斑馬魚胚胎模型檢測抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法及...的製作方法
2023-06-28 11:51:06 2
專利名稱：斑馬魚胚胎模型檢測抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法及 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用斑馬魚胚胎模型檢測抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法及其應用，尤其是抗新生血管生成蛋白因子活性的檢測方法及其應用。
背景技術：
惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病，因而也是當前全球研究的熱點。目前常用的抗腫瘤藥物因其專一性差，多具有很強的毒副作用，而且至今尚沒有得到一種理想的藥物。以新生血管生成為靶點的抗腫瘤藥物具有較好的專一性，近年來受到廣泛關注，人們發現抑制新生血管生成過程可以有效抑制腫瘤生長，許多新生血管生成抑制劑在多種動物模型中表現出強烈的抗腫瘤活性。與常用的細胞毒性藥物相比，由於內皮細胞具有遺傳學的穩定性，以其作為生物靶點的抗腫瘤藥物不易產生抗藥性，其意義特別重大。
目前用於檢測血管形成的方法由於太複雜而不利於進行藥物篩選，內皮細胞增殖與遷移試驗，不僅試驗方法複雜，且為體外試驗；雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成試驗，兔角膜新生血管生成試驗和小鼠腫瘤模型等，雖為體內試驗，但是試驗周期長、方法較繁瑣。採用小鼠腫瘤模型與斑馬魚(Brachydanio rerio)胚胎模型用抗新生血管生成藥物SU5416進行對比試驗前者試驗周期為4周，後者只需2-3天；前者血管抑制率為42％後者則為40％；每個樣品組需要藥物的體積和藥物濃度前者分別為1800-3600ul和12mg/ml，後者分別為100ul和80ug/ml；前者給藥頻率連續18天，每天都需給藥，後者僅需給藥一次；前者為注射給藥，後者直接加到孵化液；前者的一組試驗動物數量一般為6隻，後者可達36個。這一新型的活性檢測模型在此領域中的應用，必將大大提高抗新生血管生成藥物篩選的速度。對闡明抗新生血管生成因子的抗腫瘤機制，發展新型的抗腫瘤藥物都具有十分重要的意義。
本發明首次應用斑馬魚胚胎模型檢測抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子的活性，用來篩選抗新生血管生成活性蛋白因子或促新生血管生成活性蛋白因子。該模型比以往的檢測模型更簡單、經濟、準確、直觀、周期短，可以應用於所有抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子的篩選和檢測，以及進一步的機理研究。由此，為分離純化、鑑定新型的抗腫瘤藥物提供了一條新的簡易的檢測模型。
發明內容
本發明的目的在於提供一種新型、具有較好的重複性、直觀性、試驗周期短、且檢測過程簡便的抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性檢測模型方法。
本發明的一個方面，涉及一種用於檢測待測蛋白質組分的抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法，包括如下步驟1)隨機選取一定數量的孵化22小時的斑馬魚胚胎，去掉所述胚胎的絨毛膜；2)向步驟1)中的所述斑馬魚胚胎孵化液加入待測蛋白質組分，在恆溫下培養一段時間後，觀察斑馬魚胚胎的血管形成情況；3)判斷所述待測蛋白質組分是否具有抗新生血管生成活性或促新生血管生成活性。
