蘋果MdMYB1基因中與早結果性狀相關的突變及其鑑定方法
2023-06-29 03:18:56 4
蘋果MdMYB1基因中與早結果性狀相關的突變及其鑑定方法
【專利摘要】本發明蘋果MdMYB1基因中與早結果性狀相關的突變及其鑑定方法，屬生物【技術領域】，為在蘋果雜交後代中選擇早結果植株提供依據。利用蘋果著色相關基因MdMYB1中的三處突變，通過設計特異引物，開發出檢測蘋果著色突變的新分子標記，其顯著進步是與國外已有的dCAPS標記、我們開發的CAPS標記相比，不需要進行酶切，操作簡便。利用該標記方法鑑定123株蘋果雜交後代基因突變和果實著色時，發現MdMYB1基因中另外兩處突變與雜交後代早結果性狀相關，可用來設計特異引物開發分子標記，在苗期對蘋果雜交後代進行早期選擇，選出具有早結果性狀的植株加強管理，儘早獲得較多的結果植株；也可用於分子設計育種，選出具有早結果性狀的親本進行雜交，儘早獲得較多的結果植株。
【專利說明】蘋果MdMYBI基因中與早結果性狀相關的突變及其鑑定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及基於蘋果MdMYBl基因突變的分子標記方法鑑定蘋果雜交後代早結果性狀以及果實著色性狀。
【背景技術】
[0002]蘋果(Malus domestica Borkh.)是我國果樹產業中重要的大宗水果,其著色問題是影響我國許多產區蘋果質量的一個重要因素，培育著色好的品種是生產中急需的。利用蘋果著色相關基因的序列變異，開發果實著色性狀的分子標記，提早鑑定雜交後代植株果實著色性狀，對雜交後代植株提早進行篩選，將有助於降低早期試驗費用和工作量，以低成本儘快培育出著色好的蘋果新品種，增強我國蘋果的質量和市場競爭力。
[0003]蘋果的著色與果皮中的花色苷有關，花色苷的合成涉及查爾酮合成酶(CHS)、類黃酮3-羥基化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)、UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖轉移酶(UFGT)等酶的基因。研究表明，花色苷的積累與這些基因、特別是UFGT基因的表達水平有關，這些基因的表達受到MYB家族轉錄因子的調控，MdMYBl基因是一個與果實著色有關的功能基因(Takos 等，2006)。Takos 等(2006)通過分析MdMYBl-1 (GenBank 登錄號 DQ886414)等基因序列，找到了一個與果實著色性狀有關的鹼基突變位點，開發出一個dCAPS標記。dCAPS標記是一種改進的CAPS標記(derived CAPS)，而CAPS標記是指切割擴增的多態性序列標記(Cleaved amplified polymorphic sequence)。Takos 等(2006)開發的 dCAPS標記雖然不能將澳洲青蘋等品種與一些著色品種區分開，但可以區分其它一些著色與非著色品種，可以完全區分雜交親本植株(粉紅女士姊妹株、金帥)及其後代植株，在雜交後代植株的早期選擇中利用價值高。該dCAPS標記的缺點是酶切後的片段長度僅有29bp的差異，利用普通的瓊脂糖電泳無法檢測，需要用價格約為7000元/ 125g的昂貴NuSieve GTG瓊脂糖進行電泳檢測。通過進一步分析MdMYBl基因序列，除dCAPS標記涉及的位點外，我們找出其它2個與蘋果果實著色性狀相關的突變位點，開發出一個可用普通瓊脂糖電泳檢測的CAPS分子標記，可鑑定蘋果植`株果實著色性狀，實驗成本顯著降低。本發明的最初目的是利用MdMYBl基因中與蘋果果實著色性狀相關的突變，開發不需要進行PCR產物酶切、用普通瓊脂糖電泳檢測PCR產物即可鑑定蘋果植株果實著色性狀的分子標記方法。結果不僅利用已知蘋果著色相關基因MdMYBl (GenBank登錄號DQ886414)中與蘋果著色性狀相關的三處鹼基突變，開發出新的分子標記方法，而且發現基於MdMYBl基因中三處突變檢測的非著色性狀等位基因與蘋果雜交後代早結果性狀相關，此結果於2013年10月16日申請專利獲得受理(申請號201310482643.X)。但進一步研究發現，實際上是雜交親本嘎拉蘋果中的非著色性狀等位基因與早結果性狀密切相關，含有雜交親本富士蘋果非著色性狀等位基因的植株結果少。在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1616bp和-1573bp位置的兩處突變皆可鑑別富士和嘎拉蘋果的非著色性狀等位基因:在_1616bp位置，蘋果植株含有鹼基為A的非著色性狀等位基因時具有早結果性狀；在-1573bp位置，植株含有鹼基為T的非著色性狀等位基因時具有早結果性狀。
