一種快速高效檢測魚源性寄生蟲囊蚴的方法
2023-06-28 12:41:06 1
專利名稱：一種快速高效檢測魚源性寄生蟲囊蚴的方法
技術領域：
本發明涉及水產養殖中魚的寄生蟲檢測，具體地說，是一種快速高效檢測魚源性寄生蟲囊蝴的方法。
背景技術：
食源性寄生蟲是指通過飲食傳播引起人類疾病的寄生蟲。食物與寄生蟲的關係包括兩種:一是食物本身含有各期發育不同階段的寄生蟲，在加工或烹調過程中，未將其殺死而吃後感染，這些食物稱為寄生性食物，尤以動物性食物為主；二是食物本身不含寄生蟲，只是在生長、運輸、加工過程中被寄生蟲蟲卵或包囊、囊蝴、卵囊所汙染而吃後感染，這些食物稱為汙染性食物，一般以植物性食物為主。食源性寄生蟲病按寄生食物種類劃分，大體可分為魚源性寄生蟲病、螺源性寄生蟲病、肉源性寄生蟲病、兩棲類與爬行類寄生蟲病、植物源性寄生蟲病和昆蟲類寄生蟲病等。其中魚源性寄生蟲病中又包括華支睪吸蟲病，該病又稱肝吸蟲病，是由華支睪吸蟲寄生在人的肝膽管內所引起的肝膽病變為主的一種人獸共患寄生蟲病，是當前我國最嚴重的食源性寄生蟲病之一。華支睪吸蟲(CVozjorcAj's隸屬於後睪科,支睪吸蟲屬。該吸蟲背腹扁平，稍狹長，長寬為(8-15) X (l_4)mm，寄生於人、哺乳類動物的肝膽管內，引起膽管炎、膽囊炎、肝腫大、肝受損等疾患，稱華支睪吸蟲病，俗稱肝吸蟲病。人體感染是因食生的或未煮熟的含有其囊蝴的第二中間宿主魚、蝦而引起的。沼螺與淡水魚蝦分別是華支睪吸蟲的第
1、2中間宿主，國內外迄今已報告132種魚、3種蝦可充當華支睪吸蟲的第2中間宿主，如鯉魚、鯽魚、草魚、白鰱、麥穗魚、米蝦、沼蝦等。目前已有通過壓 片法和常規消化法等來檢測魚體內寄生蟲囊蝴的方法，壓片法具體操作為:採集樣品魚，分別取魚鰓、魚背、魚鰭基部約豌豆大小的肌肉組織，壓成薄片後在解剖鏡下觀察組織樣品中是否存在華支睪吸蟲囊蝴。常規消化法具體操作為:將樣品魚進行稱重，並剪成碎小狀，放入燒杯中，按照魚重量:消化液體積=1: 10加入消化液(2g胃蛋白酶溶於IOOml雙蒸水中，使用前加0.7ml 100%濃鹽酸)，37°C消化6_8h。消化產物用80目網篩過濾，靜置30min後棄去上清液，重複水洗沉澱步驟直至上清液澄清。將沉澱吸入平皿，用解剖鏡檢查是否有囊蝴存在。但上述兩種方法檢出率和操作步驟都有一定局限性。壓片法檢出率不高，容易造成漏檢、誤檢，同時不易操作，需要具有一定經驗才可掌握，並對囊蝴外觀形態具有一定破壞性，不易進行種類鑑定；常規消化法雖然具有較高的檢出率，同時也能夠保證囊蝴的完整程度，但因為其耗時過久，對基層操作和大規模的調查檢測具有一定局限性，難以滿足現階段大規模採樣檢測的需求。因此亟需一種快速高效、檢出率高且對囊蝴外觀形態破壞性小的檢測方法，但是目前關於這類方法還未見報導。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種快速高效檢測魚源性寄生蟲囊蝴的方法。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是:
一種快速高效檢測魚源性寄生蟲囊蝴的方法，包括以下步驟:
1)將樣品剪成碎小狀，加入胃蛋白酶溶液，所述的胃蛋白酶溶液體積與樣品重量的比例是(20-50ml) /300g，用勻漿機將混合好的樣品攪拌至勻漿狀，將勻漿液移入燒杯；
2)向燒杯中加入胃蛋白酶溶液，所述的胃蛋白酶溶液體積與樣品重量的比例是(200-500ml)/300g，混勻後於37°C恆溫箱中放置1.5_3h (根據樣品組成情況，可適當延長時間)，向燒杯中加滿水，攪拌後沉澱l_3min，棄去一定體積的上清液；
3)用篩網過濾，並用適量水邊衝洗邊過濾；