為了便於定量化比較所述待測蛋白質組分的活性，本發明的另一方面，涉及一種用於檢測待測蛋白質組分的抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性的方法，包括如下步驟1)隨機選取一定數量的孵化22小時的斑馬魚胚胎，去掉所述胚胎的絨毛膜；2)步驟1)中的斑馬魚胚胎孵化液中加入待測蛋白質組分，在恆溫下培養一段時間後，觀察斑馬魚胚胎的新生血管生成情況；3)待胚胎發育到一定時間後進行血管染色；4)判斷所述待測蛋白質組分是否具有抗新生血管生成活性或促新生血管生成活性。
本領域普通技術人員知曉，經過染色後可以在立體顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎血管形成情況。
在本發明的一個具體實施方案中，所述血管染色在斑馬魚胚胎發育的第三天進行。在本發明的一個具體實施方案中，所述血管染色包括如下步驟將胚胎浸在4％多聚甲醛2小時，在PBS緩衝液中洗2次，然後依次在含25、50、75和100％甲醇的PBT中脫水並浸潤，在NTMT中平衡後，加入染色液；胚胎中的血管都被標記後，加PBST終止反應。將染色後的斑馬魚胚胎放在脫色液中除去色素細胞的內源黑色素，使染色的血管清晰可見。
本領域普通技術人員知曉，本發明所述方法適於檢測的待測蛋白質組分可以為任一可能具有抗新生血管生成活性或者促新生血管生成活性的蛋白質、多肽或糖蛋白。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為取數對野生的斑馬魚交配，按照(Westerfield M.The Zebrafish BookA Guide for theLaboratory Use of Zebrafish.Eugene，OregonThe University of Oregon Press，1993.)方法孵化胚胎，在孵化後20-24小時，優選為22小時，按照(G.N.Serbedzija，E.Flynn，C.E.Willett.ZebrafishangiogenesisA new model for drug screening.Angiogenesis 3353-359，1999.)方法去掉斑馬魚胚胎絨毛膜(去除100％)，在孵化液中加入待測蛋白質組分，27-29℃下，持續培養48小時後觀察斑馬魚胚胎的血管形成(對於胚胎血管形成的變化，最好採用定性或定量的比較標準，否則無法判定待測物質是否影響血管形成以及影響程度的大小)，以檢驗該蛋白質組分對斑馬魚胚胎新生血管生成的影響。
例如，在48小時後觀察到出現斑馬魚胚胎的腸下血管完全不存在或側面、腹面的血管網消失的待測物質，認為具有抗新生血管生成活性；在48小時後觀察到出現血管網包圍區域面積的增大或血管網內部血管大小長短的增加的待測物質，判定具有促新生血管生成活性。
為了便於定量比較所加入的待測物質的活性，在本發明的技術方案中，還包括如下的染色方法具體的，將27-29℃孵化液中發育到72小時的斑馬魚胚胎，在室溫條件下，浸在4％多聚甲醛的固定液作用2小時，將斑馬魚胚胎固定，使斑馬魚胚胎保持在發育72小時的天然狀態，用磷酸鹽緩衝液(PBS，NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4(12H2O)1.44g，KH2PO40.24g，加蒸餾水到1000ml，pH7.0)把胚胎表面殘留的固定液衝洗乾淨。然後將固定並衝洗好的斑馬魚胚胎依次在不同濃度梯度的脫水劑中逐次脫水，從而提高斑馬魚胚胎的滲透性以利於染色液進入胚胎內。
將經過上述處理的胚胎放在平衡液(0.1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸，pH 9.5，50mM氯化鎂，0.1M氯化鈉，0.1％吐溫-20)中，使整個胚胎的通透性處於平衡狀態後，加入染色液(藍四氮唑75mg/ml，5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽50mg/ml)，染色液中的顯色劑5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽和藍四氮唑使斑馬魚胚胎血管內的鹼性磷酸酶發生顯色反應，形成紫紅色沉澱，從而標記斑馬魚胚胎的血管。
