菲利普孢囊線蟲特異性scar標記及其快速pcr檢測方法
2023-06-29 00:12:06 1
專利名稱：菲利普孢囊線蟲特異性scar標記及其快速pcr檢測方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記全序列、特異性 SCAR標記引物序列及菲利普孢囊線蟲SACR特異性快速PCR檢測方法。
背景技術：
小麥孢囊線蟲(CCN)是溫帶禾穀作物上的世界性重要病原線蟲，自1874年在德國被發現以來，隨後在英國、俄羅斯、挪威、澳大利亞、加拿大、日本、印度、美國、紐西蘭、中國等40多個國家均發生不同程度的危害，嚴重影響禾穀作物尤其是對麥類作物的產量和質量。我國自1989年彭德良等首次在我國湖北天門縣發現禾穀孢囊線蟲為害小麥後，目前已發現在湖北、河北、河南、北京、山西、內蒙古、青海、安徽、江蘇、山東、甘肅、陝西、寧夏等13 省市都有CCN的分布。CCN已成為嚴重威脅我國小麥生產的主要病害。小麥禾穀孢囊線蟲(CCN)最早是被德國人Kuhn在1874年發現的，起初被認為是甜菜孢囊線蟲(Heterodera schachtii)，1934年Filipjev單獨建立了一個種H. avenae。目前這些危害禾穀類作物的Heterodera屬的孢囊線蟲種統一被定義為禾穀孢囊線蟲組。在這個組群中對禾穀類作物危害最大的為三個種，禾穀孢囊線蟲(H. avenae)，菲利普孢囊線蟲(H. filipjevi)和大麥孢囊線蟲(H. Iatipons)。菲利普孢囊線蟲(H. filipjevi) 1981年首次在塔吉克斯坦發現，目前已經德國、 英國、瑞士、挪威、伊朗、美國等國家發生危害，是國際小麥等禾穀類作物生產中面臨的潛在威脅性線蟲。2009年彭德良等在我國河南省開展小麥孢囊線蟲病發生危害和跨區收割是否傳播小麥孢囊線蟲病的調查中首次採集和鑑定出菲利普孢囊線蟲，目前菲利普孢囊線蟲已經在河南省的許昌市，臨潁縣，衛輝縣，延津縣等地區發現和危害小麥。菲利普孢囊線蟲與禾穀孢囊線蟲(H. avenae)非常相似。主要區別在於其陰門錐有明顯的下橋結構。目前菲利普孢囊線蟲的鑑定多數情況下仍然依賴於傳統的形態學鑑定方法，生理小種和致病性的鑑定主要是用鑑別寄主或寄主植物的不同品種的反應型來確立。但形態學鑑定非常困難，需要許多的技術、耗時、費力且許多表型特徵的不穩定性，形態特徵測量值有重疊等原因使鑑定時常出現誤差。以PCR為基礎的分子生物學技術為解決線蟲鑑定診斷存在的問題提供了最有力的工具。特異性引物PCR或多重PCR技術是近年來線蟲分子診斷取得的重要進展。通過一次PCR測驗就可以在混合樣品中特異性地檢測出一個或多個線蟲種。基於核糖體 DNA(rDNA)而構建的線蟲特異性引物進展較快，在診斷根腐線蟲、根結線蟲中取得了突破性進展，形成了特異性診斷4種重要根腐線蟲如穿刺根腐線蟲P. penetrans、斯克裡布根腐線蟲P. scribneri、咖啡根腐線蟲P. Coffeae和盧賽根腐線蟲P. Ioosi的特異性引物，以及3 種根結線蟲如戚烏得根結線蟲M. Chitwoodi、法拉克斯根結線蟲M. fallax和北方根結線蟲 M. Hapla(Zi jlstra, C. 1997，Petersen et al.，1997，Williamson et al.，1997)的特異性引物，診斷的水平達到單條幼蟲的水平。Mulholland et al. (1996)分別構建了馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的特異性引物，描述了一種基於rDNA-ITS區域特異性等位多重PCR技術檢測這兩種線蟲的方法，能快速鑑定馬鈴薯白線蟲和馬鈴薯金線蟲及其複合種群。與標準的PCR途徑不同，這一技術在每個PCR反應中應用了 3個引物，通用引物5. SSrRNA、馬鈴薯金線蟲的特異性引物ITSl-Gr 和馬鈴薯白線蟲的特異性引物ITSl-Gp。Bulman & Marshall (1997)成功應用多重PCR技術快速診斷馬鈴薯孢囊線蟲。在研究了秘魯和澳大利亞的馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的 rDNA-ITS的序列結構基礎上，構建了馬鈴薯金線蟲的特異性引物PITSrf和白線蟲的特異性引物PITSp4，通用引物ITS5與PITSrf可以擴增34!3bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，與 PITSp4可以擴增出265bp特異性識別馬鈴薯白線蟲的DNA片段。