重組質粒pAdTrack-shRNA的測序方法

2023-06-28 21:11:16

專利名稱：重組質粒pAdTrack-shRNA的測序方法
技術領域：
本發明是關於一種重組質粒pAdTrack-shRNA的測序方法,具體是關於一種設計特定引物、採用二次PCR以實現對重組質粒pAdTrack-shRNA的測序的方法。
背景技術：
RNA 幹涉(RNA interfering, RNAi)是一種由雙鏈 RNA (double-stranded RNA,dsRNA)引發的轉錄後基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PGTS)機制，具有普遍的生物學意義。目前RNA幹涉的作用機理還不是十分的明確，一般認為有兩個階段。在RNAi的起始期，雙鏈RNA被細胞內的Dicer酶(RNA酶III家族成員)切割降解成21-23個核苷酸的小片段幹擾RNA (siRNA)，每個siRNA片段均含有2_3個3』突出端和5』磷酸基團，其5』磷酸末端對mRNA的降解有著重要的作用。在效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶複合物形成RNA導沉默複合物(RNA-induced silencing complex, RISC),在ATP存在的 情況下，雙鏈的siRNA解旋，解旋後的siRNA反義鏈引導RISC到達靶mRNA，通過鹼基配對的原則特異性地降解靶序列，從而達到高效特異性沉默目的基因表達。RNA幹涉技術能有效、特異性地抑制細胞內特定基因的表達，它在基因功能研究、惡性腫瘤的治療和神經退行性疾病基因治療方面可能存在著較高的應用價值。目前，siRNA的獲得主要通過化學合成法和siRNA表達載體法，siRNA表達載體法常用的是質粒表達和病毒表達，目前常用的病毒有腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒。腺病毒(adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70 90nm的顆粒,基因組大小約為36kb,有大約超過50種的腺病毒血清型中，人腺病毒2型及5型研究最為深入，常用作基因轉移的載體。因為腺病毒基因組較大，在構建腺病毒載體時，通常將El區基因切除，把目的基因插入到多克隆位點後與腺病毒骨架質粒共轉染293細胞內進行同源重組，得到腺病毒。目前腺病毒載體法是基因治療中最常用的基因轉移方法之一，其具有以下優點①克隆容量可達10kb，適合容納較大片段基因腺病毒基因的結構和功能比較清楚，易操作和構建；③宿主範圍廣，能感染分裂狀態的細胞與感染非分裂狀態的細胞；④病毒滴度高；⑤安全性好。He等介紹的AdEasy-I系統是通過細菌內同源重組來構建腺病毒載體的一種方法，其具有成功率高、不需要電穿孔等優點而被廣泛的應用。但是該腺病毒系統中穿梭質粒PAdTrack,由於多克隆位點前後序列高度重複，目前尚沒有一種通用的測序引物，從而限制了該病毒系統在RNA幹擾領域中的直接應用。

發明內容
本發明的一個目的在於針對現有技術中對pAdTrack-shRNA的測序難題，提供一種對重組質粒pAdTrack-shRNA進行測序的方法，進而為pAdEasy-Ι系統直接應用於基因沉默方面奠定基礎。本發明的另一目的在於提供用於實現上述重組質粒pAdTrack-shRNA測序方法的引物對。
為達上述目的，本發明提供了一種重組質粒pAdTrack-shRNA的測序方法，其中是通過設計特定引物、採用二次PCR以實現對重組質粒pAdTrack-shRNA的測序。具體地,該方法包括在多克隆位點前後設計上遊引物M和下遊引物N，使上遊引物M和下遊引物N分別在DNA鏈上有2個匹配位點，且引物M的2個匹配位點位於多克隆序列的同側，引物N的2個匹配位點分別位於多克隆序列的兩側；進行第一次PCR反應，電泳後膠回收含有多克隆位點的目的條帶；以膠回收產物為模板，利用上遊引物M和下遊引物N進行二次PCR反應，對反應產物進行測序。siRNA髮夾結構可參見圖I所示。本發明的間接測序的方法具體原理可參見圖2所示在本發明的方法中，是於多克隆位點前後設計上遊引物M和下遊引物N，它們分別在DNA鏈上有2個匹配位點，即引物M可以識別A或者A』位點，下遊引物N可以識別B或者B』位點。其中引物N的匹配位點在多克隆序列的兩側，引物M的匹配位點在多克隆序列的同側。進行第一次PCR反應時其產物會出現以下情況的三條帶I. A點為上遊引物識別位點，B』為下遊引物識別位點。