待胚胎中的血管都被標記後，加入終止液(PBST，含0.05％tween-20的磷酸緩衝鹽溶液)終止染色反應；然後將胚胎放在脫色液(含5％甲醯胺和10％過氧化氫的磷酸緩衝鹽溶液)中除去色素細胞的內源黑色素，以便使染色的細胞清晰可見；在立體顯微鏡下觀察胚胎並採集和保存圖像。
採集和保存圖像後，採用專門的圖像處理軟體，計算出不同情況下的各個斑馬魚胚胎新生血管生成量後進行比較。正常情況下，在不加入抗新生血管生成蛋白質組分或促新生血管生成蛋白質組分的斑馬魚胚胎中，其腸下靜脈形成於卵黃的背面，籃狀血管網，自體節腹面邊緣開始越過卵黃延伸50-100μm；而抗新生血管生成效應的表現是斑馬魚胚胎的腸下血管完全不存在或側面、腹面的血管網消失；促進新生血管生成的效應表現為(a)血管自體節開始的延伸超過150μm；或(b)血管網包圍區域的面積的增大；或(c)血管網內部血管粗細長短的增加。另外，正常血管直徑小於10μm，測量血管直徑也可得到比較。
本發明具有如下優點1.材料易得。斑馬魚(Brachydanio rerio)屬鯉科，淡水魚，產地為印度和孟加拉國，繁殖速度較快，產卵量大，極易飼養，經濟實用，是一種理想的脊椎動物模式生物。
2.待測蛋白質組分給藥方式簡單。可將待測蛋白質組分直接加至胚胎生活的孵化液中，在96孔板中只需加入100ul的水體積即可，蛋白質組分的用量少。
3.檢測方法簡便。收集胚胎後，加入待測蛋白質組分，培養2天後進行血管染色並觀察，操作簡便，所需周期短。
4.成本低廉。所用試劑為磷酸鹽、多聚甲醛、甲醇、雙氧水等，且用量少，檢測成本低廉，由此可以降低抗新生血管生成蛋白因子此類藥物的價格。
5.應用前景好。本發明斑馬魚胚胎模型在檢測抗新生血管生成蛋白質因子或促新生血管生成蛋白質因子活性方面的應用，必將大大提高抗新生血管生成藥物篩選的速度。對闡明抗新生血管生成因子的抗腫瘤機制，發展新型的抗腫瘤藥物都具有十分重要的意義。
具體實施例方式
實施例1源自青鯊軟骨蛋白質組分1的抗新生血管生成活性的檢測1.胚胎採集 早晨取15對野生斑馬魚，自由組合分成5組交配孵化胚胎，採集1200個斑馬魚胚胎，吸出沉澱物質，放於孵化液(蒸餾水)中，27℃培養箱保存22小時，應及時取出白色胚胎(已死的)以防止水質變壞；在此期間胚胎可通過卵黃取得養料，不需要其他的養料。
2.蛋白質組分1的準備 以青鯊軟骨為原料，通過鹽酸胍抽提、丙酮分級沉澱、超濾、凝膠過濾層析等技術分離純化得到待測的鯊魚軟骨蛋白質組分1。
3.加入蛋白質組分1 待斑馬魚胚胎發育到22小時，用1mg/ml的胰蛋白酶消化斑馬魚胚胎的絨毛膜，10分鐘後，絨毛膜開始脫落，此時用大量的水反覆衝洗3次，去除所有的絨毛膜，得到健康的斑馬魚胚胎。將青鯊軟骨蛋白質組分1直接溶解在斑馬魚胚胎的孵化液中。隨機選取健康的288個胚胎分組，吸淨孵化液，加入含不同濃度蛋白質組分1的孵化液於96孔培養板中，每一孔容量100ul，包括3個胚胎，為一小組。詳細分組情況及待測蛋白質組分加入量如表1所示表1試驗分組情況及待測蛋白質組分1加入量
4.視覺鑑定 加入待測青鯊軟骨蛋白質組分1後，將胚胎分開置於96孔板的微孔中，27℃下孵化到受精後72小時，每組取一半胚胎直接觀察，鑑定存活狀況，形態以及循環系統是否有缺陷或異常，其中循環系統的鑑定可通過比較處理組和對照組血細胞運動狀況及流速來判斷。
經48小時的處理，斑馬魚胚胎可觀察到以下現象表2青鯊軟骨蛋白質組分1的抗新生血管生成作用