[0004]我們培育的富士蘋果為親本的另一個雜交群體27株植株，不含有嘎拉蘋果中的非著色性狀等位基因，開始結果比富士與嘎拉的雜交後代晚2年，從另一方面說明嘎拉蘋果中的非著色性狀等位基因與早結果性狀密切相關。
[0005]陳照峰等(1997)、張敏等(1998)報導金帥(又名金冠)是早結果品種，可在3~5年生時結果。鑑於本發明雜交親本之一嘎拉的親本是金帥，這些報導可進一步佐證我們的發現，我們找出了在金帥、嘎拉蘋果中與早結果性狀關係密切的等位基因。等位基因與早結果性狀的關係屬於國內外首次發現，對於蘋果分子設計育種和分子輔助育種具有重要意義。
[0006]參考文獻
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【發明內容】
[0014]本發明基於蘋果MdMYBl基因突變與蘋果雜交後代早結果性狀相關，充分利用基因突變信息設計特異引物和配對引物，開發出檢測突變的分子標記方法，鑑定與蘋果早結果性狀密切相關的等位基因、進而鑑定蘋果植株早結果性狀；本發明的分子標記方法能夠同時鑑定出蘋果著色性狀。
[0015]本發明解決問題所採用的技術方案是:已知蘋果著色相關基因MdMYBl (GenBank登錄號DQ886414)中有三處鹼基突變與蘋果著色性狀相關，一處在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1624bp位置發生突變或者雜合突變:G —A、G —G / A、G —A / T，蘋果植株鹼基為A的等位基因為非著色性狀等位基因、含有鹼基為G的等位基因時具有果實著色性狀；一處在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1603bp位置發生突變或者雜合突變:C — A、C — C /A，蘋果植株鹼基為A的等位基因為非著色性狀等位基因、含有鹼基為C的等位基因時具有果實著色性狀；另一處在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1550bp位置發生突變或者雜合突變:T — C、T — T / C、T — C / A，蘋果植株鹼基為C的等位基因為非著色性狀等位基因、含有鹼基為T的等位基因時具有果實著色性狀。本發明充分利用這些基因突變信息設計兩個特異引物，一個特異引物對應於非著色性狀等位基因，另一個特異引物對應於果實著色性狀等位基因，另外設計兩個引物與兩個特異引物配對，並且設計引物時注意使兩對引物的PCR擴增產物大小有足夠差異便於瓊脂糖膠電泳檢測，然後利用這兩對引物進行PCR擴增檢測突變，PCR產物直接用普通瓊脂糖電泳檢查，根據瓊脂糖電泳檢查結果鑑定蘋果雜交後代等位基因和果實著色性狀，並統計果實結果情況。出現非著色性狀等位基因對應的PCR產物帶時為非著色性狀等位基因、出現果實著色性狀等位基因對應的PCR產物帶時具有果實著色性狀。
[0016]蘋果著色相關基因MdMYBl (GenBank登錄號DQ886414)中的兩處鹼基突變與蘋果早結果性狀相關，一處在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1616bp位置發生與蘋果早結果性狀相關的雜合突變:G —G / A，蘋果植株含有鹼基為A的等位基因時具有早結果性狀；另一處在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1573bp位置與蘋果早結果性狀相關的雜合突變:A —T / A，蘋果植株含有鹼基為T的等位基因時具有早結果性狀。本發明充分利用前述-1624bp、-1603bp、-1550bp和-1616bp、_1573bp位置五處基因突變信息設計兩個特異引物，一個特異引物對應於早結果性狀等位基因，另一個特異引物對應於具有果實著色性狀的等位基因，另外設計兩個引物與兩個特異引物配對，並且設計引物時注意使PCR擴增產物大小有足夠差異便於瓊脂糖膠電泳檢測，然後利用這兩對引物進行PCR擴增檢測突變，PCR產物直接用普通瓊脂糖電泳檢查，根據瓊脂糖電泳檢查結果鑑定蘋果雜交後代等位基因和果實性狀。出現早結果性狀等位基因對應的PCR產物帶時具有早結果性狀，出現果實著色性狀等位基因對應的PCR產物帶時具有果實著色性狀。這些結果可用來對蘋果雜交後代植株早結果性狀進行早期選擇，以便對具有早結果性狀的雜交後代植株加強管理，儘早獲得結果植株；也可以根據瓊脂糖電泳檢查結果選擇蘋果雜交親本，選出具有早結果性狀的親本進行雜交，儘早獲得結果植株。