在一個PCR反應中，使用 PITSr3，PITSp4和ITS5這3個引物，即使複合種群中金線蟲DNA的含量僅為白線蟲的百分之一，也能從複合種群檢測出金線蟲。彭德良和SiAbotin等Q001)構建了基於rDNA-ITS區域上的大豆孢囊線蟲特異性引物GlyFl，應用兩組引物D3A和D!3B及大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl和引物rDNA2 成功地對大豆孢囊線蟲進行了分子診斷研究。第一對引物D3A和D!3B是證實PCR擴增的成功性，第二對引物GlyFI和rDNA2是特異性檢測大豆孢囊線蟲。用這兩對引物進行的雙倍PCR擴增，從所有52個大豆孢囊線蟲群體都擴出了大豆孢囊線蟲的特異性DNA片段 (ISlbp)，而在所有測試的其他8種孢囊線蟲22群體沒有ISlbp片段。大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl靈敏性非常高，能從單條幼蟲的微量DNA中擴增出大豆孢囊線蟲種特異性片段。Amiri,Subbotin 等 Q002)構建了基於 rDNA-ITS 的甜菜孢囊線蟲(H. schachtii) 特異性引物SHF6。將特異性引物SHF6與通用引物AB^引物結合，同時將通用引物D2A和 D3B放在一個PCR反應體系中，從58個孢囊線蟲群體中成功地鑑定出甜菜孢囊線蟲，從36 個甜菜孢囊線蟲群體中擴增200bp特異性片段，而沒有甜菜孢囊線蟲(H. schachtiDDNA的樣品沒有200bp的片段。而基於基因組DNA的SCAR標記植物線蟲特異性引物進展較慢。但在馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的快速分子診斷中取得進展，Fullanodo, A. et. al. (1999)用隨機引物 0PG5分別擴增出區分馬鈴薯金線蟲特異性RAPD標記片段為826bp，馬鈴薯白線蟲特異性 RAPD標記片段為llOObp。對擴增出的馬鈴薯金線蟲和白線蟲的RAPD標記片段進行全序列分析，將RAPD標記轉化成SCAR標記，設計出馬鈴薯金線蟲FullGrf和FullGrr以及馬鈴薯白線蟲的SCAR特異性標記引物Ful IGpf和Fu 1 IGpr，用Ful IGrf和Ful IGrr擴增出了 315bp 馬鈴薯金線蟲的特異性片段，用FullGpf和FullGpr擴增出798bp的馬鈴薯白線蟲的特異性片段。Ou, S. Q. Peng D. L.(歐師琪彭德良等200 採用RAPD技術，獲得了基於大豆孢囊線蟲基因組DNA的特異性SCAR標記，構建了特異性SCAR標記的特異性引物SCNFI和SCNRI， PCR擴增出500bp大豆孢囊線蟲的特異性SCAR片段，選用核糖體引物D2A和D!3B作為內標與上述特異性引物SCNFl和SCNRl相結合，發明了一步雙重PCR方法檢測大豆孢囊線蟲，在 PCR擴增條件下，大豆孢囊線蟲群體都獲得了 500bp的特異性SCAR標記片段和SOObp片段。國內外雖然有關於菲利普孢囊線蟲核糖體DNA的ITS區域研究報導，但是沒有關於菲利普孢囊線蟲特異性引物的報導，更沒有關於基於基因組DNA的菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記引物檢測菲利普孢囊線蟲的研究報導。
發明內容
針對上述技術領域的空白，本發明提供菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記的全長序列，同時提供了特異性SCAR標記的特異性引物。本發明還提供菲利普孢囊線蟲SACR特異性快速PCR檢測方法，為制定線蟲的快速分子檢測、菲利普孢囊線蟲病的早期診斷和制定線蟲病害綜合治理對策服務。菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段，其特徵在於具其如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。根據菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段的設計的特異性引物。