5.血管染色 在視覺鑑定的同時，每組取另一半胚胎進行血管染色。首先將胚胎置於4％多聚甲醛中室溫處理2小時；而後在磷酸鹽緩衝液(PBS)中衝洗兩次，把胚胎表面殘留的固定液衝洗乾淨；依次浸於甲醇和PBT(含有0.1％Triton X-100和5％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液)溶液的混合液中滲透脫水並隨後逐漸浸潤；混合液的成分如下表3所示表3甲醇和PBT溶液的配方
接著將胚胎置於NTMT(0.1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸，pH 9.5，50mM氯化鎂，0.1M氯化鈉，0.1％吐溫-20)緩衝液中，室溫處理30分鐘，使胚胎平衡後染色；每毫升加入5μl75mg/ml藍四氮唑和4μl 50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽顯色劑染色20分鐘；加入終止液PBST(含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液)，染色反應停止，將胚胎浸入脫色液(含5％甲醛胺和10％H2O2的PBS溶液)中30分鐘，除去色素細胞的內源黑色素，使已染色的細胞清晰可見；然後在立體顯微鏡下觀察胚胎，收集圖像並拍照。
6.測定血管變化利用圖像分析軟體NIH image(NIH image是由Wayne Rasband編寫的Mac圖像分析應用程式，可對圖像面積、平均密度、重心及用戶定義的多邊形區域的分析，自動進行點的分析、測定路徑長度和角度)測定腸下靜脈長度，進行血管形成影響作用的判斷。
通過以上斑馬魚胚胎模型檢測平臺，可以得出，我們所分離純化的青鯊軟骨蛋白質組分1具有抑制斑馬魚胚胎新生血管生成的活性，從而證明其是一種具有抗腫瘤活性的蛋白質組分，有待於進一步的分離純化、理化性質研究和開發應用。
實施例2源自青鯊軟骨的蛋白質組分2的抗新生血管生成活性的檢測1.胚胎採集 早晨取12對野生斑馬魚，自由組合分成4組交配孵化胚胎，採集1000個斑馬魚胚胎，吸出沉澱物質，放於孵化液中，29℃培養箱保存22小時，利用形態和發育學標準來隨時鑑定死活；已死的胚胎呈白色，應及時取出以防止水質變壞。
2.蛋白質組分2的準備 以青鯊軟骨為原料，通過鹽酸胍抽提、丙酮分級沉澱、超濾和凝膠過濾層析等技術分離純化得到純的蛋白質組分2，分子量為1550道爾頓。
3.加入蛋白質組分2 待斑馬魚胚胎發育到22小時，用1mg/ml的胰蛋白酶消化斑馬魚胚胎的絨毛膜，10分鐘後，絨毛膜開始脫落，此時用大量的水反覆衝洗3次，得到健康的斑馬魚胚胎。將提純的鯊魚軟骨蛋白質組分2直接加入到斑馬魚胚胎的孵化液中。隨機選取健康的288個胚胎分組，吸淨孵化液，加入蛋白質組分2的孵化液於96孔培養板中，每一孔容量100ul，包括3個胚胎，為一小組。分組情況及待測蛋白質組分2加入量與前表1相同。
4.視覺鑑定 加入蛋白質組分2後，將胚胎分開置於96孔培養板的微孔中，29℃下孵化到受精後72小時，每組取一半胚胎直接觀察，鑑定存活狀況，形態以及循環系統是否有缺陷或異常，其中循環系統的鑑定可通過比較處理組和對照組血細胞運動狀況及流速來判斷。
經48小時的處理，斑馬魚胚胎可觀察到以下現象，如表4所示
表4青鯊軟骨蛋白質組分2的抗新生血管生成作用
5.血管染色 在視覺鑑定的同時，每組取另一半胚胎進行血管染色。首先將胚胎置於4％多聚甲醛中室溫處理2小時；而後在磷酸鹽緩衝液(PBS)中衝洗兩次，把胚胎表面殘留的固定液衝洗乾淨；依次浸於甲醇和PBT溶液的混合液中滲透脫水並隨後逐漸浸潤。混合液的成分如前表1所示。
接著將胚胎置於NTMT緩衝液中，室溫處理30分鐘，使胚胎平衡後染色；每毫升加入5μl75mg/ml藍四氮唑和4μl 50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽顯色劑染色20分鐘；加入終止液PBST，染色反應停止，將胚胎浸入脫色液中30分鐘，除去色素細胞的內源黑色素，使已染色的血管清晰可見；然後在立體顯微鏡下觀察胚胎，收集圖像並拍照。
