具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物及其藥物製劑的製作方法

2023-06-28 13:21:56 2

專利名稱：具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物及其藥物製劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於製藥領域，特別是涉及一種具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物及 其藥物製劑。
技術背景惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病和多發病，據世界衛生組織報告，全球50多億 人口中，每年新診斷的腫瘤患者約為900萬人，因腫瘤而死亡者達700萬人，佔總病死率的 近20%，因此抗癌藥物的開發已成為本世紀新藥研究的重大課題。目前國內外在癌症的 藥物治療，特別是分子靶向治療正在不斷改善癌症的治療效果，但同時應看到，許多化 學治療藥物在取得明顯療效的同時，亦可能引起多種近期及遠期不良反應。醫學界在尋 求和使用抗癌藥物的同時，發現許多化學抗癌藥物在作用於靶細胞時往往累及正常細胞， 且臨床上用於治療腫瘤的化學藥物大多數品種都有不同程度的致突變遺傳毒性，為此治 療腫瘤的同時增加了病人患第二種腫瘤的可能性。因此，從天然的藥用植物或動物中發 現抗腫瘤藥物是當前的主要趨勢之一。從有著悠久用藥歷史的中藥中發現抗腫瘤藥物更 是為世界範圍內的藥物學家所關注。轉移是惡性腫瘤生物學行為最本質的特徵。據統計，60%以上惡性腫瘤患者於初次 診斷時已發現有轉移。臨床腫瘤患者約有80-90%以上死於侵襲和轉移。也就是說腫瘤轉 移最終成為大多數腫瘤患者的死亡原因。因此，在癌症治療過程中，控制腫瘤侵襲和轉 移是關鍵。腫瘤轉移是一個十分複雜、動態的連續生物學過程，主要步驟包括1)原發 瘤擴張性生長；2)腫瘤細胞粘附並降解腫瘤細胞周圍基底膜；3)侵襲進入淋巴管、毛 細血管、小靜脈等循環系統；4)存活的瘤細胞到達靶器官，粘附作用在毛細血管著床， 穿透血管侵入周圍組織；5)在遠隔器官內生長，轉移灶形成。增殖是造成腫瘤細胞的浸 潤和轉移的原因，粘附是腫瘤轉移的啟動步驟，高侵襲的腫瘤細胞與基底膜成分的異質 性粘附能力增高，同時腫瘤細胞突破基底膜(BM)或細胞外基質(ECM)侵襲周圍組織 是轉移的重要步驟。因此，腫瘤增殖、粘附和侵襲是腫瘤轉移的三大關鍵步驟。目前雖 有一些抗腫瘤侵襲和轉移的藥物在臨床上應用，但仍存在治療效率低、選擇性差、毒副 反應大、易產生瘤細胞耐藥等問題，為此尋找抗腫瘤侵襲和轉移藥物是當務之急。中藥重樓為百合科重樓屬植物滇重樓CP"〃's ; o(y/7/z_y〃a Smith var.少a""朋eraW及七 葉一枝花(屍fl^y; o(y; /2;;〃af Smith var. c/ '"e"^ (Franch.) Hara)的根莖，具有清熱解毒、 消腫止痛、涼肝定驚之功效,用於治療臃腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、涼風抽搐 等症，其所含皂苷類為主要活性成分。現代藥理學研究表明，重樓的醇提物、水提物在 體外對多種腫瘤細胞具有抑制作用，對動物移植性腫瘤S180、 S37、 EAC、 ARS、 L759等 的生長有明顯的抑制作用，但到目前為止尚未發現重樓總皂苷提取物具有抗腫瘤轉移作用及在抗腫瘤轉移藥物中的應用見諸報導。 發明內容為了解決上述問題，本發明的目的在於提供一種作用明確、毒副作用小的具有抗腫 瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物及其藥物製劑。為了達到上述目的，本發明提供的具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物是經過 按順序進行的下列步驟製成-1) 將雲南產滇重樓的粗粉過5目篩後分別用4倍體積比的70% 85%乙醇浸泡1小時， 然後在85'C的溫度下加熱回流提取3次，每次2小時，合併提取液並濃縮而得到浸膏；2) 將上述浸膏加入到50 100倍體積比的0% 20%乙醇中並分散均勻，離心，沉 澱後再溶解，再離心，重複2次，合併上清液；3) 將上述上清液經大孔吸附樹脂層析柱，所用幹樹脂量按照與浸膏重量比例為4: l 10: 1計算，上柱流速為1 犯V/h，洗脫液棄去；用60% 80%乙醇洗脫，流速為2 5BV/h， 收集乙醇洗脫液，減壓濃縮真空乾燥後即可得到重樓總皂苷提取物。