優選特異性引物為HfFl和HfRl，其序列為HfFl :5』 -AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3，，HfRl 5' -ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3』。菲利普孢囊線蟲SCAR標記快速PCR檢測方法，其特徵在於PCR反應體系中含有上述引物HfFl禾口 HfRl。所述PCR反應體系中還含有通用引物。所述通用引物序列為TW81:5』 -GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3 』，AB28 :5， -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3，。所述PCR檢測為一步雙重PCR檢測。本發明利用RAPD技術，獲得了基於菲利普孢囊線蟲基因組DNA的特異性RAPD標記，將RAPD標記轉換成SCAR標記，經克隆測序後獲得了特異性SCAR標記的全長序列SEQ IDN01，根據該特異性SCAR標記，可以設計出其特異性引物，用於菲利普孢囊線蟲的快速 PCR檢測。本發明構建了特異性SCAR標記的特異性引物HfFl和HfRl (即SEQ ID N02和SEQ ID N03)。利用菲利普孢囊線蟲特異性引物HfFl和HfRl，在PCR擴增條件下，所有菲利普孢囊線蟲群體都獲得了 313bp的特異性SCAR標記片段，而其它線蟲類則沒有313bp的特異性 SCAR標記片段。為防止假陰性反應，可以在PCR反應體系中加入通用引物作內標。本發明選用核糖體引物TW81和AB^與上述特異性引物HfFl和HfRl相結合，利用一步雙重PCR 方法檢測菲利普孢囊線蟲，在PCR擴增條件下，菲利普孢囊線蟲群體都獲得了 313bp的特異性SCAR標記片段和IOOObp片段，而其它線蟲類則沒有31!3bp的特異性SCAR標記片段，只有IOOObp片段，增加了可靠性。本發明構建的特異性引物HfFl和HfRl，其特異性強，準確， 靈敏。本發明應用特異性SCAR標記及核糖體基因相結合的一步雙重聚合酶鏈式反應 PCR檢測技術檢測目標線蟲，與重複性較差的RAPD技術(RAPD-PCR)、核糖體DNA限制性內切酶技術(RFLP-PCR)檢測方法相比，更能夠省時、準確、靈敏，更能建立快速、準確的菲利普孢囊線蟲檢測技術。該技術可應用於對菲利普孢囊線蟲田間土壤樣品及菲利普孢囊線蟲病發生的早期快速分子檢測，具有實際的應用價值。
圖1 用隨機引物0PC06擴增菲利普孢囊線蟲、禾穀孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲和 Heterodera Iatipons等線蟲群體的RAPD的特異性DNA片段結果，M為標準DNA分子標記(DNA marker DL 2, 000) ； 1-6分別為菲利普孢囊線蟲(編碼為HfOl，Hf02, Hf07, HflO, Hf 11，Hf 12)，7-8分別為禾穀孢囊線蟲群體(編碼為HaOl， Ha02)，9-ll分別為大豆孢囊線蟲群體(編碼為HgOl，Hg02，Hg03) ； 12為Heterodera Iatipons群體(編碼為H101) ；13為陰性對照；圖2 用菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記引物(HfFl和HfRl)擴增菲利普孢囊線蟲的結果，M為標準DNA分子標記(DNA marker DL 2, 000) ；1-11分別為菲利普孢囊線蟲不同群體(編碼為 HfOl, Hf02, Hf03, Hf04, Hf05, Hf06, Hf07, Hf08, Hf09, HflO, Hfll) ；12 為禾穀孢囊線蟲群體(編碼為HaOl) ；13為大豆孢囊線蟲群體(編碼為HgOl) ；14為陰性對照；圖3 菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記引物與通用引物(TW81和AB28)結合一步雙重PCR檢測結果，M為標準DNA分子標記(DNA marker DL 2, 000) ；1-11分別為菲利普孢囊線蟲 (HfOl, Hf02, Hf03, Hf04, Hf05, Hf06, Hf07, Hf08, Hf09, HflO, Hfll) ；12 為陰性對照；圖4 菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記引物與通用引物(TW81和AB28)結合一步雙重PCR檢測5種孢囊線蟲的結果，M為標準DNA分子標記(DNA marker IOObp) ;1_4為菲利普孢囊線蟲群體HfOl， Hf02, Hf07, HflO ；5-12 為禾穀孢囊線蟲群體 HaOl，Ha02, Ha03, Ha04, Ha05, Ha06, Ha07, Ha08 ；13為大豆孢囊線蟲群體HgOl ；14為馬鈴薯腐爛莖線蟲群體DdOl ；15為香蕉穿孔線蟲群體 RsOl ；16 為 Heterodera Iatipons 群體 HlOl ；17 陰性對照
