一株海洋真菌鏈格孢屬mnp801及其應用的製作方法

2023-06-02 11:20:06 1

專利名稱：一株海洋真菌鏈格孢屬mnp801及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株海洋真菌-鏈格孢屬(Alternaria sp. )MNP801,及其在製備抗
腫瘤藥物和胰蛋白酶抑制劑中的應用。
背景技術：
尋找生理活性強的物質發展成為抗癌、抗菌、抗氧化等藥物是人類攻克疾病的主要工作之一。海洋環境苛刻，具有低溫、低照、高鹽、高壓和寡營養等特點，海洋微生物由於棲息於這樣的極限環境下，產生了與陸地生物完全不同的代謝系統和機體防禦系統，所以能產生許多結構新穎、活性特異的次級代謝產物，研究發現它們許多成分也具有抗癌，抗菌等藥用價值，並且許多特異的化學結構類型是在陸地微生物中難以發現的。細胞培養法是篩選抗腫瘤藥物比較常用的一種篩選方法，常用的有MTT法等。

發明內容
本發明目的是提供一株具有抗腫瘤和酶抑制活性的海洋真菌——鏈格孢屬(Alternaria sp. ) MNP801 及其應用。本發明採用的技術方案是一株海洋真菌-鏈格孢屬(Alternaria sp. )MNP801,保藏於中國典型培養物保
藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCC No :M2012288，保藏日期2012年7月18日。本發明還涉及所述的鏈格孢屬MNP801在製備抗腫瘤藥物中的應用，具體為所述鏈格孢屬MNP801提取物在製備抗腫瘤藥物中的應用。所述抗腫瘤藥物具體可為治療肝癌或神經癌的藥物。所述的鏈格孢屬MNP801在製備胰蛋白酶抑制劑中的應用，具體為所述鏈格孢屬MNP801提取物在製備胰蛋白酶抑制劑中的應用。優選的，所述提取物為乙酸乙酯提取物，由如下方法製得將鏈格孢屬MNP801接種至液體發酵培養基中，於25 35°C、15(T210r/min振蕩條件下培養14 30(1，得到發酵液，將發酵液經細胞破碎後，離心取濾液用乙酸乙酯萃取，濃縮得浸膏(密度為I. 2^1. 7g/ml),即為所述鏈格孢屬MNP801的乙酸乙酯提取物；所述發酵培養基組成為麥芽浸粉3. 0 7. Og/L,麥芽糖I. 5 2. Og/L,葡萄糖3. 0 7. Og/L,酵母浸粉0. 8 I. 5g/L，溶劑為水。具體的，所述乙酸乙酯提取物可按如下方法獲得a.海洋真菌MNP801的種子培養挑取海洋真菌MNP801菌株接入種子培養基，於25-35°C、150-210r/min培養48h，得到種子液；種子培養基組成如下麥芽浸粉3. (T7. Og/L,麥芽糖I. 5^2. Og/L,葡萄糖3. (T7. 0g/L，酵母浸粉0. 8^1. 5g/L，溶劑為水；b.海洋真菌MNP801的發酵培養將上述種子液接入發酵培養基，於25 35°C、15(T210r/min培養21d，得到發酵液；發酵培養基組成如下麥芽浸粉3. (T7. Og/L,麥芽糖I. 5^2. Og/L,葡萄糖3. (T7. Og/L,酵母浸粉0. 8 1.5g/L，溶劑為水；c.將上述培養好的發酵液超聲破碎；d.將上述破碎好的發酵液過濾除去菌體；e.將上述過濾好的發酵液(濾液)，用乙酸乙酯萃取，濃縮揮幹制的浸膏(I)；f.將上述菌體冷凍乾燥，甲醇浸泡後，過濾除去菌體，濾液濃縮揮幹，加入水成水溶液，用乙酸乙酯萃取，濃縮揮幹制的浸膏(2)；g.將上述浸膏(1)，浸膏(2)合併，即得到發酵液的提取物。
經實驗驗證，本發明海洋真菌MNP801的乙酸乙酯提取物胰蛋白酶抑制活性IC5tl(ug/ml)為301. 56 ;對卩(12腫瘤細胞的半抑制率濃度IC50 (ug/ml)為92. 97，對HepG-2腫瘤細胞的半抑制率濃度IC5tl (ug/ml)為88. 81。本發明的有益效果主要體現在提供了一株具有抗腫瘤和酶抑制活性的海洋真菌，具有抗H印G-2腫瘤細胞(肝癌細胞)和PC12腫瘤細胞(神經癌細胞)作用，同時具有胰蛋白酶抑制活性，為新藥研發提供了基礎。


