一種複合β-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的製作方法

2023-06-02 11:26:46

專利名稱：：一種複合β-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的製作方法
技術領域：
：本發明屬於家禽飼料添加劑領域，具體涉及一種複合e-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑，及其在蛋雞飼料中的應用。
背景技術：
：目前大多數蛋雞飼料原料中含有較多的抗營養因子，不但影響動物的消化利用率，還造成飼料資源的浪費及環境的汙染。此外，雞蛋產品還存在藥物、激素、有毒有害物質超標，養殖環境的惡化等問題，已成為影響我國蛋雞養殖業持續發展的瓶頸。研究、開發和利用"綠色"、"安全"、"環保"的飼料應為解決上述問題的有效途徑。中國專禾U《供成年期肉雞專用的非常規蛋白複合雞飼料》(申請號200910016608.2)公開了含有P_甘露聚糖酶、木聚糖酶和小麥型複合酶等酶製劑組成的肉雞飼料。中國專利《一種飼用複合阿魏酸酯酶添加劑及其使用方法》(申請號200810101057.5)公開了由阿魏酸酯酶、纖維素酶、術聚糖酶和葡聚糖酶4種酶組成的酶添加劑。他們都只是單純酶製劑的混合，沒有與乳酸菌的益生效應進行疊加，因此飼養效果受到影響。|3-甘露聚糖酶、木聚糖酶、13-葡聚糖酶、纖維素酶及果膠酶的主要作用是降解飼料原料中P-甘露聚糖、木聚糖、13-葡聚糖、纖維素及果膠等的抗營養作用，提高日糧營養物質的消化利用率。屎腸球菌屬於乳酸菌，是益生菌製劑的一種，屬於腸道共生菌，代謝能產生乳酸及一些抗菌物質。其主要作用是促進動物機體腸道微生態平衡，提高有益菌的數量，降低有害菌的數量，提高機體免疫力。
發明內容本發明目的在於提供一種複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑，該添加劑能夠降解飼料中的抗營養因子，補充內源性消化酶功能的不足，提高蛋禽對日糧營養物質的消化利用率；減少蛋雞糞中有機物質的排洩量，降低環境汙染，改善養殖環境；減少後腸有害微生物的生長繁殖和粘性糞便的發生率，改善雞隻的健康狀況，降低髒蛋率，促進蛋雞腸道微生態平衡，提高機體免疫力；提高料蛋比和蛋雞產蛋率，降低飼養成本；縮小不同批次原料質量的差異性，穩定飼料產品的質量。本發明另一目的是提供上述複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑在蛋雞飼料中的應用。本發明還一目的是提供一種屎腸球菌菌株。為了實現上述目的，本發明的技術方案為—種複合|3_甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑，其組成成份及其重量份為P-甘露聚糖酶28木聚糖酶2430P-葡聚糖酶9154纖維素酶2833果膠酶2027屎腸球菌發酵液90110。上述複合|3_甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑，其組成成份及其重量份優選為P-甘露聚糖酶4木聚糖酶27P-葡聚糖酶13纖維素酶31果膠酶24屎腸球菌發酵液101。上述複合P-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的製備方法，按照比例將P-甘露聚糖酶、木聚糖酶、P_葡聚糖酶、纖維素酶和果膠酶混合均勻，然後按照比例加入屎腸球菌發酵液，混合均勻，再在45t:條件下烘乾，使水分含量《10%，即得複合e-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑。上述複合|3_甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑中所述的屎腸球菌發酵液中屎腸球菌的活菌數為^5Xl(TCFU/mL。上述複合|3_甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑中所述各種酶，其原料酶活分別為P_甘露聚糖酶的酶活為1700U/g，木聚糖酶的酶活為>50000U/g;13-葡聚糖酶的酶活性為^8000U/g，纖維素酶的酶活性為^10000U/g，果膠酶的酶活性為^20000U/g。酶活定義1個酶活力單位是指在特定條件下，在1分鐘內能轉化1微摩爾底物的酶量，或是轉化底物中1微摩爾的有關基團的酶量。所述的|3-甘露聚糖酶、木聚糖酶、13-葡聚糖酶、纖維素酶和果膠酶均可從市場上購買。其中P-甘露聚糖酶也可根據中國專利《一種甘露聚糖酶及其編碼基因與應用》(專利號ZL200510103125.8)所述的方法製備。上述屎腸球菌發酵液中的屎腸球菌可以是屎腸球菌菌株(Enterococcusfaecium)Efl008，該菌株已於2009年12月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.3537。所述的屎腸球菌菌株Ef1008是從蛋雞腸道中篩選鑑定的，乳酸產量^6g/L發酵液，對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、沙門氏菌的抑菌圈直徑^18mm。