[0017]本發明的有益效果是:(I)本發明新開發的分子標記可用來鑑定蘋果早結果性狀和果實著色性狀。(2)與現有的鑑定蘋果`果實著色性狀的一個dCAPS標記和一個CAPS標記相比，本發明新開發的分子標記鑑定方法更簡單實用。現有dCAPS標記的PCR擴增產物酶切後，片段長度僅有29bp的差異，利用普通的瓊脂糖電泳無法檢測；我們發明的現有CAPS標記PCR擴增產物的酶切產物片段差異大，可利用普通的瓊脂糖電泳檢測，實驗成本降低，但仍然需要對PCR擴增產物進行酶切；本發明新開發的分子標記鑑定方法不需要對PCR擴增產物進行酶切。(3)與現有技術相比，本發明分子標記方法可節省實驗成本。現有dCAPS標記實驗在3 %的NuSieve GTG瓊脂糖上進行電泳檢測，NuSieve GTG瓊脂糖價格昂貴為6900元/ 125g ;現有CAPS標記實驗在1.2%的普通瓊脂糖上電泳檢測，價格僅220元/ 100g。一次實驗按100ml凝膠溶液計算，則現有dCAPS標記實驗瓊脂糖費用165.6元，現有CAPS標記實驗瓊脂糖費用2.64元，本發明分子標記方法採用普通瓊脂糖電泳，費用低，儘管增加一對引物費用，但省去酶切步驟，可節省限制性內切酶費用。(4)利用本發明可鑑定蘋果雜交後代早結果性狀，對蘋果雜交後代植株進行早期選擇，對選出的雜交後代植株加強管理，儘早獲得結果植株；可選擇具有早結果性狀的蘋果親本進行雜交，儘早獲得結果植株。[0018] 這裡需要說明的是:本發明所用2個蘋果品種富士、嘎拉為生產上栽培的品種，公眾能得到；本發明涉及基因序列為已知MdMYBl基因序列，不涉及核苷酸或胺基酸序列表。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是8個雜交後代PCR擴增產物的電泳圖。圖中M為DNA分子量標記，數字和bp為標記大小與單位，1，2，3，4，5，6，7，8為8個雜交後代植株；
[0020]圖2是實施例18個雜交後代PCR擴增產物的電泳圖，圖中M為DNA分子量標記，左側數字和 bp 為標記大小與單位，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18 為18個雜交後代植株；
[0021]圖3是實施例8個雜交後代PCR擴增產物的電泳圖，圖中M為DNA分子量標記，左側數字和bp為標記大小與單位，I，2，3，4，5，6，7，8為8個雜交後代植株，Dr和Dg為PCR擴增產物帶代表的等位基因代號；
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
[0023]本發明方法實施步驟:
[0024]步驟1，試材:利用富士和嘎拉蘋果作為親本進行雜交獲得種子，種子播種後獲得的蘋果雜交後代植株葉作為試材。
[0025]步驟2，基因組DNA提取:試材研磨後立即加入預熱至65°C的0.6mL2% CTAB提取緩衝液[2% CTAB，IOOmmol / L Tris-HCl (pH8.0),20mmol / L EDTA, 1.4mol / L NaCl,2%PVP-40,2% β -巰基乙醇]，在65°C水浴中提取30min，這期間輕輕倒置樣品試管3次。取出加入0.6mL氯仿:異戍醇(24:1),輕輕翻轉,充分混勻，12000rpm離心lOmin。將上清液轉入另一個新試管，加入等體積經_20°C預冷的異丙醇，輕輕搖勻，在12000rpm離心IOmin後將上清液移去。試管中的DNA球用500 μ L冷的70%乙醇(_20°C )漂洗2次，將試管置於室溫下晾乾，加入30~50 μ L滅菌無離子水或0.2Χ的TE,再加入IyL RNase A (2.5mg /ml)處理除去RNA，在4°C冰箱中保存備用，暫時不用的DNA則冷凍保存。
[0026]步驟3，設計引物:在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊_1624bp位置，蘋果植株含有鹼基A的等位基因為非著色性狀等位基因、含有鹼基為G的等位基因時具有果實著色性狀；在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊_1603bp位置，蘋果植株含有鹼基A的等位基因為非著色性狀等位基因、含有鹼基為C的等位基因時具有果實著色性狀；在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1550bp位置，蘋果植株含有鹼基C的等位基因為非著色性狀等位基因、含有鹼基為T的等位基因時具有果實著色性狀，表明這三處基因突變位點鹼基信息可直接用來鑑定蘋果果實著色性狀，可用來設計引物開發鑑定蘋果果實著色性狀的分子標記。