基因工程IFNα-2b融合蛋白質新型製備工藝的製作方法
2023-06-28 10:09:16 1
基因工程IFNα-2b融合蛋白質新型製備工藝的製作方法
【專利摘要】本發明提供了基因工程IFNα-2b融合蛋白質新型製備工藝，為解決無法去除錯配異構體的現狀，採用融合表達載體，將促進幹擾素α-2b二硫鍵正確摺疊的蛋白質及高效蛋白酶底物片段與幹擾素α-2b基因融合表達，形成可溶性天然結構表達形式；目的蛋白以可溶性天然結構形式表達，活性高，無需復性處理，避免蛋白質異構體產生；蛋白質純化工藝簡潔，僅需一步金屬螯合親和層析產品純度即可達到90%以上，去除融合蛋白片段，再利用該親和層析獲得純度95%以上的終產品，產量高，活性明顯提升，成本低；達全菌體蛋白的30%以上；獲得了幹擾素α-2b天然結構的表達產物，產品活性優於現有的國內和國際產品。
【專利說明】基因工程IFN a-2b融合蛋白質新型製備工藝
【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，涉及基因工程幹擾素(IFN) a _2b融合蛋白質的新型製備工藝，更具體地說，本發明涉及基因工程IFN a _2b融合蛋白質的基因重新構建、可溶性形式表達和新型純化製備工藝。
【背景技術】 [0002]幹擾素是一種重要的細胞功能調節因子。幹擾素具有廣譜的抗病毒、抗細胞分裂、免疫調節等生物活性，是一種重要的抗病毒、抗腫瘤治療藥物。
[0003]幹擾素的種類繁多，有人體幹擾素、動物幹擾素、昆蟲幹擾素、植物幹擾素和細胞幹擾素。人幹擾素主要來自人體白細胞和類淋巴細胞株，分α、β、Y、ω四個型別，其中人ct幹擾素有15種亞型(a 1、a2a、a2b )。人的β型幹擾素(HuIFN2 β )和Y型幹擾素(HuIFN2y)公認的只有一個亞型。白細胞幹擾素的製劑化面臨有兩個問題:首先大量生產必須保證有足夠數量的外周血白細胞，其次以數百上千人血液中採集的白細胞用仙臺病毒誘生時，必須保證不混入來自人體的病毒和基因。雖然採用目前的精製技術和處理方法提純是可靠的，但由於這種幹擾素難以製備，產量有限，價格昂貴，限制了其臨床應用。利用基因工程技術批量生產幹擾素使之臨床應用成為現實。
[0004]20世紀80年代中期:第二代基因工程IFN a -2b問世，其分子結構、功能與人IFN幾乎一致，於1986年被FDA批准用於治療慢性B型肝炎、C型肝炎(1991年2月)，繼而被批准用於毛細胞白血病(1986年6月)、生殖器疣(1988年6月)、AIDS相關的Kaposi ; s肉瘤(1988年11月)及多種腫瘤治療如膀胱癌，CML，頭頸部腫瘤、惡性黑素瘤、多發性骨髓瘤、非Hodgkin' s淋巴瘤，腎細胞癌等。
[0005]目前，國內生產重組人幹擾素的企業有30多家:其中半數以上企業生產IFNa -2b品種。其劑型主要包括注射劑、栓劑、滴眼液、乳膏等共有290多個文號。
[0006]在國內重組人幹擾素市場，呈現國產藥品和進口藥品並存的格局。進口重組人幹擾素主要有先靈葆雅、羅氏製藥生產的PEG修飾的長效幹擾素，價格偏高，平均單價在1,300元左右。國產重組人幹擾素主要為普通幹擾素，注射用幹擾素a _2b單價(300萬單位)在30元/支左右，普通幹擾素市場競爭主要集中在國內生產企業之間。國內主要生物製藥企業正在積極研製長效重組人幹擾素，一旦研製成功正式投產，憑藉區位及價格優勢，國產重組人幹擾素生產企業的市場份額將顯著擴大。
[0007]近年來，我國重組人幹擾素的銷售額保持逐年平穩的增長，預計在未來三到五年內，重組人幹擾素國內市場年增長率將保持在10%-15%之間，預計到2015年我國重組人幹擾素市場規模將達到48億元左右。