2. A點為上遊引物識別位點，B為下遊引物識別位點。3. A』點為上遊引物識別位點，B為下遊引物識別位點。電泳後膠回收含有多克隆位點的目的條帶，以膠回收產物為模板，M和N為引物進行第二次PCR反應，其產物即可測序，測序引物為M或者N。根據本發明的具體實施方案，本發明的方法特別適用於重組質粒的插入片段小於IOObp的情況。在本發明的一具體實施方案中，利用本發明的上述方法，實現了對重組質粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的測序。S卩，本發明還提供了一種重組質粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的測序方法,該方法包括在多克隆位點前後設計上遊引物M和下遊引物N:上遊引物M :ACCTCTACAAATGTGGTATG (SEQ ID No. I)下遊引物N :TTATGGGACTTTCCTACTTG (SEQ ID No. 2)；進行第一次PCR反應，電泳後膠回收含有多克隆位點的目的條帶(即，含有插入片段的目的條帶)；以膠回收產物為模板，利用上遊引物M和下遊引物N進行二次PCR反應，對反應產物進行測序。根據本發明的具體實施方案，在上述對重組質粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的測序方法中，所述第一次PCR反應條件為94°C預變性45s ;94°C變性45s，59. 6°C退火45s，72°C延伸lmin，共30 35個循環；最後72°C延伸5 lOmin。所述第二次PCR反應條件為94°C預變性45s ;94°C變性45s，59. 6°C退火45s，72°C延伸lmin，共30 35個循環；最後72°C延伸5 lOmin。反應體系包括DNA聚合酶、引物、脫氧核苷酸、DNA模板和緩衝液等的備置可以參照所屬領域的現有技術進行。需要說明的是，儘管本發明的具體實施例是對pAdTrack-IL-Ι β -shRNA進行測序，本發明的測序方法的思路可以延及對其他類似shRNA小片段的重組質粒的測序。另一方面，本發明還提供了用於實現本發明所述測序方法例如上述對重組質粒pAdTrack-shRNA的測序方法的引物對，即所述的引物對M和N，更具體地，在對pAdTrack-shRNA測序時，所述的引物對M、N分別為所述的引物對SEQ ID No. I和SEQ ID
No. 2o綜上所述，本發明提供了一種間接的測序方法，針對pAdTrack設 計了引物、通過二次PCR方法，巧妙的完成了對pAdTrack-IL-Ι β -shRNA測序。其設計的思路可同樣應用於所有以PAdTrack質粒為基礎的研究，同樣為腺病毒AdEasy-I系統在基因治療的領域應用奠定了基礎。


圖IsiRNA髮夾結構示意圖；圖2 二次PCR原理示意圖；圖3重組穿梭質粒酶切鑑定圖；圖4第一次PCR產物凝膠電泳圖；圖5第二次PCR產物凝膠電泳圖；圖6重組穿梭質粒的測序圖譜。
具體實施例方式為了更清楚地理解本發明，現參照下列實施例及附圖進一步描述本發明。實施例僅用於解釋而不以任何方式限制本發明。實施例中未註明具體條件的實驗方法為所屬領域熟知的常規方法和常規條件，或按照製造商所建議的條件；實施例中所用AdTrack載體為電子科技大學神經免疫學實驗室保存，感受態細菌及其它各試劑材料均為寶生物公司商購獲得。實施例I重組穿梭質粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的構建首先通過Genbank中報導的大鼠IL-I β基因的mRNA序列(基因編號ΝΜ_031512)。應用 Amhino 公司網站中 siRNA 輔助設計工具(http: //www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder.html)在線尋找IL-I β-siRNA的祀序列。根據幹涉祀點的選擇原則，設計革巴向 mRNA 序列，隨後用 BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/blast, cgi)對選擇的靶序列進行同源性分析，排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能。設計IL-I β -shRNA表達載體的插入序列結構酶切位點+siRNA序列+環狀結構+終止序列+酶切位點，為了後續重組穿梭質粒的檢測方便，在設計併合成插入序列模板兩端的酶切位點時僅保留四個鹼基，將插入序列連接到穿梭質粒上時，此酶切位點因為缺失一個鹼基故被破壞掉。加入轉錄終止序列(TTTTTT，polyT)是確保轉錄準確終止，並在合成DNA的末端設計一個新的Stu I酶切位點，具體鹼基序列為TCGAGCACAGACCTGTCTTCCTATTCAAGACGTAGGAAGACAGGTCTGTGCTTTTTTAGGCCT (SEQ ID No. 3)。將合成的寡核苷酸片段用無菌水溶解，按照如下體系進行退火反應正義鏈2ul，反義鏈2ul，退火緩衝液16ul充分混勻後95°C 2min，之後自然冷卻至室溫37°C Ih0產物最後保存於4 C。
