合所附圖式，作詳細說明如下。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1至圖4為本發明一實施例的組織培養方法的階段流程示意圖；
圖5為本發明另一實施例的組織培養方法的示意圖。
[0023]主要組件符號說明 100 配子體
150 愈傷組織 200 培養基 300 球狀愈傷組織 350 孢子體 400 培養液 S1-S5 步驟 S41-S42 步驟。
【具體實施方式】
[0024]為使熟習本發明所屬【技術領域】的一般技藝者能更進一步了解本發明，下文特詳細說明本發明的構成內容及所欲達成的功效，其較佳實施方式與圖式僅供參考與說明用，並非用來對本發明加以限制者。下文已公開足夠的細節俾使該領域的一般技藝人士得以具以實施。當然，本發明中亦可採行 其他的實施例，或是在不悖離文中所述實施例的前提下作出任何順序性及邏輯性的改變。
[0025]本發明是建立一種維管束植物的量產途徑，如蕨類植物等，其主要透過體胚再生的方式再生孢子體(sporophyte regeneration),進而可在短時間內達到快速生長的效果。因該孢子體是透過體胚發生而非由器官發生，是以可省去孢子萌芽、髮根等耗時程序，藉此，本發明可有效縮短維管束植物的培育時間，提升植株存活率，以利大規模生產具經濟價值的維管束植物。
[0026]本發明的組織培養方法是選用維管束植物的配子體作為培植體，將該配子體切碎並培養於一培養基內，誘發該配子體產生胚性愈傷組織(embryogenic calluses)並大量增殖產生的胚性愈傷組織(embryogenic calluses),以形成球狀的愈傷組織。之後,再使該胚性愈傷組織經無配生殖途徑直接再生孢子體(sporophyte regeneration),藉此,可改善該孢子體的誘發率，並且提升馴化(acclimatization)後植株的存活率，其中，經再生而得的孢子體，經倍數檢查為二倍體。
[0027]圖1至圖4繪示本發明一較佳實施例的組織培養方法的階段流程圖，如圖1所示，該組織培養方法先提供一維管束植物的配子體並破壞其組織(步驟SI)，其中該維管束植物包含配子體世代發達的維管束植物，可以是蕨類等，較佳，為具有藥用性的蕨類，如骨碎補科蕨類。而該配子體可以由無菌孢子播種或是經其他培養方式獲得，其獲得方法並不構成本發明的限制要件。本發明 所指的破壞，乃是利用劃破、切碎、搗碎或撕裂等手段，破壞該配子體的組織，使其產生創傷，然而破壞該配子體的手段並不以前述手段為限。
[0028]再如圖1及圖2所示,誘導愈傷組織150產生(embryogenic calluses),是將受創傷的配子體100培養於一培養基200中，使配子體100產生愈傷組織150 (即步驟S2)。其中，配子體100的培養，較佳，是在培養過程中可持續且均勻地接觸培養基200，因此，可利用懸浮培養及震蕩培養等方式但不以此為限。此外，配子體100在培養過程中需充足的基礎鹽類(包含氮鹽、磷鹽、鉀鹽及鈣鹽等)及養分，較佳，是定期繼代培養一次，如20至40天繼代培養一次，更佳為30天，可有效率地產生愈傷組織150。培養基200除基礎鹽類(包含氮鹽、磷鹽、鉀鹽及鈣鹽等)外，還可包含減量的碳源，較佳為l_5wt%碳源，有利於愈傷組織150產生，另外，培養基200也可選擇包含一植物生長調節劑，如萘乙酸(1-Naphthaleneaceticacid;簡稱NAA)、激動素(6-Furfurylamino-purine;簡稱kinetin)或細胞分裂素(包含異戊烯基腺嘌呤及6-苄氨基嘌呤)等，以進一步誘導愈傷組織150產生。