[0008]然而，與市場需求不相適應的是國內幾乎所有生產企業一直沿用舊的生產工藝，如大腸桿菌表達、包涵體分離純化、尿素變性、再復性、純化，尤其變性過程中使用高純度尿素和復性過程中使用氧化-還原型穀胱甘肽為主要原料的復性劑，致使生產成本顯著提高，復性率較低，同時產品中殘存無活性的二硫鍵錯配異構體，儘管純度檢測能夠通過國家規定的95%，但無活性的二硫鍵錯配異構體成分約佔終產品的10-15%，故國內產品活性低、療效差、副作用大，且通過傳統工藝根本無法解決。近年來有人嘗試利用高壓液相反相色譜進行錯配異構體的去除實驗，通過C18層析柱+進口乙腈+進口三氟乙酸可以達到95%純度，但工藝成本顯著提高，其成本是原產品的三倍以上，儘管國家科技部新藥創製重大專項將幹擾素長效技術改造和提取工藝改造列為重點資助方向，但成效至今尚未顯現。
【發明內容】
[0009]本發明目的無法去除錯配異構體的現狀及製造成本高的問題，而提供基因工程IFN a-2b融合蛋白質新型製備工藝。
[0010]基因工程IFN a-2b融合蛋白質基因，其鹼基序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
[0011]用於製備基因工程IFN a-2b融合蛋白質的基因，其鹼基序列如序列表SEQ IDN0.1所示。
[0012]用於製備基因工程IFN a-2b融合蛋白質的基因，其鹼基序列如序列表SEQ IDN0.2所示。
[0013]一種表達載體，它是攜帶T7強啟動子且含有多克隆位點的表達載體，並將其鹼基序列如序列表SEQ ID N0.3所示的基因，克隆到該表達載體的T7啟動子之後；
所述的多克隆位點的表達載體為PETlla。
[0014]基因工程IFN a- O人工合成鹼基序列如序列表SEQ ID N0.1和2所示的基因；
2)用Ndel、EcoRI雙酶切鹼基序列如序列表SEQID N0.1所示的基因和PETlla，T4連接酶連接，構建的mmTrxA-HIS6-SUM0質粒；
3)利用Ncol、EcoRI雙酶切如序列表SEQID N0.2所示的基因和步驟2)所構建的PETlIa-TrxA-HIS6-SUM0 質粒；T4 連接酶連接，構建的 pETlla_7E?-5Z繼9-1FNa -2b 質粒；
4MfpETlla-7E?-5Z#(9- TTWff質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，誘導表達，純
化；
5)用SUMO酶切步驟4)純化的融合蛋白；酶切融合蛋白去除融合蛋白分子中轉硫酶A和SUMO酶切底物部分，再純化；
步驟4)得到的純化蛋白經過緩衝液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱,用含有(T0.5M NaCl的TE緩衝液連續梯度洗脫，並收集蛋白質各組分峰部分；目的組分峰部分經小型中空纖維超濾器作用30分鐘超濾濃縮換液後，使濃縮物通過用20mM Tris-HCl,pH8.0,0.15M NaCl 緩衝液平衡過的 1.6X 100cm IMAC 柱(Pharmacia)，並用含有 0.15MNaCl的緩衝液洗脫。收集目的蛋白峰部分，利用SUMO酶切目的蛋白，並再次過IMAC液相色譜柱，收集蛋白質峰值部分，並在30mM PBS中徹底透析，透析後於-20°C下儲存備用；所述的 0.15M NaCl 的緩衝液為 20mM Tris-HCl, ρΗ8.0,200mM 咪唑。
[0015]發明詳述:本發明IFN a -2b大腸桿菌偏性密碼子為主體，以人工體外基因合成，將有促進外源蛋白質二硫鍵正確形成的轉硫酶A(TrxA)基因以第一順位克隆到表達載體的T7啟動子之後；將便於純化和組氨酸標籤(His6-Tag)基因以第二順位克隆到TrxA之後；將SUMO蛋白酶識別底物序列以第三順位克隆到組氨酸標籤His6之後；將大腸桿菌偏性密碼子組成的IFN a -2b基因以第四順位克隆在SUMO蛋白酶識別底物序列之後；在咪唑存在下進行金屬螯合介質純化，一步獲得90%純度的融合蛋白。利用高特異性和高活性SUMO蛋白酶對純化的融合蛋白進行酶切，使標籤部分與IFN a _2b目的蛋白解離，並利用金屬螯合介質將標籤部分與IFN a -2b目的蛋白分離。從而獲得純度達95%的天然結構的目的蛋白；高度純化的目的蛋白質在多種保護劑存在下，製備成具有藥用價值的藥物組合物。