圖I為平板培養基上海洋真菌MNP801的菌落形態；圖2為光學顯微鏡下海洋真菌MNP801的菌體形態。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例I :( I)海洋真菌MNP801的種子培養挑取海洋真菌MNP801菌株(CCTCC No:M2012288)接入種子培養基，於28°C、200r/min培養48h，得到種子液；種子培養基組成如下麥芽浸粉6. Og/L,麥芽糖I. 8g/L，葡萄糖6. Og/L，酵母浸粉I. 2g/L，溶劑為水；(2)海洋真菌MNP801的發酵培養將上述種子液以10%體積比接入發酵培養基，於28°C、200r/min培養21d，得到發酵液；發酵培養基組成如下麥芽浸粉6. 0g/L,麥芽糖I. 8g/L，葡萄糖6. 0g/L,酵母浸粉1.2g/L，溶劑為水；(3)有效成分提取將上述培養好的發酵液於細胞破碎儀下超聲破碎，然後過濾除去菌體，取濾液用等體積乙酸乙酯萃取，濃縮揮幹製得浸膏I (密度約為I. 5g/ml)將上述菌體冷凍乾燥，甲醇浸泡後，過濾除去菌體，濾液濃縮揮幹，加入水成水溶液，用乙酸乙酯萃取，濃縮揮幹制的浸膏2 (密度約為I. 5g/ml)；g.將上述浸膏1，浸膏2合併，即得到發酵液的乙酸乙酯提取物。實施例2 :海洋真菌提取物的酶抑制，抗腫瘤活性試驗I.胰蛋白酶抑制活性測試
(I)胰蛋白酶抑制活性測試所需試劑的配製配製IOOOmlO. lmol/L的Tris-HCl緩衝液(三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液)加入6. 057g三羥甲基氨基甲烷、0. lmol/L的鹽酸385ml及I. 1099g CaCl2於蒸餾水中，並定容
至Ho配製25ml2mM底物BAPNA (Na-苯甲醯-DL-精氨酸-對硝基醯胺鹽酸鹽):稱取底物BAPNAO. 0217g於容量瓶中，使用0. lmol/L的Tris-HCl緩衝液將其定容至25ml。配製50ml2mg ml/1的胰蛋白酶稱取胰蛋白酶0. Ig於50ml容量瓶中，使用
0.lmol/L的Tris-HCl緩衝液將其定容至50ml。最後配製30% (v/v)乙酸用於停止反應。
(2)胰蛋白酶抑制活性法測定活性將樣品提取物配成100 V- g mL_1 > 50 u g mL_1>25 u g mL'12. 5 y g mL'6. 25 ug -mr1等5個不同的濃度，於96孔板中加入待測樣品50 y L (Tris緩衝液溶解)，用等體積的緩衝液作為對照組，然後在樣品組和對照組中加入預先於37°C水浴孵化IOmin的2mg 胰蛋白酶50 ii L和2mM底物BAPNA100 u L，37°C保溫反應30min後，再加入30%乙酸50 ii L終止反應；空白組則在乙酸終止反應之後，再加入底物BAPNA，其餘操作同上，酶標儀405nm下檢測OD。按下式計算抑制率抑制率(%)==[1 -(樣品組OD —空白組0D)/(對照組OD —空白組0D) ] X 100%用SPSS軟體測得海洋真菌MNP801的提取物胰蛋白酶抑制活性IC5tl (ug/ml)為301.53ug/ml。2.體外抗腫瘤活性測試採用H印g2，PC12兩種腫瘤細胞系,進行MTT試驗(I)取對數生長期的細胞，用0. 25%胰酶消化製成單細胞懸液，用含血清10%的RPM1640培養基，調節細胞濃度為2X IO5個/ml，每孔IOOul細胞懸液的量加入至96孔細胞培養板，在飽和溫度37°C、5%C02培養箱中培養；(2) 12h後，吸棄培養基，對照組加入100ul2%的RPM1640培養基；空白組加入IOOu12%的RPM1640培養基；給藥組加入不同濃度梯度，即50，100, 200,400,800ug/ml的供試樣品，各組均為5個復孔，繼續培養48h ；(3)在實驗結束前4h，每孔加入20ulMTT (四甲基偶氮唑鹽，5mg/ml，用PBS緩衝液配製)，繼續在37°C、5%C02培養箱中培養4h ；(4)小心吸棄上清,每孔各加入150ul 二甲基亞碸(DMS0),振蕩，酶標儀490nm處測定OD值。按下述公式計算抑制率抑制率(%)==[1 -(樣品組OD —空白組0D)/(對照組OD —空白組0D) ] X 100%用SPSS軟體測得海洋真菌MNP801的提取物對PC12腫瘤細胞半抑制率濃度IC5tl值為92. 97ug/ml，提取物對H印G-2腫瘤細胞的半抑制率濃度IC5tl值為88. 8lug/ml 0
權利要求
1.一株海洋真菌——鏈格孢屬(Alternaria sp. )MNP801，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號CCTCC No :M2012288，保藏日期2012年7月18日。
2.如權利要求I所述的鏈格孢屬MNP801在製備抗腫瘤藥物中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述抗腫瘤藥物為治療肝癌或神經癌的藥物。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述鏈格孢屬MNP801提取物在製備抗腫瘤藥物中的應用。
5.如權利要求I所述的鏈格孢屬MNP801在製備胰蛋白酶抑制劑中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述鏈格孢屬MNP801提取物在製備胰蛋白酶抑制劑中的應用。
7.如權利要求4或6所述的應用，其特徵在於所述提取物為こ酸こ酯提取物，由如下方法製得將鏈格孢屬MNP801接種至液體發酵培養基中，於25 35°C、15(T210r/min振蕩條件下培養14 30d，得到發酵液，將發酵液經細胞破碎後，離心取濾液用こ酸こ酯萃取，濃縮得浸膏，即為所述鏈格孢屬MNP801的こ酸こ酯提取物；所述發酵培養基組成為麥芽浸粉3.0 7. Og/L,麥芽糖I. 5 2. Og/L,葡萄糖3. 0 7. Og/L,酵母浸粉0. 8 I. 5g/L，溶劑為水。
全文摘要
本發明提供了一株具有抗腫瘤和酶抑制活性的海洋真菌——鏈格孢屬(Alternaria sp.)MNP801及其應用。該菌株保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC No:M2012288，保藏日期2012年7月18日。本發明的有益效果主要體現在，提供了一株具有抗腫瘤和酶抑制活性的海洋真菌，具有抗HepG-2腫瘤細胞和PC12腫瘤細胞作用，同時具有胰蛋白酶抑制活性。
文檔編號C12N1/14GK102952756SQ20121030192
公開日2013年3月6日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者王鴻, 陳俊, 謝燕瑾 申請人:浙江工業大學