本發明中，我們利用MdMYBl基因序列設計一個特異引物Mb4b (序列為ACCGGACCTATCTCATTCG)，對應於基因轉錄起始點上遊_1603bp位置的突變，用於檢測果實著色性狀；設計另一個特異引物Mb3h (序列為CCAACACCCGCTATGGTCC)，對應於基因轉錄起始點上遊_1550bp位置的突變，用於檢測非著色性狀等位基因；另外設計兩個配對引物Mb3a (序列為CGTTCGAAGGTCTAAGGTG)和 Mb2R(序列為 TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)，形成 Mb3a 與 Mb4b、Mb3h 與 Mb2R 兩對引物進行PCR擴增。為便於瓊脂糖膠電泳檢測，設計引物時注意控制兩對引物的PCR擴增產物大小。[0027]步驟4，PCR擴增:一對引物的PCR反應液(20 μ L)含有0.5 μ L(25ng)基因組DNA.0.4μ L dNTPsdOmmol / L) ,2 μ LlOx Taq 緩衝液、1.6 μ LMg2+(25mmol / L) ,0.5μ L特異引物 Mb4b(10ymol / L)、0.5 μ L 配對引物 Mb3a (10 μ mol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的Taq DNA聚合酶和14.25 μ L水；PCR反應35個循環，每一循環包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72°C引物延伸2min，35個循環後獲得PCR產物I。另一對引物的PCR反應液(20 μ L)含有 0.5μ L(25ng)基因組 DNA、0.4yL dNTPs(10mmol / L) ,2 μ LlOx Taq緩衝液、1.6 μ LMg2+ (25mmol / L)、0.5 μ L 特異引物 Mb3h (10 μ mol/L)、0.5 μ L 配對引物Mb2R(10ymol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的 Taq DNA 聚合酶和 14.25 μ L 水；PCR 反應 35 個循環，每一循環包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72°C引物延伸2min，35個循環後獲得PCR產物2。也可以將兩對引物放在同一 PCR反應液中進行PCR擴增，但效果不如兩對引物分別擴增後混合PCR產物。 [0028]步驟5，電泳檢查:將3 μ L PCR產物1、3 μ L PCR產物2、3 μ L水和I μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1.2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查PCR產物，結果如圖1所示，有2個植株PCR擴增產物僅出現一條與蘋果果實著色性狀有關的帶I (大小約380bp)，其果實為紅色；有2個植株PCR擴增產物僅出現一條與蘋果非著色性狀等位基因有關的帶2 (大小約420bp)，故其果實為非紅色；有4個植株PCR擴增產物出現一條與蘋果果實著色性狀有關的帶I和一條與蘋果非著色性狀等位基因有關的帶2，其果實為紅色。
[0029]步驟6，對於研究過程中發現的富士蘋果非著色性狀等位基因Df和嘎拉蘋果非著色性狀等位基因Dg對早結果性狀的影響不同，利用MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1616bp和-1573bp位置的突變進行鑑別。例如，利用MdMYBl基因序列設計一個序列為GGTCCGGTTCTATTTCGTAT的特異引物Mb3b，對應於基因轉錄起始點上遊_1573bp位置的突變，用於檢測嘎拉蘋果非著色性狀等位基因；另外設計一個序列為ACCGGACCTATCTCATTCG的特異引物Mb4b，對應於基因轉錄起始點上遊-1603bp位置的突變，用於檢測果實著色性狀；再設計兩個配對引物Mb3a (序列為CGTTCGAAGGTCTAAGGTG)和Mb2R (序列為TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)，形成 Mb3a 與 Mb4b、Mb3b 與 Mb2R 兩對引物進行 PCR 擴增。