所述的屎腸球菌發酵液，按照如下方法製備按照2%的重量百分比將屎腸球菌菌種接種於MRS培養基上，在37°C，160rpm條件下培養9小時，即得屎腸球菌發酵液；所得屎腸球菌發酵液中屎腸球菌的活菌為^5X10"CFU/mL;其中所述的MRS培養基的組成成分及其含量為蛋白腖10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、K2HP042g/L、檸檬酸氫二銨2g/L、葡萄糖20g/L、乙酸鈉5g/L、吐溫-80lmL，MgS047H200.58g/L、MnS044H200.25g/L，用Imol/LNaOH調節pH為7.2，115。C滅菌30min。上述屎腸球菌菌種可以是Ef1008。上述複合P-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑可用於在蛋雞飼料中應用，其在蛋雞飼料中的添加比例為0.03%0.1%。含有上述複合|3_甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的蛋雞飼料，其中複合13_甘5露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的重〗及預混料及其重量份為:百分比為o.03%o.1%，其中基礎飼料的組成成份為1300玉米小麥豆粕菜籽粕棉籽粕石粉3015153350352588891-1.50.050.05150.10.1預混料所述的基礎日糧的製備方法，將上述組分按照重量份混合均勻即可。所述的預混料的組成為每千克預混料提供維生素D3為2040萬IU，維生素E3000IU，維生素K3為200400mg，維生素B:為>160mg，維生素B2為>700mg，維生素B6為>300mg/Kg，維生素B12為>1.8mg，生物素為>12mg，煙酸為>2200mg，泛酸為^900mg，葉酸為^70mg。預混料可於市場上購買，如可於北京偉嘉人生物技術有限公司購買。上述蛋雞飼料中所述的基礎日糧組份和預混料均可從市場上購買。所述的屎腸球菌Efl008的篩選及鑑定過程無菌採集5日齡健康蛋雞迴腸黏膜，用滅菌的載玻片刮取迴腸黏液，用滅菌生理鹽水稀釋104倍，取0.lmL接種於EC培養基(EC培養基的組成成份及其比例為胰蛋白腖2g，酵母浸膏0.5g，葡萄糖0.2g，Na2HP040.4g，K2HP040.4g，瓊脂2g，雙蒸水100ml，pH7.4，冷至4550°C。加入NaN3至終濃度為0.4mg/ml，2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)O.lmg/ml，倒平板。)平板上，37。C厭氧培養24h，挑取紫紅色，表面光滑凸起，周邊整齊，直徑1.01.5mm的菌落，傳代於EC基礎斜面培養基，塗片，革蘭氏染色鏡檢，篩選G+，圓形或卵圓形，單個、成對或短鏈狀排列的菌株。然後將篩選菌株再在MRS平板上劃線接種純培養。在MRS液體培養基中培養16h，取樣測乳酸產量，對大腸桿菌K88做抑菌實驗，培養液在80。C水浴10min，取原液0.4mL塗板挑取80。C水浴存活的菌種接到斜面上，選取80°C水浴存活的，乳酸產量^6g/L發酵液，並且對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、沙門氏菌的抑菌圈直徑^18mm的菌株，篩選得到屎腸球菌菌株Efl008，凍存，採用40%的甘油作為保護劑。屎腸球菌Efl008的形態特徵為表面光滑凸起，周邊整齊，直徑1.01.5mm的菌落，並篩選G+，圓形或卵圓形，短鏈狀排列，這些和屎腸球菌的形態特徵相符合。屎腸球菌Efl008為革蘭氏陽性菌，能在l(TC和45t:生長，發酵葡萄糖產酸，可生長於6.5%NaCl和40%膽汁鹽環境中，精氨酸產氨，不分解鼠李糖、松三糖和山梨醇，能分解蔗糖、密二糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖，對慶大黴素、卡那黴素、多粘菌素和鏈黴素不敏感，對青黴素、紅黴素、萬古黴素，和阿莫西林敏感。這些特性與屎腸球菌的生理生化特徵相符合，因此可確定菌株Ef1008為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。對屎腸球菌Ef1008的16SrDNA進行測序(見序列表SECIDNo:1)，並對測得的序6列應用BLAST程序與資料庫中已發表的屎腸球菌16SrDNA序列(AccessionNo.AY675247)進行相似性比較，同源性均為99%，說明篩選的菌株Efl008經16SrDNA鑑定為屎腸球菌，並且和其他菌株不同。本發明具有的優點(1)、本發明可使蛋雞產蛋率高，料蛋比高，主要是其中所含的P-甘露聚糖酶、木聚糖酶、e-葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶能降低飼料原料中P-甘露聚糖、木聚糖、P_葡聚糖、纖維素及果膠的抗營養作用，使動物對其利用率大大提高，降低了飼料成本；(2)、本發明屎腸球菌屬於腸道共生的乳酸菌，生長速度快，培養保存條件要求小，粘附能力強，乳酸及細菌素等抗菌物質產量高，能夠促進腸道的微生態平衡，提高機體免疫力，在應激環境下，降低畜禽死亡率。