4)向濾液中加水後攪拌並靜置l_3min，棄上清液，再加水沉澱，重複沉澱濾洗直至上清液較為清澈；
5)將沉澱移至盛有少量生理鹽水的培養皿中，順時針輕微搖動培養皿使沉澱集中於培養皿中部；
6)在顯微鏡下觀察並鑑定寄生蟲囊蝴；
其中，所述的胃蛋白酶溶液為每1，000ml H2O中含8ml濃鹽酸和6g胃蛋白酶(1:10，000U )的溶液，所述的胃蛋白酶為1:10，000U。優選的，步驟I)中所述的樣品的重量彡300g ;取樣時，如整條魚重量彡300g，則解剖整條魚剪碎勻漿，如整條魚重量> 300g，則解剖整條魚後從魚的不同部位按比例取適量樣品，剪碎後混合勻漿。優選的，在步驟2)中所述的「於37°C恆溫箱中放置1.5_3h」期間攪拌3_8次。優選的，步驟2)中所述的水為自來水，但不僅限於此，也可以是蒸餾水、無菌水等。步驟3)所述的篩網的孔徑為80-150目。所述的方法還包括分離收集囊蝴。所述的方法還包括按以下公式計算感染度:感染度=樣品中囊蝴的數量/樣品的重量。本發明優點在於:
1、本發明的方法與常規消化法相比:1)增加了使用攪拌機對樣品組織塊攪拌的步驟，利用工具加工使樣品組織成為勻漿狀組織液，便於胃蛋白酶液進行消化；2)在攪拌前向樣品組織中加入少量胃蛋白酶液，使之在攪拌過程中能與樣品充分接觸，可縮短酶液的反應時間；3)在樣品組織經胃蛋白酶消化後，增加了向燒杯中加入水，攪拌沉澱，棄去上清的步驟，然後再進行篩網過濾，該增加的步驟可稀釋勻漿狀組織液，便於降低粘稠度，從而提高過濾效率，減少過濾次數。因而本發明的方法縮短了整個檢測過程的時間，僅需1.5-3h，而常規消化法需要6_8h ；
2、相比於常規消化法，本發明的方法通過採取上述促進胃蛋白酶和樣品組織接觸的措施，減少了胃蛋白酶的用量；
3、本發明的方法在實施過程中對囊蝴傷害小，分離出囊蝴後，能夠在較長時間段內保持囊蝴存活，便於後期相關操作；
4、本發明的方法檢出率高，與常規消化法相比無顯著差異。
附圖1是華支睪吸蟲囊蝴顯微圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。本文中，鯇魚採集自廣東茂名市農貿市場，胃蛋白酶(1:10，000U)購於國藥集團化學試劑有限公司。實施例1-5中所述的胃蛋白酶溶液為每1，000ml H2O中含8ml濃鹽酸(12 mol/L)+6g胃蛋白酶(1:10，000U);魚體內寄生蟲感染度，即每克魚中囊蝴的數量的計算公式為:
感染度=樣品中囊蝴的數量/樣品的重量。實施例1 ■魚華支睪吸蟲(67oflorcAis囊蝴的檢測
1)取樣，測量並記錄魚的大小和重量300g，解剖後將樣品剪成碎小狀，加入30ml胃蛋白酶溶液，然後用勻漿機攪拌至勻漿狀，將勻漿液移入IL燒杯中；
2)加入胃蛋白酶溶液300ml左右，混勻後於37°C恆溫箱中放置2.5h (期間攪拌3次)，向燒杯中加滿自來水，攪拌後沉澱2min，棄去2/3體積的上清液；
3)用150目篩網過濾，並用適量水邊衝洗邊過濾，收集濾液；
4)向濾液中加水後攪拌並靜置1.5min，棄上清液，再加水沉澱，重複5次直至上清液較為清澈；
5)將沉澱移至盛有少量生理鹽水的培養皿中，順時針輕微搖動培養皿使沉澱集中於培養皿中部；
6)在顯微鏡下觀察並鑑定寄生蟲囊蝴(華支睪吸蟲囊蝴顯微圖如圖1所示，可見囊蝴形狀保持完整，外觀形態受到的破壞小)，將囊蝴進行分離收集，計數；
7)按照公式計算魚體內寄生蟲感染度。實施例2鉤棘單睪吸蟲/WffiiJrO)囊蝴的檢測
1)取樣，測量並記錄魚的大小和重量465g，解剖後從魚的不同部位(頭、鰓、肌肉、鰭、鱗片、腸和其餘內臟)按比例取適量樣品，將各個部位的樣品混合，混合後總重量為300g，剪成碎小狀，加入50ml胃蛋白酶溶液，用勻漿機攪拌至勻漿狀，將勻漿液移入IL燒杯中；