[0016]本文中所使用術語「幹擾素IFN a _2b」，是指能夠在體內外發揮人幹擾素功能的基因工程產品，根據本發明的優選實施方案，為忠實於天然IFN a -2b胺基酸序列，合成基因時特意設計將天然IFN a -2b首位胺基酸Cys的密碼子TGC置於SUMO蛋白酶識別底物胺基酸序列Gly-Gly之後，所說的IFN a -2b是以不含Met為首位密碼子的基因工程重組IFN a -2b ο
[0017]文中所用的胺基酸符號為本領域通用的三字母縮寫符號，其中為了基因連接方便在基因合成時於融合蛋白N末端添加了 NcoI限制性內切酶識別位點，並利用NcoI限制性內切酶識別位點中的ATG作為首位啟動密碼子，翻譯表達融合蛋白首位胺基酸Met。同時在融合的蛋白基因的3'端加入限制性內切酶EcoRI的識別序列GAATTC，以便使基因片段和載體連接時均形成粘性末端，利於基因連接。為使表達產物達到高效表達，將大腸桿菌偏性密碼子引入到其中，以使表達產物適合在大腸桿菌中表達。
[0018]利用本發明方法製備的IFN a -2b與原工藝產物進行了活性對比，結果發現本發明專利製備的樣品活性顯著優於原工藝產品。
[0019]本文中所使用術語「IU」是指利用中國生物製品規程所描述的幹擾素活性檢定標準方法測定的活性單位數，即利用體外培養的人羊膜細胞(WISH)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)的破壞作用(參見中國藥典附錄，幹擾素生物活性測定法)。
[0020]用於構建本發明的融合蛋白質的IFN a-2b分子可以是缺失了 N端Met的天然IFN a -2b分子,其胺基酸序列完全一致於Genbank報導的人IFN a -2b序列，同時其二硫鍵正確形成，其活性等同或高於人天然幹擾素a _2b。其中所說的IFN a _2b是以單體分子形式存在的，也可以通過PEG修飾形成長效幹擾素。
[0021]由於暫時缺乏作為本發明融合IFN a -2b分子中轉硫酶A、His-Tag和SUMO酶切底物的現成序列，所以在本發明中使用通用的DNA合成儀在1000A固相載體上合成編碼這些融合蛋白的核苷酸序列。為了便於與特定重組載體進行連接，可在合成的融合蛋白基因序列的5』和/或3』端引入適當的核酸內切酶(如NcoI和EcoRI)酶切位點，並造成適於連接的粘性末端。可按照本領域技術人員已知的重組技術，克隆編碼這些合成的閱讀框架通暢的基因(或以其cDNA或基因組DNA形式)，DNA重組操作中，一般使用標準的基因克隆和亞克隆技術進行基因片段的轉移和連接。使用限制性酶切法鑑定序列連接方向的正確性和可能的突變，最後以DNA測序進行序列確認。
[0022]這裡應特別指出的是，由於相對於IFN a -2b分子來講，融合表達的轉硫酶A和SUMO酶切底物部分分子量偏大，所以由三者產生的融合蛋白質中很可能形成新的高級空間構象，導致前導部分對IFN a -2b的捲曲形成影響，影響IFN a -2b的活性和空間構像。然而通過技術人員計算機分析和園二色譜檢測證明IFN a _2b蛋白質分子是以正確的二硫鍵形式進行摺疊的。
[0023]重組蛋白質基因將被可操縱地連接到適當的表達控制序列上，如連接到適於在大腸桿菌中使用的T7、trp或λ啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止信號上。可使用已知的轉化方法，如適於原核細胞的氯化鈣處理法或適於哺乳動物細胞的電穿孔法將本發明的重組質粒轉化到選擇的宿主細胞中。可基於質粒上所含抗生素抗性基因所賦予的抗生素抗性來選擇被轉化的陽性細胞。一旦表達了所需的融合蛋白質，即可按照本領域已知的方法分離並純化該融合蛋白質。例如，可從發酵培養物中離心收集菌體細胞並用溶菌酶和超聲波裂解之，然後超速離心並在低濃度磷酸鹽(約20mM)溶液中加入飽和硫酸銨進行分步沉澱。依次經離子交換層析(IEC)和IMAC層析純化所需的IFN a -2b重組蛋白質。。
[0024]一般說來，使用聚丙烯醯胺凝膠以SDS-PAGE電泳法分析各柱層析洗脫部分，並以免疫印跡法監測之。對重組融合蛋白質純化產物進行細胞病毒抑制試驗以檢測重組蛋白質的生物學活性(具體操作見中國生物製品規程2010版)。