[0029]之後，增殖所產生的愈傷組織150 (proliferating embryogenic calluses),是分出產生的愈傷組織150並進一步培養於培養基200中(即步驟S3)，此階段的培養除對基礎鹽類及養分需求稍高之外，其餘培養條件與前述步驟S2並無不同。為使愈傷組織150在培養過程中可迅速地增殖，較佳是每10至20天繼代培養一次，更佳為每15天繼代一次。較佳地,愈傷組織150可迅速增殖併集結成一團塊，最後形成一球狀愈傷組織300，如圖3所示。球狀愈傷組織300，較佳，具有0.19至0.25公分，最佳，為0.24公分，以作為再生孢子體的培植體，應用於量產維管束植物的培養方法。
[0030]請參照圖1及圖4所不，再生抱子體350 (sporophyte regeneration)，是培養球狀愈傷組織300於一培養液400，誘導球狀愈傷組織300再生孢子體350 (即步驟S4)。其中，球狀愈傷組織300較佳是在培養過程中可持續且均勻地接觸培養液400，因此，可利用震蕩培養的方式進行培養但不以此為限。球狀愈傷組織300在培養過程中需充足的基礎鹽類(包含氮鹽、磷鹽、鉀鹽及鈣鹽等)、減量的碳源(例如I~5wt%碳源)及養分，較佳是10至20天繼代培養一次，更佳為每15天繼代一次，以有效率地再生孢子體350。本實施例的培養液400，較佳，可包含一細胞分裂素，如異戊烯基腺嘌呤及6-苄氨基嘌呤等，以促進球狀愈傷組織300再生孢子體350。
[0031]最後，進行孢子體350的馴化(acclimatization),將孢子體350自球狀愈傷組織300上逐一分出，並移植(transplanting)至一介質(未繪示)進行培育，即可長成植株(即步驟S5)。其中，該介質為適合培養各類維管束植物的培養材料，可依據培養植物的不同而有所差異，該介質較佳，為滅菌後的混合材料，包含水苔、蛭石、木炭、腐葉及碎磚等。
[0032]綜上所述，本發明的組織培養方法是誘發創傷的配子體產生球狀的胚性愈傷組織(generating and proliferating embryogenic calluses),再進一步促使該胚性愈傷組織經無配生殖途徑直接產生孢子體(regeneration sporophyte) ?該方法操作簡單、便利，僅利用創傷配子體及培養液即可誘導維管束植物的體胚再生，因而有效省去孢子髮根所耗費的時間與繁瑣的操作步驟，是以可應用於大量且穩定地培育各類維管束植物種苗，包含各種蕨類等。
[0033]圖5則繪示本發明另一較佳實施例的組織培養方法，其與本發明前述較佳實施例的差異，在於本較佳實施例的步驟S4還包含:誘發孢子體(sporophyte induction ；步驟S41)及增殖孢子體(sporophyte proliferation ;步驟S42)。其中，誘發孢子體(sporophyte induction),是培養球狀愈傷組織於一第一培養液,誘導該球狀愈傷組織再生孢子體。此時，該球狀愈傷組織，較佳，是利用震蕩培養的方式培養，且每10至20天繼代培養一次，更佳為每15天繼代一次，但不以此為限。
[0034]該第一培養液包含基礎鹽類(包含氮鹽、磷鹽、鉀鹽及鈣鹽等)、減量的碳源(如I至5wt%碳源，較佳為2wt%)及一細胞分裂素，如異戊烯基腺嘌呤或6-苄氨基嘌呤等，以提升孢子體再生。增殖孢子體，則是待球狀愈傷組織長出孢子體後，再移至一第二培養液進行培養，該第二培養液包含基礎鹽類(包含氮鹽、磷鹽、鉀鹽及鈣鹽等)及減量的碳源(如I至5wt%碳源，較佳為2wt%)等，且不含任何細胞分裂素或植物生長調節劑，使孢子體可迅速生長，以整體提升培養效率。`
[0035]本實施例是分別於兩階段進行孢子體的再生誘發與生長，因該孢子體在誘發期與增殖期所需養分略有不同，因此，本實施例可更進一步提升孢子體的增殖率，以提升整體培養的效率與質量。
[0036]以下為本發明的組織培養方法的一實施樣態，是培養一骨碎補科(Davalliaceae)的蕨類植物，如海州骨碎補{Davallia mariesii)。本實施樣態是自該蕨類植物連同葉片取下未成熟孢子，消毒之後移往無菌播種培養基進行培育，待孢子萌芽後每隔一個月繼代一次，以形成該原葉體，然而該原葉體的取得方式並不因此為限。