2)加入胃蛋白酶溶液500ml左右，混勻後於37°C恆溫箱中放置3h(期間攪拌4次)，向燒杯中加滿自來水，攪拌後沉澱3min，棄去2/3體積的上清液；
3)用100目篩網過濾，並用適量水邊衝洗邊過濾，收集濾液；
4)向濾液中加水後攪拌並靜置2min,棄上清液,再加水沉澱，重複6次直至上清液較為
清澈；
5)將沉澱移至盛有少量生理鹽水的培養皿中，順時針輕微搖動培養皿使沉澱集中於培養皿中部；
6)在顯微鏡下觀察並鑑定寄生蟲囊蝴，並將囊蝴進行分離收集，計數；
7)按照公式計算魚體內寄生蟲感染度。實施例3扇棘單睪吸蟲iaicAwi )囊蝴的檢測
I)取樣，測量並記錄魚的大小和重量510g，解剖後從魚的不同部位(頭、鰓、肌肉、鰭、鱗片、腸和其餘內臟)按比例取適量樣品，將各個部位的樣品混合，混合後總重量為250g，剪成碎小狀，加入33ml胃蛋白酶溶液，用勻漿機攪拌至勻漿狀，將勻漿液移入IL燒杯中；
2)加入胃蛋白酶溶液400ml左右，混勻後於37°C恆溫箱中放置3h(期間攪拌4次)，向燒杯中加滿自來水，攪拌後沉澱3min，棄去2/3體積的上清液；
3)用80目篩網過濾，並用適量水邊衝洗邊過濾，收集濾液；
4)向濾液中加水後攪拌並靜置2min,棄上清液,再加水沉澱，重複6次直至上清液較為
清澈；
5)將沉澱移至盛有少量生理鹽水的培養皿中，順時針輕微搖動培養皿使沉澱集中於培養皿中部；
6)在顯微鏡下觀察並鑑定寄生蟲囊蝴，並將囊蝴進行分離收集，計數；
7)按照公式計算魚體內寄生蟲感染度。實施例4日本棘隙吸蟲皿5.囊蝴的檢測
1)取樣，測量並記錄魚的大小和重量150g，解剖後將樣品剪成碎小狀，加入15ml胃蛋白酶溶液，然後用勻漿機攪拌至勻漿狀，將勻漿液移入IL燒杯中；
2)加入胃蛋白酶溶液IOOml左右，混勻後於37°C恆溫箱中放置1.5h (期間攪拌2次)，向燒杯中加滿自來水，攪拌後沉澱3min，棄去2/3體積的上清液；
3)用120目篩網過濾，並用適量水邊衝洗邊過濾，收集濾液；
4)向濾液中加水後攪拌並靜置1.5min，棄上清液，再加水沉澱，重複5次直至上清液較為清澈；
5)將沉澱移至盛有少量生理鹽水的培養皿中，順時針輕微搖動培養皿使沉澱集中於培養皿中部；
6)在顯微鏡下觀察並鑑定寄生蟲囊蝴，並將囊蝴進行分離收集，計數；
7)按照公式計算魚體內寄生蟲感染度。實施例5泰國肝吸蟲)囊蝴的檢測 O鑑定所需檢查的魚為餐條魚；
2)對每條魚的大小和重量進行測量和記錄，魚的質量為200g；
3)對整條魚進行解剖，解剖後將樣品剪成碎小狀，加入20ml胃蛋白酶溶液，然後用勻漿機攪拌至勻漿狀，將勻漿液移入IL燒杯中；
4)加入胃蛋白酶溶液150ml左右，混勻後於37°C恆溫箱中放置1.5h (期間攪拌2次)，向燒杯中加滿自來水，攪拌後沉澱lmin，棄去2/3體積的上清液；
5)用80目篩網過濾，並用適量水邊衝洗邊過濾，收集濾液；
6)向濾液中加水後攪拌並靜置1.5min，棄上清液，再加水沉澱，重複3次直至上清液較為清澈；
7)將沉澱移至盛有少量生理鹽水的培養皿中，順時針輕微搖動培養皿使沉澱集中於培養皿中部；
8)在顯微鏡下觀察並鑑定寄生蟲囊蝴，並將囊蝴進行分離收集，計數；
9)按照公式計算魚體內寄生蟲感染度。實施例6本發明的方法與常規檢測法的比較