[0030]步驟7，PCR擴增:兩對引物的PCR反應液(20 μ L)含有0.5 μ L(25ng)基因組DNA.0.4μ L dNTPsdOmmol / L) ,2 μ LlOx Taq 緩衝液、1.6 μ LMg2+(25mmol / L) ,0.5μ L特異引物 Mb4b(10ymol / L)、0.5 μ L 特異引物 Mb3b (10 μ mol / L)、0.5yL 配對引物Mb3a(10ymol / L)、0.5 μ L 配對引物 Mb2R(10 μ mol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的 Taq DNA聚合酶和13.25 μ L水；PCR反應35個循環，每一循環包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72°C引物延伸2min，35個循環後獲得PCR產物。也可以按照步驟4的方法分別擴增兩對引物。
[0031]步驟8，電泳檢查代表早結果性狀等位基因和代表著色性狀等位基因的PCR產物帶。
[0032]實施例1:本發明分子標記法鑑定蘋果雜交後代植株早結果性狀
[0033]步驟1，試材:利用富士和嘎拉蘋果作為親本進行雜交獲得種子，種子播種後獲得的蘋果雜交後代植株葉作為試材。
[0034]步驟2，基因組DNA提取:同前述實施步驟。
[0035]步驟3，設計引物:利用MdMYBl基因序列設計一個序列為ACCGGACCTATCTCATTCG的特異引物Mb4b，對應於基因轉錄起始點上遊-1603bp位置的突變，用於檢測果實著色性狀；設計另一個序列為ACCGGACCTATCTCATTCT的特異引物Mb4h，也是對應於基因轉錄起始點上遊_1603bp位置的突變，用於檢測非著色性狀等位基因；另外設計兩個配對引物Mb3a (序列為 CGTTCGAAGGTCTAAGGTG)和 Mb2f (序列為 TTGGGTGTTTGCTGTTGC)，形成 Mb2f 與Mb4b、Mb3a與Mb4h兩對引物進行PCR擴增。
[0036]步驟4，PCR擴增:一對引物的PCR反應液(20 μ L)含有0.5 μ L(25ng)基因組DNA.0.4μ L dNTPs(10mmol / L) ,2 μ LlOx Taq 緩衝液、1.6 μ LMg2+(25mmol / L) ,0.5μ L特異引物 Mb4b(10ymol / L)、0.5 μ L 配對引物 Mb2f (10 μ mol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的Taq DNA聚合酶和14.25 μ L水；PCR反應35個循環，每一循環包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72 °C引物延伸2min，35個循環後獲得PCR產物I。另一對引物的PCR反應液(20yL)含有 0.5μ L(25ng)基因組 DNA、0.4μ L dNTPs(10mmol / L) ,2 μ LlOx Taq 緩衝液、1.6μ LMg2+(25mmol / L)、0.5 μ L 特異引物 Mb3a (10 μ mol / L)、0.5yL 配對引物Mb4h(10ymol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的 Taq DNA 聚合酶和 14.25 μ L 水；PCR 反應 35 個循環，每一循環包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72°C引物延伸2min，35個循環後獲得PCR產物2。
[0037]步驟5，電泳檢查與分析:將3 μ L PCR產物1、3 μ L PCR產物2、6 μ L水和I μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1.2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查PCR產物，結果如圖2所示，有5個植株PCR擴增產物僅出現一條與蘋果果實著色性狀有關的帶I (大小約260bp)，其果實為紅色；有I個植株PCR擴增產物僅出現一條與蘋果非著色性狀等位基因有關的帶2 (大小約380bp)，故其果實為非紅色；有12個植株PCR擴增產物出現一條與蘋果果實著色性狀有關的帶I和一條與蘋果非著色性狀等位基因有關的帶2，其果實為紅色。