具體實施例方式實施例1屎腸球菌發酵液的製備將屎腸球菌Efl008(已於2009年12月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.3537)菌種按照2%的接種量接到MRS培養基(MRS培養基的組成成份及其含量為蛋白腖10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，iyiP042g，檸檬酸氫二銨2g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，Tween-80lmL，MgS047H200.58g，MnS044H200.25g，lOOOmL蒸餾水，用lmol/LNa0H調節pH為7.2，115。C滅菌30min)中，在37°C，160r/min條件下培養9小時，即得屎腸球菌發酵液；所得發酵液的活菌為^5X1(TCFU/mL。實施例2複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的製備按照如下方法進行按照下述重量份取P-甘露聚糖酶(購於中國農業科學院飼料研究所)，酶活為1700U/g)4，木聚糖酶(購於武漢新華揚生物技術有限公司，酶活為^50000U/g))27，P-葡聚糖酶(購於武漢新華揚生物技術有限公司，酶活性為^8000U/g)13，纖維素酶(購於武漢新華揚生物技術有限公司，酶活性為^10000U/g)31，果膠酶(購於武漢新華揚生物技術有限公司，酶活性為^20000U/g)24，實施例1製備的屎腸球菌發酵液(發酵液活菌為>5Xl(TCFU/mL)101;將上述酶混合均勻，然後再將屎腸球菌發酵液與複合P_甘露聚糖酶混合均勻，再在45t:條件下烘乾，即得複合e-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑產品，所得產品中每克產品屎腸球菌活菌數為^1X101QCFU。實施例3複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌製劑的蛋雞飼料的製備按表1的基礎日糧組分和預混料將各組分混勻，得基礎日糧。表1基礎日糧組分及營養成分tableseeoriginaldocumentpage8預混料(購於北京偉嘉人生物技術有限公司，1%蛋雞用複合預混合飼料3210)按1%的量添加，其中每千克預混料提供維生素D3為2040萬IU，維生素E為13003000IU，維生素K3為200400mg，維生素B:為>160mg，維生素B2為>700mg，維生素B6為>300mg/Kg，維生素B12為>1.8mg，生物素為>12mg，煙酸為>2200mg，泛酸為>900mg，葉酸為^70mg。試驗組日糧在基礎日糧的基礎上加入0.05%的複合P-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑，混合均勻即可。實施例4含有複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的蛋雞飼料的飼養試驗本試驗採用完全隨機試驗設計方案。選擇30周齡健康海蘭灰蛋雞1890隻，隨機分成試驗I組、試驗II組和對照組(見表2)，每處理630隻，每個處理設5個重複，每個重複126隻雞，三組基礎日糧和預混料相同。(1)試驗I組添加按照0.5g/kg比例複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑。(2)試驗II組按照0.5g/kg比例添加市場上購買的小麥_雜粕日糧專用酶製劑(含有木聚糖酶、P-葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、植酸酶等)(3)對照組只餵基礎日糧和預混料，進行為期8周的試驗。分別將試驗及對照組所述重量的組份粉碎。然後，按照擬定配方準確計量各組分，混勻，放入包裝，在陰涼乾燥通風處儲存，作為飼養試驗的日糧。試驗過程中主要考察的指標為蛋雞的生長性能、蛋雞蛋品質、營養物質消化率(AIA法)及腸道微生物的變化(稀釋塗布平板法)及發酵糞中氨氣和硫化氫釋放量(氨用納氏試劑比色法，硫化氫用滴定法)等。試驗數據在Excel軟體中進行初步運算後，用SPSS10.0ForWindows進行統計分析。各指標差異用one-wayANOVA進行分析，用LSD進行多重比較，結果見下表26。表2蛋雞生長性能試驗結果tableseeoriginaldocumentpage9注同行標有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，下表同。由表2可以看出，飼餵含有本發明的複合|3_甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的蛋雞飼料與基礎日糧相比，產蛋率提高了5.83%(P<O.Ol)，而且平均蛋的重量也增加了3.08%(P0.05)，料蛋比減少了7.32%(P<0.05)。飼餵含有本發明複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的蛋雞飼料與添加市場上的複合酶製劑相比，產蛋率提高了1.69%(PX).05)，而且平均蛋的重量也增加了1.54%(P0.05)，料蛋比減少了1.69%(P<0.05)。