在使用實施例1-5的方法檢測寄生蟲囊蝴的同時，另取一份樣品使用常規消化法作對照。常規消化法的具體操作步驟為:將樣品魚進行稱重，並剪成碎小狀，放入燒杯中，按照樣品重量:消化液體積=1: 10(g/ml)加入胃蛋白酶消化液(2g胃蛋白酶溶於IOOml雙蒸水中，使用前加0.7ml 100%濃鹽酸)，37°C消化6_8h，消化產物用對應孔徑的篩網過濾，靜置30min後棄去上清液，重複水洗沉澱步驟直至上清液澄清，最後將沉澱吸入平皿，用解剖鏡檢查是否有囊蝴存在。上述實施例1-5的檢測方法和相應的對照方法分別做50個重複，統計檢出率，結果如表I所示。表I本發明的方法及常規消化法對囊蝴的檢出率(％)
權利要求
1.一種快速高效檢測魚源性寄生蟲囊蝴的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)將樣品剪成碎小狀，加入胃蛋白酶溶液，所述的胃蛋白酶溶液體積與樣品重量的比例是(20-50ml) /300g，用勻漿機將混合好的樣品攪拌至勻漿狀，將勻漿液移入燒杯； 2)向燒杯中加入胃蛋白酶溶液，所述的胃蛋白酶溶液體積與樣品重量的比例是(200-500ml)/300g,混勻後於37°C恆溫箱中放置1.5_3h，向燒杯中加滿水，攪拌後沉澱l-3min,棄去一定體積的上清液； 3)用篩網過濾，並用適量水邊衝洗邊過濾； 4)向濾液中加水後攪拌並靜置l_3min，棄上清液，再加水沉澱，重複沉澱濾洗直至上清液較為清澈； 5)將沉澱移至盛有少量生理鹽水的培養皿中，輕微搖動培養皿使沉澱集中於培養皿中部; 6)在顯微鏡下觀察並鑑定寄生蟲囊蝴； 其中，所述的胃蛋白酶溶液為每1，OOOml H2O中含8ml濃鹽酸和6g胃蛋白酶的溶液，所述的胃蛋白酶為1:10，000U。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟I)中所述的樣品的重量≤300g;取樣時，如整條魚重量≤ 300g，則解剖整條魚剪碎勻漿，如整條魚重量≥300g，則解剖整條魚後從魚的不同部位按比例取適量樣品，剪碎後混合勻漿。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟2)中所述的「於37°C恆溫箱中放置1.5-3h」期間攪拌3-8次。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述的水為自來水。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟3)所述的篩網的孔徑為80-150目。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的方法還包括分離收集囊蝴。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的方法還包括按以下公式計算感染度:感染度=樣品中囊蝴的數量/樣品的重量。
全文摘要
本發明提供一種快速高效檢測魚源性寄生蟲囊蚴的方法1)將樣品剪成碎小狀，按(20-50ml)/300g比例加入胃蛋白酶溶液，勻漿機攪拌至勻漿狀，移入燒杯；2)按(200-500ml)/300g比例加入胃蛋白酶溶液，恆溫箱中放置1.5-3h，加滿水，攪拌後沉澱1-3min，棄上清；3)篩網過濾；4)重複沉澱濾洗直至上清較清澈；5)將沉澱移至盛有少量生理鹽水的培養皿，輕微搖動使沉澱集中於中部；6)觀察並鑑定囊蚴；其中所述的胃蛋白酶溶液為每1,000mlH2O中含8ml濃鹽酸和6g胃蛋白酶(1:10,000U)的溶液。本發明方法顯著縮短了檢測時間，減少了酶的用量，並能在較長時間內保持囊蚴存活，檢出率高。
文檔編號G01N21/00GK103175779SQ201310066269
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月4日 優先權日2013年3月4日
發明者劉利平, 李慷 申請人:上海海洋大學