[0025]可將本發明的IFN a-2b蛋白質作為基本活性成分，並加入一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑，製成適於臨床應用的藥物組合物。所說的載體或賦形劑包括但不只限於磷酸鹽緩衝液、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根據所治療的疾病的不同，可在本發明的藥物組合物中加入一種或多種與本發明的蛋白質有輔助或協同作用的其他天然的、合成的或重組的活性化合物。另外，可在本發明的藥物組合物中加入低分子量肽、甘氨酸或賴氨酸及金屬陽離子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白質保護劑，以及聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、穀胱甘肽的穩定劑。
[0026]可以通過常規給藥途徑，特別是胃腸道外途徑投用本發明的藥物組合物，例如通過靜脈內、腹腔內、肌肉內、皮內、皮下或黏膜內途徑給藥。本發明藥物組合物的有效劑量範圍可從幾毫微克至幾十毫克/公斤體重/天，但針對每個特定病人的具體用藥劑量將根據待治療疾病或病理狀態的性質及嚴重程度、病人的年齡、體重、對藥物的反應能力及給藥方式等因素而定。
[0027]本發明提供了基因工程IFN a -2b融合蛋白質新型製備工藝，為解決無法去除錯配異構體的現狀，採用融合表達載體，將促進幹擾素a -2b 二硫鍵正確摺疊的蛋白質及高效蛋白酶底物片段與幹擾素a-2b基因融合表達，形成可溶性天然結構表達形式；目的蛋白以可溶性天然結構形式表達，活性高，無需復性處理，避免蛋白質異構體產生；蛋白質純化工藝簡潔，僅需一步金屬螯合親和層析產品純度即可達到90%以上，去除融合蛋白片段，再利用該親和層析獲得純度95%以上的終產品，產量高，活性明顯提升，成本低；達全菌體蛋白的30%以上；獲得了幹擾素a _2b天然結構的表達產物，產品活性優於現有的國內和國際產品。
[0028]應特別指出的是，儘管更深入的作用機理尚不明確，但我們的實驗室已證明本發明的IFN a -2b蛋白質對包括結腸癌HT-29細胞、卵巢癌0VCAR3細胞、子宮頸腺癌HeLa細胞及肝癌H印G-2細胞等腫瘤細胞系均有明顯的抑制作用，同時證明本發明的IFN a -2b蛋白質對包括水泡性口炎病毒等具有顯著的抑制作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1顯示用於表達融合蛋白的重組質粒構建圖。
【具體實施方式】 [0030]以下藉助實施例進一步闡明本發明，但本領域技術人員可以意識到，這些實施例並不構成對本發明待批權利要求範圍的限制。
[0031]實施例1:1FN a -2b蛋白質的製備 A.重組表達質粒的構建與鑑定
a.基因合成:本發明中參考已經公開認知的轉硫酶A和SUMO酶識別底物序列，人工體外合成如下序列:
NdeI內切酶識別序列(CATATG) +轉硫酶A+HIS6+NcoI識別序列(CCATGG) +SUMO酶識別底物序列+EcoRI內切酶識別序列(GAATTC)，基因序列見SEQ ID NO: 1，本合成序列直接克隆入大連Takara公司提供的T載體中，並轉化大腸桿菌JM109細菌，經PCR鑑定確定陽性克隆株，陽性克隆株擴大培養，常規分子克隆技術提取質粒DNA，利用Nde1、EcoRI雙酶切本質粒和PETlla質粒，回收目的片段和PETlla質粒載體粘性末端片段，以正確的閱讀框架在T4連接酶(Promega)存在下將目的片段插入到同樣酶切的PETlla質粒載體中，構建融合蛋白前部雙鍊表達基因。