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。本發明的實驗選用的材料12個菲利普孢囊線蟲群體為本實驗室長期從河南省許昌市，臨潁縣，衛輝縣，等地收集保存的孢囊線蟲種群，8個禾穀孢囊線蟲群體為本實驗室從北京、河北、河南等省市收集保存。3個大豆孢囊線蟲群體，1個豌豆孢囊線蟲群體，1個旱稻孢囊線蟲群體，1個馬鈴薯腐爛莖線蟲群體，1個香蕉穿孔線蟲群體為本實驗保存(見表1、表2)。上述線蟲本實驗室均有保存，可以對公眾發放。表1菲利普孢囊線蟲樣品代碼及群體來源
權利要求
1.菲利普孢囊線蟲特異SCAR標記的DNA片段，其特徵在於該DNA片段具其SEQID NOl所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段設計的特異性引物。
3.根據權利要求2所述的特異性引物為HfFl和HfRl，其核苷酸序列為HfFl 5' -AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3，，HfRl :5，-ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3，。
4.菲利普孢囊線蟲SCAR標記快速PCR檢測方法，其特徵在於PCR反應體系中含有權利要求2所述的特異性引物。
5.菲利普孢囊線蟲SCAR標記快速PCR檢測方法，所述的特異性引物為HfFl和HfRl， 其核苷酸序列為HfFl 5' -AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3，，HfRl :5，-ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3，。
6.根據權利要求4或5所述的菲利普孢囊線蟲SCAR標記快速PCR檢測方法，所述PCR 反應體系中還含有通用引物。
7.根據權利要求6所述的菲利普孢囊線蟲SCAR標記快速PCR檢測方法，所述通用引物序列為TW81 5' -GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3，，AB28 :5』 -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3，。
8.根據權利要求7所述的菲利普孢囊線蟲SCAR標記快速PCR檢測方法，所述PCR檢測為一步雙重PCR檢測。
全文摘要
本發明為「菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記及其快速PCR檢測方法」，屬生物技術領域。菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段，其特徵在於該DNA片段具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。根據菲利普孢囊線蟲特異性SCAR標記的DNA片段設計的引物HfF1和HfR1，在PCR快速檢測菲利普孢囊線蟲的方法中，可擴增出313bp的片段，同時還可以在PCR反應體系中加入通用引物TW81和AB28作為內標，能同時擴增出1000bp的片段。本發明提高了分子檢測靈敏度並且快速準確，在菲利普孢囊線蟲檢測和菲利普孢囊線蟲病的早期診斷方面，具有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102329793SQ20111033865
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月31日 優先權日2011年10月31日
發明者亓曉莉, 彭德良, 彭煥, 賀文婷, 黃文坤 申請人:中國農業科學院植物保護研究所