[0037]實施樣態I
將該原葉體切碎至0.1至0.2公分寬，再懸浮培養於一培養基，該培養基包含1/2MS基礎鹽類培養基(Murashige and Skoog, 1962 ;配方如第I表所示)，然而在其他實施樣態中，該培養基200也可包含Knop基礎鹽類培養基(Murashige and Skoog, 1962)或Knudson基礎鹽類培養基(Knudson，1946)等。更詳言之，總重0.1公克的原葉體是培養於10毫升的1/2MS基礎鹽類培養基中，以每分鐘轉速85(rpm)的條件震蕩培養40至80日，較佳在23°C至25°C及11至14光照單位(μmolm-2s-1 )下震蕩培養為60日(光照周期為16小時光照，8小時黑暗)，並且於培養期間每隔30日繼代培養一次。
[0038]在本發明另一實施樣態中，該培養基包含1/2MS基礎鹽類培養基、O至5毫克/升(mg/1)萘乙酸或O至5毫克/升(mg/1)激動素,或者同時包含O至5毫克/升(mg/1)萘乙酸及O至5毫克/升(mg/1)激動素，最佳情況為同時包含I mg/1萘乙酸及I mg/1激動素，可使愈傷組織的誘發率達到223.3%。
[0039]第I表:1/2 MS基礎鹽類培養基
【權利要求】
1.一種蕨類培養方法，包含: 提供一碎裂的蕨類配子體； 增生一愈傷組織，是培養該碎裂的蕨類配子體，使該碎裂的蕨類配子體增生該愈傷組織；以及 再生一孢子體，是培養該愈傷組織於一培養液中，使該愈傷組織再生該孢子體。
2.—種組織培養方法，其特徵在於，包含: 提供一碎裂的配子體； 增生一愈傷組織，是培養該碎裂的配子體，使該碎裂的配子體增生該愈傷組織；以及 再生一孢子體，是培養該愈傷組織於一培養液中，使該愈傷組織再生該孢子體。
3.如權利要求2所述的組織培養方法，其特徵在於，該增生愈傷組織的步驟包含誘發該碎裂的配子體產生該愈傷組織，以及增殖所產生的該愈傷組織。
4.如權利要求2所述的組織培養方法，其特徵在於，該再生該孢子體的步驟包含誘發該愈傷組織形成該孢子體，以及誘使形成的該孢子體進一步生長。
5.如權利要求2所述的組織培養方法，其特徵在於，該培養液包含I至5wt%碳源。
6.如權利要求5所述的組織培養方法，其特徵在於，該培養液包含1/2MS基礎鹽類培養基及20公克/升的蔗糖。
7.如權利要求2所述的組織培養方法，其特徵在於，再生該孢子體的步驟包含培養該愈傷組織於一第一培養液，誘發該愈傷組織形成該孢子體，以及再培養形成的該孢子體於一第二培養液，使該孢子體進一步生長，該第二培養液與該第一培養液具有不同的配方。
8.如權利要求7所述的組織培養方法，其特徵在於，該第一培養液包含一細胞分裂素，該細胞分裂素選自由異戊烯基腺嘌呤、6-苄氨基嘌呤及激動素組成的群組。
9.如權利要求2所述的組織培養方法，其特徵在於，還包含馴化該孢子體，是自該培養液中分出該孢子體並進行移植。
10.如權利要求2所述的組織培養方法，其特徵在於，再生該孢子體的步驟包含震蕩培養該愈傷組織。
11.如權利要求2所述的組織培養方法，其特徵在於，還包含馴化該孢子體，是將該孢子體移植至一介質且培育成一植株。
12.一種植物培植體，其特徵在於，包含複數個集結成一團塊的愈傷組織，該團塊的愈傷組織具有0.19至0.25公分的直徑。
13.如權利要求12所述的植物培植體，其特徵在於，該植物培植體是經以下步驟而獲得: 提供一碎裂的配子體； 培養該碎裂的配子體，使該碎裂的配子體誘發一愈傷組織產生；以及 增殖產生的該愈傷組織，使該愈傷組織集結成球狀，以獲得該植物培植體。
【文檔編號】A01H4/00GK103583366SQ201310582298
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】郭洲獎, 何錦玟, 王凱平, 吳俞璇, 蔡羽婷 申請人:華映視訊（吳江）有限公司, 中華映管股份有限公司