[0032]b.然後人工合成NcoI識別序列(CCATGG) +SUMO酶識別底物序列+IFN a -2b+EcoRI內切酶識別序列(GAATTC)序列，基因序列見SEQ ID NO: 2,使IFN a -2b的N端第一個胺基酸密碼子與SUMO酶識別底物序列C端的密碼子GGAGGC直接相連，合成的雙鏈基因直接克隆入大連Takara公司提供的T載體中，並轉化大腸桿菌JM109細菌，經PCR鑑定確定陽性克隆株，陽性克隆株擴大培養，常規分子克隆技術提取質粒DNA，利用Ncol、EcoRI雙酶切本質粒和步驟I所構建的PETlla-TrxA-HIS6-SUM0質粒，回收目的片段和PETlla-TrxA-HIS6-SUM0質粒載體粘性末端片段，以正確的閱讀框架在T4連接酶(Promega)存在下將目的片段插入到同樣酶切的載體質粒中，構建融合蛋白全序列雙鍊表達基因。構建的載體轉化感受態大腸桿菌JM105細胞，並將被轉化的細胞培養於含氨苄青黴素(50 μ g/ml)的LB 培養基中，以擴增質粒DNA。培養完成後，破碎細胞，離心收集質粒並純化質粒DNA測序，測序正確的質粒將被轉化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，用酶切鑑定法和瓊脂糖凝膠(2%)電泳法進行鑑定，然後陽性重組質粒進行DNA序列分析。SEQ ID N0:3顯示了所測得的融合蛋白重組基因的核苷酸序列。圖1顯示了重組質粒pETlIa-TRXA-SUMO-1FN a -2b的構建。
[0033]B.TRXA-SUMO-1FNa-2b融合蛋白質的表達及產物的純化:
將攜帶重組基因質粒轉化的大腸桿菌BL21 (DE3)(含有T7 RNA聚合酶基因)培養在含有氨苄青黴素(50 μ g/ml)的LB瓊脂平皿上。培養後挑選氨苄青黴素抗性菌落，於含氨苄青黴素(50 μ g/ml)的LB培養基中37°C培養，當A_達到約0.4~0.6時加入ImM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(終濃度lmM)，37°C繼續培養3小時，以誘導目的產物的表達。然後離心分離細胞和培養基，並將含有目的蛋白質的菌體中加入緩衝液成分，終濃度達50mMTris-HCl, pH8.0, ImM EDTA,超聲破碎，4°C離心(20，OOOg，30分鐘)，取上清(可溶性部分)即為融合蛋白粗提物。
[0034]粗提物經過緩衝液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia),用含有(T0.5M NaCl 的 TE 緩衝液(20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA)連續梯度洗脫，並收集蛋白質各組分峰部分。目的組分峰部分經小型中空纖維超濾器(Milipore)作用30分鐘超濾濃縮換液後，使濃縮物通過用20mM Tris-HCl, pH8.0,，0.15M NaCl緩衝液平衡過的
1.6X IOOcm IMAC柱(Pharmacia)，並用含有 0.15M NaCl 的緩衝液(20mM Tris-HCl, pH8.0,200mM咪唑)洗脫。收集目的蛋白峰部分，利用SUMO酶切目的蛋白，30°C，4hr，並再次過IMAC液相色譜柱，收集蛋白質峰值(A28tl)部分並在30mM PBS中徹底透析，透析後於_20°C下儲存備用。如此純化的蛋白質純度>97%。
[0035]實施例2:利用細胞病變抑制法測定新工藝製備的IFNa -2b對人羊膜細胞(WISH)免受水皰性口炎病毒破壞作用，(具體操作見中國藥典2005版第三部附錄XC)。
[0036]細胞病變抑制試驗:
將培養的人羊膜細胞單層細胞經胰蛋白酶消化，吹打收集細胞懸液，利用細胞計數板記數後，調整細胞數量為60000個/ml，按照80 μ I/孔加入到96孔培養板中(每孔5000細胞)，5% 0)2，371:條件下培養411。調整購於中國藥品生物製品檢定院的IFN a-2b標準品和新工藝製備的IFNa -2b蛋白質樣品濃度為lmg/ml，定量的樣品經過濾除菌，按等倍稀釋法將不同量的樣品加入各細胞孔中，然後補足培養基，使之總體積為100 μ 1， 5% CO2,37°C條件下培養24h。棄去細胞培養板中的上清液，將_70°C保存的水泡性口炎病毒(VSV)用攻毒培養液稀釋至100CCID50，每孔100μ 1，於5% C02，37°C條件下培養24h，然後棄去細胞板中上清液,每孔加入50 μ I染色液,室溫放置30min後，用流水衝去染色液，並吸乾殘留水分，每孔加入脫色液100 μ 1，室溫放置5min，混勻後，用酶標儀以630nm為參比波長，在波長570nm處測定吸光度，記錄測定結果。