將AdTrack載體經HindIII和Sal I酶切後，瓊脂糖回收DNA大片段。與退火片段過夜連接，之後轉化感受態細菌DH5 α，挑選單克隆菌落，質粒提取進行酶切鑑定，結果顯示為 pAdTrack-IL-Ι β -shRNA (見圖 3,M λ -HindIII/DNA Marker ；Γ2 :未酶切質粒；3 :質粒+Stu I酶切)。實施例2第一次PCR反應因pAdTrack載體多克隆位點前後均為重複序列，對其進行測序時，沒有一個通用的測序引物。本發明設計引物時遵循以下原則①引物長度在18-25鹼基。②引物序列中G+C含量一般為40-55%。③避免擴增模板的二級結構區域。④引物末端不應超過3個連續的G或C。按照以後原則在多克隆位點前後設計上遊引物M和下遊引物N，其具體的序列為上遊引物M:ACCTCTACAAATGTGGTATG (SEQ ID No. I)下遊引物N :TTATGGGACTTTCCTACTTG (SEQ ID No. 2)第一次PCR反應體系如下
權利要求
1.重組質粒PAdTrack-ShRNA的測序方法，該方法包括 在多克隆位點前後設計上遊引物M和下遊引物N，使上遊引物M和下遊引物N分別在DNA鏈上有2個匹配位點，且引物M的2個匹配位點位於多克隆序列的同側，引物N的2個匹配位點分別位於多克隆序列的兩側； 進行第一次PCR反應，電泳後膠回收含有多克隆位點的目的條帶； 以膠回收產物為模板，利用上遊引物M和下遊引物N進行二次PCR反應，對反應產物進行測序。
2.根據權利要求I所述的重組質粒pAdTrack-shRNA的測序方法，其中，重組質粒的插入片段小於lOObp。
3.重組質粒pAdTrack-IL-Ιβ -shRNA的測序方法，該方法包括 在多克隆位點前後設計上遊引物和下遊引物上遊引物 SEQ ID No. I ACCTCTACAAATGTGGTATG下遊引物 SEQ ID No. 2 TTATGGGACTTTCCTACTTG 進行第一次PCR反應，電泳後膠回收含有多克隆位點的目的條帶； 以膠回收產物為模板，利用上遊引物SEQ ID No. I和下遊引物SEQ ID No. 2進行二次PCR反應，對反應產物進行測序。
4.根據權利要求3所述的測序方法，其中，所述第一次PCR反應條件為94°C預變性45s ;941變性458，59.61退火458，721延伸lmin，共30 35個循環；最後72°C延伸5 IOmin0
5.根據權利要求3或4所述的測序方法，其中，所述第二次PCR反應條件為94°C預變性45s ;94°C變性45s，59. 6°C退火45s，72°C延伸lmin，共30 35個循環；最後72°C延伸5 IOmin0
6.一種用於實現權利要求3、任一項所述重組質粒pAdTrack-shRNA的測序方法的引物對 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2。
全文摘要
本發明提供了一種重組質粒pAdTrack-shRNA的測序方法，該方法包括在多克隆位點前後設計上遊引物M和下遊引物N，使上遊引物M和下遊引物N分別在DNA鏈上有2個匹配位點，且引物M的2個匹配位點位於多克隆序列的同側，引物N的2個匹配位點分別位於多克隆序列的兩側；進行第一次PCR反應，電泳後膠回收含有多克隆位點的目的條帶；以膠回收產物為模板，利用上遊引物M和下遊引物N進行第二次PCR反應，對反應產物進行測序。利用本發明的方法，通過設計引物，進行二次PCR反應，可實現對以pAdTrack為基礎的重組質粒的測序，為腺病毒AdEasy-1系統在基因治療的領域應用奠定了基礎。
文檔編號C12N15/11GK102864217SQ20121018556
公開日2013年1月9日 申請日期2012年6月7日 優先權日2012年6月7日
發明者霍家佳, 遊自立, 曹雲飛, 徐從倫, 申兵, 佘輝 申請人:中國電子科技集團公司第三十研究所