6.測定血管變化利用圖像分析軟體NIH image測定腸下靜脈長度，進行血管形成影響作用的判斷。
通過以上斑馬魚胚胎模型檢測平臺，可以得出，我們所分離純化的分子量為1550Da蛋白質組分，具有抑制斑馬魚胚胎新生血管生成的活性，從而證明其是一種純的具有抗腫瘤活性的蛋白質，可進一步研究此蛋白質的其他活性，測定序列以及克隆表達等。
權利要求
1.一種抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子活性檢測方法，包括如下步驟1)向孵化後22小時的斑馬魚胚胎孵化液中加入待測蛋白質組分，在恆溫下培養一段時間後，觀察斑馬魚胚胎的血管發育；2)判斷所述待測蛋白質組分是否具有抗新生血管生成活性或促新生血管生成活性。
2.權利要求1所述的方法，其中在所述步驟1)還包括如下步驟待胚胎發育到一定時間後進行血管染色，在立體顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎血管發育情況；
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於在所述步驟1)中，在加入待測蛋白質組分之前還包括去掉斑馬魚胚胎的絨毛膜的步驟。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所加入的待測蛋白質組分可以為任一可能具有抗新生血管生成活性或者促新生血管生成活性的蛋白質、多肽或糖蛋白。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於在所述步驟1)中加入待測蛋白質組分後，在27-29℃持續培養48小時。
6.根據權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於在斑馬魚胚胎發育的第三天進行血管染色。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於將胚胎浸在4％多聚甲醛2小時，在PBS緩衝液中洗2次，然後依次在含25、50、75和100％甲醇的PBT中脫水並浸潤，在NTMT中平衡後，加入染色液；胚胎中的血管都被標記後，加PBST終止反應。
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特徵在於將染色後的斑馬魚胚胎放在脫色液中除去色素細胞的內源黑色素，使染色的細胞清晰可見。
9.權利要求1所述的方法，其中表現出斑馬魚胚胎的腸下血管完全不存在或側面、腹面的血管網消失的待測物質，認為具有抗新生血管生成活性；表現出a)血管自體節開始的延伸超過150μm；或(b)血管網包圍區域面積的增大；或(c)血管網內部血管粗細長短的增加的待測物質，認為具有促新生血管生成活性。
全文摘要
本發明涉及一種新型抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子相關活性檢測方法及其應用，具體地說就是通過斑馬魚胚胎模型方法檢測抗新生血管生成蛋白因子或促新生血管生成蛋白因子相關活性，以及該方法的應用。斑馬魚胚胎孵化後，直接加入抗新生血管生成蛋白質組分或促新生血管生成蛋白質組分，在恆溫下培養一段時間後，觀察斑馬魚胚胎的發育情況；待胚胎發育到一定時間後進行血管染色，在立體顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎血管形成情況，採集和保存圖像。本發明具有材料易得，蛋白質組分給藥方式簡單，檢測方法簡便，成本低，應用性好等特點。
文檔編號A61K49/00GK1866025SQ20061004453
公開日2006年11月22日 申請日期2006年6月1日 優先權日2006年6月1日
發明者林秀坤, 鄭蘭紅, 楊少麗, 牛榮麗, 胡朝欣 申請人:中國科學院海洋研究所