[0037]實驗數據採用電腦程式進行參數回歸計算:
供試品生物活性(IU/mg) =Pr X(Ds X Es) / (Dr X Er)
公式中:Pr為標準品生物活性，IU/mg ；
Ds為供試品預稀釋倍數；
Dr為標準品預稀釋倍數；
Es為供試品相當於標準品半效量的稀釋倍數；
Er為標準品半效量稀釋倍數。
【權利要求】
1.基因工程IFNa-2b融合蛋白質基因，其鹼基序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
2.用於製備基因工程IFNa-2b融合蛋白質的基因，其鹼基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
3.用於製備基因工程IFNa-2b融合蛋白質的基因，其鹼基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
4.一種表達載體，它是攜帶T7強啟動子且含有多克隆位點的表達載體，並將其鹼基序列如序列表SEQ ID N0.3所示的基因，克隆到該表達載體的T7啟動子之後。
5.權利要求4所述的一種表達載體,其特徵在於:所述的多克隆位點的表達載體為PETlla0
6.基因工程IFNa-2b融合蛋白質新型製備方法，步驟如下: O人工合成鹼基序列如序列表SEQ ID N0.1和2所示的基因； 2)用Ndel、EcoRI雙酶切鹼基序列如序列表SEQID N0.1所示的基因和PETlla，T4連接酶連接，構建的mmTrxA-HIS6-SUM0質粒； 3)利用Ncol、EcoRI雙酶切如序列表SEQID N0.2所示的基因和步驟2)所構建的PETlIa-TrxA-HIS6-SUM0 質粒；T4 連接酶連接，構建的 pETlla_7E?-5Z繼9-1FNa -2b 質粒；4MfpETlla-7E?-5Z#(9- TTWff質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，誘導表達，純化； 5)用SUMO酶切步驟4)純化的融合蛋白；酶切融合蛋白去除融合蛋白分子中轉硫酶A和SUMO酶切底物部分，再純化。
7.權利要求6所述的基因工程IFNa _2b融合蛋白質新型製備方法，其特徵在於:步驟4)得到的純化蛋白經過緩衝液平衡的DEAE-S印harose Fast Flow柱，用含有0-θ.5M NaCl的TE緩衝液連續梯度洗脫，並收集蛋白質各組分峰部分；目的組分峰部分經小型中空纖維超濾器作用30分鐘超濾濃縮換液後，使濃縮物通過用20mM Tris-HCl, pH8.0,0.15M NaCl緩衝液平衡過的1.6X 100cm IMAC柱，並用含有0.15M NaCl的緩衝液洗脫；收集目的蛋白峰部分，利用SUMO酶切目的蛋白，並再次過IMAC液相色譜柱，收集蛋白質峰值部分，並在30mM PBS中徹底透析，透析後於_20°C下儲存備用。
8.權利要求7所述的基因工程IFNa _2b融合蛋白質新型製備方法，其特徵在於:所述的 0.15M NaCl 的緩衝液為 20mM Tris-HCl, ρΗ8.0,200mM 咪唑。
【文檔編號】C12N15/70GK103805622SQ201410082516
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月8日 優先權日:2013年12月21日
【發明者】張國利, 張培培, 李澤鴻, 史飛, 田園, 劉雨玲 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所