所述的重樓總皂苷提取物中皂苷總含量為60.6% 63.2%，其中皂苷A (薯蕷皂苷元 -3-0-(1七-阿拉伯糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2) ]-P-D-葡萄糖苷)、皂苷B (薯蕷 皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2)]-卩-D-葡萄糖苷)、皂苷C (薯蕷皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2) ]-P-D-葡萄糖苷)、皂苷D (偏諾皂苷元-3-0-a-L-阿拉伯糖基(1 —4) -[a-L-鼠李糖基(1—2)]-卩-D-葡萄糖苷)、皂苷E (偏諾皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2) ]-(3-D-葡萄糖苷)、皂苷F (偏諾皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2) ]-(3-D-葡萄糖苷)的含量合計為11%。本發明提供的具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物藥物製劑由作為活性成分的 重樓總皂苷提取物和藥用輔料組成，其中重樓總皂苷提取物佔藥物製劑總量的重量百分 比為60% 98%。所述的藥物製劑包括膠囊劑、注射劑、片劑、顆粒劑、溶液劑或懸浮劑、粉劑及栓劑。本發明提供的具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物及其藥物製劑對動物移植性腫瘤細胞的轉移具有良好的抑制作用，表現在(1)對接種的小鼠肺腺癌、人肺癌、人 胃癌、人腸癌、人肝癌及其他瘤株的近交系小鼠和裸小鼠轉移模型有顯著的抗轉移作用； (2)對轉移相關蛋白有明顯影響；(3)對轉移相關基因有明顯影響，且對主要臟器沒有明顯毒性。另外，由於該藥物製劑的主要活性成分為中藥提取物，因而相對化學治療藥物而言具有毒副作用小的優點。
具體實施方式
一、重樓總皂苷提取物的製備將雲南產滇重樓500g粗粉過5目篩後分別用4倍體積比的70%和85%乙醇浸泡1小時，然後在85'C的溫度下加熱回流提取3次，每次2小時，合併提取液並濃縮而得到 浸膏；將上述浸膏加入到100倍體積比的20%乙醇中並分散均勻，離心，沉澱後再溶解， 再離心，重複2次，合併上清液；將上述上清液經大孔吸附樹脂層析柱，所用幹樹脂量 按照與浸膏重量比例為5: 1計算，上柱流速為1 3BV/h，洗脫液棄去；用60% 80% 乙醇洗脫，流速為2 5BV/h，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮真空乾燥後即可得到重樓總皂 苷提取物47.1g。此重樓總皂苷提取物中皂苷總含量為60.6% 63.2%，其中皂苷A (薯蕷皂苷元 -3-0《丄-阿拉伯糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(l一2) ]-p-D-葡萄糖苷)、皂苷B (薯蕷 皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2)]-卩-D-葡萄糖苷)、皂苷C(薯蕷皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4)-[ct-L-鼠李糖基(1—2)]-卩-D-葡萄糖苷 ) 、 皂苷 D ( 偏諾皂苷元-3-0-a-L-阿拉伯糖基(1 —4 ) -[a-L-鼠李糖基(1 —2) ]-(3-D-葡萄糖苷)、皂苷E (偏諾皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(l一2) ]-(3-D-葡萄糖苷)、皂苷F (偏諾皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2) ]-P-D-葡萄糖苷)的含量合計為11%。二、 重樓總皂苷提取物對肺腺癌細胞株體外生長的抑制作用體外培養小鼠肺腺癌細胞株LA795,加入上述重樓總皂苷提取物，測定總皂苷作用 24h後肺腺癌細胞的情況，結果表明，IC5o為24.33嗎/mL，並有良好的量效關係。三、 重樓總皂苷提取物對移植性肺腺癌T739小鼠的藥效作用取接種小鼠肺腺癌細胞株LA795後第6_8天腫瘤生長良好的荷瘤鼠，拉斷頸椎處 死小鼠，在無菌條件下剝離腫瘤，選擇新鮮無壞死的瘤組織剪碎後置於玻璃研磨器中， 加適量生理鹽水輕輕研磨而製備成瘤細胞懸液，將該懸液經細胞篩過濾後加生理鹽水稀 釋、計數，並調配成細胞濃度為lxlO々mL的細胞懸液，然後在冰浴條件下接種於健康小 鼠右前肢腋窩皮下，接種量為每隻0.2mL，接種濃度為2xl06/mL 。