表3雞蛋蛋品質試驗結果tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10由表3可以看出，在蛋形指數、蛋黃比例及蛋殼比例等指標上，各處理組差異不顯著(P>0.05)。飼餵含有本發明添加複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌的蛋雞飼料與基礎日糧相比，能夠顯著提高蛋黃的重量，加深蛋黃的顏色，提高蛋殼強度。表4蛋雞對能量與粗蛋白的表觀利用率結果tableseeoriginaldocumentpage10由表4可以看出，飼餵含有本發明複合P-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的蛋雞飼料與基礎日糧相比，蛋白質的表觀利用率提高了11.85%(P<0.01)，能量的表觀利用率提高了6.47%(P0.05)，能量的表觀利用率提高了2.46%(P>0.05)。表5蛋雞盲腸腸道菌群試驗結果(lgCFU/g盲腸內容物)tableseeoriginaldocumentpage10由表5可以看出，飼餵含有本發明複合P-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的蛋雞飼料不管是與基礎日糧相比還是與添加市場上的複合酶製劑相比均能極顯著的提高蛋雞盲腸中乳酸菌的含量(P<0.01)，降低其大腸桿菌的含量(P<0.01)。表6蛋雞發酵糞中氨氣和硫化氫釋放量的試驗結果(mg/m3)tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11由表6可以看出，飼餵含有本發明複合P-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的蛋雞專用飼料與基礎日糧相比，氨氣逸出量降低了40.05%(P<0.01)，硫化氫逸出量降低了29.29%P<0.01)。飼餵含有本發明複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑的蛋雞飼料與添加市場上的複合酶製劑相比，氨氣逸出量降低了27.81%(P0.05)。終上所述複合|3-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑可以提高腸道中有益菌的數量，降低有害菌的數量，維持腸道微生態平衡，提高飼料原料的利用率，減少環境汙染，進而提高其生產性能及蛋品質。序列表〈110〉北京聯合盛邦生物技術有限公司〈120〉一種複合13-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑〈160>1〈170>PatentInversion3.5〈210>1〈211>1522〈212>DNA〈213>Enterococcusfaecium〈400〉1tacggttaccttgttacttc3CCCC^tC3tctatcccacctteggcggctggctccaaa60aggttacctcaccgacttcgggtgttec^actctcgtggtgtgacgggcggtgtgtera120郷cccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactegcgattccggcttc1803tgC3ggCg3gttgcagcctgc^tccg^ttagcttagc240ctcgcgacttcgcaactcgttgtacttcccattgtegcacgtgtgtegcc300ggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttgct3603g3gtgCCC3actg^tgatggc^cteacgcgctcgttgcgggactt皿420cccaacatctC3Cg3C3Cg3gCtg3Cg3C3accatgcaccacctgtcactttgcccccga480郷gg^gctctatctctagggatgt咖gacctggteaggttcttcgcg540ttgcttcgaatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgag600tttcaaccttgcggtcgtectccccaggcgtgcgttagctgC3gC3Ctg3660郷gcgga^ccctcc^cacttagcactcatcgtttacggcgtggacteccagggtatc720taatcctgtttgctccccacgctttcgagcctcagcgtcagttacagacc3g3g3gCCgC780cttcgccactggtgttcctccatatatctacgcatttcaccgctacacatggaattccac840tctcctcttctgcactcaagtctcccagtttccaatgaccctccccggttgagccggggg■ctttcacatcagactteagaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaa960cgcttgccacctecgtetteccgcggctgctggracgtegttegccgtggctttctggtt1020agateccgtc皿gggatg皿cagttectctcatccttgttcttctcteac1080tecgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagactttcgtccattgc1140cgaagattccctectgctgcctcccgteggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtgg1200ccgatcaccctctcaggtcggctetgcatcgtggccttggtgagccgttecctcacc皿c1260tegcteatgcaccgcgggtccatccatcagcgacacccgaaagcgccttt1320ccatgcggtttcgattgttetecggtettegcacctgtttccaagtgttetccccttctg1380atgggc郷ttecccacgtgttectcacccgttcgccactcctctttttccggtggagra1440agctccggtgcgttcgacttgcatgtetteggcacgccgccagcgttcgt1500cctgagccaggatcaaactc15221權利要求一種複合β-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑，其特徵在於其組成成份及其重量份為β-甘露聚糖酶2～8木聚糖酶24～30β-葡聚糖酶9～15纖維素酶28～33果膠酶20～27屎腸球菌發酵液90～110。2.按照權利要求l所述的飼料添加劑，其特徵在於其組成成份及其重量份為P-甘露聚糖酶4木聚糖酶27P-葡聚糖酶13纖維素酶31果膠酶24屎腸球菌發酵液101。3.按照權利要求1或2所述的飼料添加劑，其特徵在於其所述的屎腸球菌發酵液中屎腸球菌的活菌數為》5X101QCFU/mL。4.按照權利要求1或2所述的飼料添加劑，其特徵在於其原料酶活分別為P-甘露聚糖酶的酶活為1700U/g，木聚糖酶的酶活為>50000U/g;13-葡聚糖酶的酶活性為>8000U/g，纖維素酶的酶活性為^10000U/g，果膠酶的酶活性為^20000U/g。5.按照權利要求1或2所述的飼料添加劑，其特徵在於所述的屎腸球菌是屎腸球菌菌株(Enterococcusfaecium)Efl008，已於2009年12月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.3537。6.按照權利要求1或2所述的飼料添加劑，其特徵在於所述的屎腸球菌發酵液按照如下方法製備按照2X的重量百分比將屎腸球菌菌種接種於MRS培養基上，在37t:，160rpm條件下培養9小時，即得屎腸球菌發酵液；所得屎腸球菌發酵液中屎腸球菌的活菌為>5X10，FU/mL;其中所述的MRS培養基的組成成分及其含量為蛋白腖10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、1(2昍0428/1、檸檬酸氫二銨2g/L、葡萄糖20g/L、乙酸鈉5g/L、吐溫-801mL，MgS04*7H200.58g/L、MnS04*4H200.25g/L，用Imol/LNaOH調節pH為7.2，115°C滅菌30min。7.權利要求1或2所述的飼料添加劑在蛋雞飼料中應用。8.按照權利要求7所述的應用，其特徵在於所述的飼料添加劑在蛋雞飼料中的添加比例為0.030.1%。9.含有權利要求1或2所述的飼料添加劑的蛋雞飼料，其特徵在於權利要求1或2所述的飼料添加劑的重量百分比為0.03%0.1%，其中基礎飼料的組成成份及預混料及其重量份為玉米3050小麥1535豆粕1525菜籽粕38棉籽粕38石粉89磷酸氫鈣1-1.5賴氨酸鹽酸鹽0.050.1蛋氨酸0.050.1預混料15。10.按照權利要求10所述的蛋雞飼料，其特徵在於所述的預混料的組成為每千克預混料提供維生素D3為2040萬IU，維生素E為13003000U，維生素K3為200400mg，維生素B丄為160mg，維生素B2為>700mg，維生素B6為>300mg/Kg，維生素B12為>1.8mg，生物素為^12mg，煙酸為^2200mg，泛酸為^900mg，葉酸為^70mg。全文摘要本發明公開了一種複合β-甘露聚糖酶及乳酸菌飼料添加劑，其組成成份及其重量份為β-甘露聚糖酶2～8，木聚糖酶24～30，β-葡聚糖酶9～15，纖維素酶28～33，果膠酶20～27，屎腸球菌發酵液90～110。本發明還公開了一種屎腸球菌菌株(Enterococcusfaecium)Ef1008。本發明飼料添加劑可用於在蛋雞飼料中應用，其在蛋雞飼料中的添加比例為0.03％～0.1％。本發明可使蛋雞產蛋率高，可使動物對其利用率大大提高，降低了飼料成本；本發明中屎腸球菌能夠促進腸道的微生態平衡，提高機體免疫力，在應激環境下，降低畜禽死亡率。文檔編號A23K1/165GK101715879SQ20091024310公開日2010年6月2日申請日期2009年12月25日優先權日2009年12月25日發明者李冬青,王婷婷申請人:北京聯合盛邦生物技術有限公司