[0038]利用前述本發明方法實施步驟中的分子標記以及本實施例中的分子標記，對123株蘋果雜交後代基因突變與雜交種子播種5年後結果情況進行分析，結果見表1。可以看出，PCR產物僅出現代表非著色等位基因的較大帶時結果率高，PCR產物出現較小帶、含有著色等位基因時結果率降低，PCR產物僅出現較小帶、含有兩個著色等位基因時結果率最低，這說明較大PCR產物帶代表的非著`色等位基因與蘋果早結果性狀相關。我們2012年的試驗結果證實了這一結論。123株蘋果雜交後代中，2012年結果的2株是含非著色等位基因的。
[0039]表1不同基因型後代植株結果情況
PCR產物帶基因型預測顏色植株數~結果株數結果率(％)
【權利要求】
1.蘋果MdMYBl基因的三處已知鹼基突變，一處在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1624bp位置發生突變或者雜合突變:G — A、G — G / A、G — A / T，含有鹼基為G的等位基因時具有果實著色性狀；一處在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1603bp位置發生突變或者雜合突變:C — A、C — C / A，含有鹼基為C的等位基因時具有果實著色性狀；另一處在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊_1550bp位置發生突變或者雜合突變:T — C、T — T / C、T-C / A，含有鹼基為T的等位基因時具有果實著色性狀；本發明基於這些基因突變開發的分子標記方法可用來鑑定蘋果著色性狀，要求2013年10月16日相同主題申請(在先申請號201310482643.X)的優先權，其特徵包括以下步驟: 步驟1:提取DNA樣本； 步驟2:利用上述MdMYBl基因突變設計兩個特異引物，一個特異引物對應於果實著色性狀等位基因，另一個特異引物對應於另一個等位基因，另外設計兩個引物與兩個特異引物配對； 步驟3:進行PCR擴增； 步驟4:普通瓊脂糖電泳檢查PCR產物； 步驟5:根據電泳結果鑑定蘋果雜交後代:在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊_1624bp位置，蘋果植株含有鹼基為G的等位基因時具有果實著色性狀；在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊_1603bp位置，蘋果植株含有鹼基為C的等位基因時具有果實著色性狀；在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1550bp位置，蘋果植株含有鹼基為T的等位基因時具有果實著色性狀。
2.蘋果MdMYBl基因的兩處突變，其特徵是:在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1616bp處的鹼基發生與蘋果早結果性狀相關的雜合突變:G —G / A，蘋果植株含有鹼基為A的等位基因時具有早結果性狀；在MdMYBl-1基因轉錄起始點上遊-1573bp處的鹼基發生與蘋果早結果性狀相關的雜合突變:A — T / A，蘋果植株含有鹼基為T的等位基因時具有早結果性狀；對於兩處突變，檢測任何一處突變的分子標記方法可用來鑑定蘋果早結果性狀，包括以下步驟: 步驟1:提取DNA樣本； 步驟2:利用上述MdMYBl基因突變設計兩個特異引物，一個特異引物對應於早結果性狀等位基因，另一個特異引物對應於權利要求1所述果實著色性狀等位基因，另外設計兩個引物與兩個特異引物配對； 步驟3:進行PCR擴增； 步驟4:普通瓊脂糖電泳檢查PCR產物； 步驟5:根據電泳結果鑑定蘋果雜交後代:出現早結果性狀等位基因對應的PCR產物帶時具有早結果性狀，出現果實著色性狀等位基因對應的PCR產物帶時具有果實著色性狀。
3.根據權利要求2所述的分子標記方法，其特徵是:可用於對蘋果雜交後代果實著色性狀進行早期選擇，對選出的雜交後代植株加強管理。
4.根據權利要求2所述的分子標記方法，其特徵是:可用於對蘋果雜交後代植株早結果性狀進行早期選擇，對選出的雜交後代植株加強管理，儘早獲得較多的結果植株。
5.根據權利要求2所述的分子標記方法，其特徵是:可用於分子設計育種，選出具有早結果性狀的親本進行雜交，儘早獲得較多的結果植株。
【文檔編號】C12N15/11GK103614373SQ201310618025
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年10月16日
【發明者】苑克俊, 王長君, 王絳輝, 辛力, 周廣芳, 李林光, 沈廣寧 申請人:山東省果樹研究所