接種5天後的小鼠按 瘤大小分為四組，並開始給藥，每日一次(1)模型組，生理鹽水灌胃，每隻0.2ml; (2)環磷醯胺組，按20mg/kg' bw腹腔注射；(3)重樓總皂苷高劑量組按400mg/kg bw灌胃；(4)重樓總皂苷低劑量組按200mg/kg' bw灌胃。給藥前及處死前分別稱量小鼠體重。於給藥後第15天處死，解剖取其實體瘤、肺、 肝、脾、腎， 一半保存於10%中性福馬林中， 一半保存於液氮。其中瘤組織及脾臟稱重，分別按下列公式計算抑瘤率和脾指數抑瘤率(％) = [(1-給藥組平均瘤質量/對照組平均瘤質量)X100%];脾指數脾重(mg)/體重(g)。將在福馬林中保存的肺、肝臟、 腎臟和實體瘤組織做石蠟切片，常規HE染色，光學顯微鏡下觀察各組織病理學形態及肺、 肝、腎內瘤栓與轉移灶情況。結果表明，重樓總皂苷給藥組荷瘤小鼠的瘤重明顯小於模型組，並具有劑量效應關 系。重樓總皂苷抑瘤率分別可達41.82%和38.53%，實體瘤重與模型組相比具極顯著性差 異(P<0.01)(見表l)。體重除模型組外其它給藥組均有減少，但給藥前後體重對比無顯著性差異。脾指數與模型組相比無顯著性差異(見表2)。觀察肺組織HE染色結果顯示，各組除有少許炎性浸潤外，無明顯異常。各組瘤栓與 轉移灶情況為，重樓總皂苷組瘤栓極少，只發現散在的小轉移灶，其中高劑量組數量少 於低劑量組；環磷醯胺組與模型組都有多個較大的瘤栓與轉移灶，其中環磷醯胺組數量 多於模型組。觀察肝臟組織HE染色結果顯示，模型組和重樓總皂苷組肝臟除有少數點狀壞死灶 外，結構無明顯異常；環磷醯胺組肝臟細胞亦有損傷，有點狀壞死灶，肝細胞胞漿鬆化， 成顆粒狀。各組瘤栓與轉移灶情況為，模型組大部分肝臟血管內有瘤栓，瘤栓內瘤細胞 許多呈分裂相，並有向肝細胞轉移的趨勢，肝細胞內散在多個轉移灶；環磷醯胺組血管 內極少瘤栓，肝臟中亦極少轉移灶；重樓總皂苷組血管內瘤栓和肝臟中轉移灶都很少， 且瘤栓中瘤細胞多有變性，並伴有壞死。以上情況各組高低劑量無明顯差異。觀察腎臟組織HE染色結果顯示，各組組織結構無明顯異常，未發現瘤栓與轉移灶。表l重樓總皂苷對T739小鼠LA795肺腺癌移植性腫瘤抑瘤率的影響組別劑量(mg/kg/d)實體瘤重(g)抑瘤率(％)模型組一6.2878±0.5551環磷醯胺組202.7607±0.4049**56.09總皂苷高劑量組4003.6584±0.6546**41.82總皂苷低劑量組2003.8651±0.1999**38.53與模型組比較**p<0.01表2重樓總皂苷對LA795肺腺癌移植T739荷瘤小鼠的體重和脾指數的影響組別 劑量 體重(g) 脾指數四、重樓總皂苷對粘附分子ICAM-1、血管內皮生長因子VEGF、基質金屬蛋白水解 酶MMP-2、 MMP-9及基質金屬蛋白水解酶抑制劑TIMP-2的影響免疫組化染色(S-P法)採用生物素標記的第一抗體與鏈酶素抗生物素蛋白連接的過 氧化物酶及基質色素混合液來測定細胞和組織中的抗原。結果顯示，重樓總皂苷給藥組小鼠的肝、肺、瘤組織染色後，粘附分子ICAM-1、血 管內皮生長因子VEGF、基質金屬蛋白水解酶MMP-2、 MMP-9的陽性表達率和表達強度模型組 環磷醯胺組 總皂苷高劑量組 總皂苷低劑量組均低於模型組與環磷腺胺組，基質金屬蛋白水解酶抑制劑TIMP-2的陽性表達率和表達強 度均高於模型組與環磷腺胺組。五、重樓總皂苷對粘附分子ICAM-1、基質金屬蛋白水解酶MMP-2、 MMP-9及基質金 屬蛋白水解酶抑制劑TIMP-2基因的影響採用Real-time PCR方法檢測重樓總皂苷對小鼠的肝、肺、瘤組織中粘附分子 ICAM-1、血管內皮生長因子VEGF、基質金屬蛋白水解酶MMP-2、 MMP-9及基質金屬 蛋白水解酶抑制劑TIMP-2基因的影響。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合 成。結果顯示，重樓總皂苷能夠促進基質金屬蛋白水解酶抑制劑TIMP-2基因的表達，但 抑制粘附分子ICAM-1、血管內皮生長因子VEGF、基質金屬蛋白水解酶MMP-2、 MMP-9 基因的表達。下面結合具體實施例對本發明提供的具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物藥物 製劑進行詳細說明。 實施例1膠囊劑(以重量百分比計) 重樓總皂苷 66% 玉米澱粉 5% 糊精 10% 微晶纖維素 10% 磷酸一氫鈣 3% 微粉矽膠 6%將上述輔料加入適量的85%乙醇潤溼而製成軟材，過20目篩制粒，4(TC乾燥lh， 再過20目篩整粒，所得顆粒灌入膠囊，製成成品。 實施例2注射劑(以重量百分比計)重樓總皂苷 98.1% 氯化鈉 0.9% 吐溫一80 1%取注射用水煮沸，投入重樓總皂苷，攪勻，煮沸3 7分鐘，冷卻至室溫，濾過，加 入氯化鈉，腳板，加熱到65'C加入吐溫-80，攪勻，濾過，0.22pm微孔濾膜過濾，分裝， 蒸汽滅菌1小時，灌裝。實施例3片劑(以重量百分比計) 片芯重樓總皂苷 66% 玉米澱粉 14%糊精 10% 羧甲基澱粉鈉 8% 硬脂酸鎂 2 %包衣優特奇EPO水分散體 增重3%將上述片芯中各種輔料除硬脂酸鎂外混合均勻，加入適量乙醇潤溼製成軟材，過20 目篩制粒，4(TC乾燥lh，再過20目篩整粒，等量遞加法加入硬脂酸鎂，混合均勻，壓制 硬度為60N的片芯。將製得片芯加入包衣鍋中，以一定速度噴射優特奇EPO水分散體 進行包衣，直至增重達到3%，製得包衣片晾乾，得到最終產品。
權利要求
1、一種具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物，其特徵在於所述的抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物是經過按順序進行的下列步驟製成1)將雲南產滇重樓的粗粉過5目篩後分別用4倍體積比的70％～85％乙醇浸泡1小時，然後在85℃的溫度下加熱回流提取3次，每次2小時，合併提取液並濃縮而得到浸膏；2)將上述浸膏加入到50～100倍體積比的0％～20％乙醇中並分散均勻，離心，沉澱後再溶解，再離心，重複2次，合併上清液；3)將上述上清液經大孔吸附樹脂層析柱，所用幹樹脂量按照與浸膏重量比例為4∶1～10∶1計算，上柱流速為1～3BV/h，洗脫液棄去；用60％～80％乙醇洗脫，流速為2～5BV/h，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮真空乾燥後即可得到重樓總皂苷提取物。
2、 根據權利要求l所述的具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物，其特徵在於 所述的重樓總皂苷提取物中皂苷總含量為60.6% 63.2%，其中皂苷A (薯蕷皂苷元 -3-0-a-L-阿拉伯糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2)]-卩-D-葡萄糖苷)、皂苷B (薯蕷 皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2)]-卩-D-葡萄糖苷)、皂苷C (薯蕷皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(l一2)]-卩-D-葡萄糖苷)、皂苷D (偏諾皂苷元-3-0-a-L-阿拉伯糖基(1 —4) -[a-L-鼠李糖基(1 —2)]-卩-D-葡萄糖苷)、皂苷E (偏諾皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2)]-卩-D-葡萄糖苷)、皂苷F (偏諾皂苷元-3-0-a-L-鼠李糖基(1—4) -a-L-鼠李糖基(1—4) -[a-L-鼠李糖基(1—2) ]-p-D-葡萄糖苷)的含量合計為11%。
3、 一種如權利要求l所述的具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物藥物製劑，其 特徵在於所述的具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物藥物製劑由作為活性成分的 重樓總皂苷提取物和藥用輔料組成，其中重樓總皂苷提取物佔藥物製劑總量的重量百分 比為60% 98%。
4、 根據權利要求3所述的具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物藥物製劑，其特 徵在於所述的藥物製劑包括膠囊劑、注射劑、片劑、顆粒劑、溶液劑或懸浮劑、粉劑 及栓劑。
全文摘要
一種具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物及其藥物製劑。所述的藥物製劑由作為活性成分的重樓總皂苷提取物和藥用輔料組成，其中重樓總皂苷提取物佔藥物製劑總量的重量百分比為60％～98％。本發明提供的具有抗腫瘤轉移作用的重樓總皂苷提取物及其藥物製劑對動物移植性腫瘤細胞的轉移具有良好的抑制作用，表現在(1)對接種的小鼠肺腺癌、人肺癌、人胃癌、人腸癌、人肝癌及其他瘤株的近交系小鼠和裸小鼠轉移模型有顯著的抗轉移作用；(2)對轉移相關蛋白有明顯影響；(3)對轉移相關基因有明顯影響，且對主要臟器沒有明顯毒性。另外，由於該藥物製劑的主要活性成分為中藥提取物，因而相對化學治療藥物而言具有毒副作用小的優點。
文檔編號A61K36/896GK101214342SQ20081005209
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月17日 優先權日2008年1月17日
發明者滿淑麗, 顏璐璐, 高文遠 申請人:天津大學