一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因的製作方法
2023-06-29 00:27:21
專利名稱：一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物分子育種的基因工程技術，特別是一種與豬肌內脂肪沉積相關的脂聯素(Adiponectin)基因技術。
背景技術：
近年來，由於豬的選育工作中過度追求高瘦肉率，導致豬肉品質的嚴重下降。隨著生活水平的不斷提高，人們對豬肉顏色、嫩度、風味等肉品質特性的要求也越來越高。肌內脂肪(intramuscular fat, IMF)是影響肉品質的重要因素，目前已得到越來越多的認識和 重視。肌內脂肪的沉積是一個複雜的生理生化過程，主要涉及肌肉內甘油三酯的代謝，包括甘油三酯的合成、分解及轉運等過程。因此，肌內脂肪細胞內的脂類代謝是肌內脂肪沉積的基礎。隨著脂肪細胞分泌功能的發現，越來越多的證據指出，脂肪細胞分泌的生物活性物質不僅可以調節脂肪沉積，且對骨骼肌代謝有重要的調控作用，可望成為改善豬胴體品質的新突破口。其中脂聯素(Adiponectin)是新發現的一種脂肪細胞分泌因子，它以內分泌方式循環於血液中，具有調控機體能量穩衡、葡萄糖代謝和脂肪代謝等功能。在人、猴子、小鼠的研究中發現，Adiponectin可以降低血漿甘油三酯濃度，增強機體糖代謝，提高胰島素敏感性，刺激脂肪酸氧化，減少成熟脂肪細胞對脂肪的吸收，是目前已知的唯一對肥胖呈負調節的一種脂肪特異性蛋白。因此，體內Adiponectin基因的表達與脂肪沉積密切相關，可成為調控肌內脂肪沉積的候選基因。目前，對豬Adiponectin基因的序列及表達已有所報導。Wang等(2004)首次克隆了豬Adiponectin基因片段，並發現其在豬脂肪組織中高度表達。Jacobi等(2004)也報導了豬Adiponectin的基因全長為732 bp，編碼243個胺基酸。雖然在Adiponectin對機體脂肪沉積和肌肉代謝調節方面的研究取得了一些進展，但Adiponectin基因的表達如何調控豬脂肪沉積和肌肉代謝的確切作用及其機理，國內外迄今尚未見報導。豬是脂肪沉積型動物，其脂肪沉積能力在不同品種之間變化很大。我國一些肉質優良的地方豬種是最寶貴和稀缺的基因資源，這在優質豬肉的培育中有獨特的利用價值。版納微型豬是雲南省優良的地方豬種，具有耐粗飼、適應性強、肉質優良、肌內脂肪豐富，肌纖維細密，肉質鮮嫩等優良特性。然而，目前對版納微型豬的生長發育及肌內脂肪沉積的分子機制知之甚少。近年來，本課題組採用基因晶片技術和生物信息學分析方法，在對豬肌肉組織和肌內脂肪細胞基因表達譜的研究中發現Adiponectin基因參與肌內脂肪細胞的脂類代謝過程，並首次從版納微型豬肌肉組織中克隆了 Adiponectin基因。因此，研究版納微型豬Adiponectin基因的序列與表達模式,分析其核苷酸和胺基酸序列結構特點，從分子水平了解版納微型豬肌內脂肪沉積較多的特點，為進一步研究該基因的功能及為改善豬胴體脂肪性狀的育種工作提供理論基礎
發明內容
本發明的目的是提供一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，採用基因晶片技術和生物信息學分析方法，在對豬肌肉組織和肌內脂肪細胞基因表達譜的研究中發現Adiponectin基因參與肌內脂肪細胞脂類代謝過程，並首次從版納微型豬肌肉組織中克隆了 Adiponectin 基因。一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內脂肪沉積相關的脂聯素(Adiponectin)基因，基因的⑶S序列全長為732bp，其CDS核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I。並且，CDS核苷酸序列編碼243個胺基酸，胺基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。對上述特徵的肌內脂肪沉積Adiponectin基因設計引物，進行PCR擴增，檢測Adiponectin基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達譜，結果顯示Adiponectin基因在脂肪組織中表達量最高,初步表明Adiponectin基因在脂肪細胞中調控脂肪沉積的功能。Adiponectin是脂肪細胞的特徵性基因，與肌肉組織中肌內脂肪沉積有關。本發明克隆得到版納微型豬Adiponectin基因⑶S全序列,全長為732bp,提交到Genbank,登錄號為JN634961。與Genbank提供的豬Adiponectin基因相比較，沒有發現核苷酸突變位點，因 而也無胺基酸突變位點。Adiponectin蛋白在物種間的同源性較高,通過進化樹可以看出，豬與人的親緣性較近，其次是牛、小鼠、大鼠。豬Adiponectin蛋白胺基酸序列與牛、人、小鼠和大鼠的同源性分別為84%、83%、81%和80%。Adiponectin蛋白在不同物種間的高度保守性提示它們功能的重要性，這些基因的保守性也是Adiponectin在各個物種中相應的生理特點保持不變的分子基礎。另外，Adiponectin在脂肪組織中的高度表達，也證明了它在肌內脂肪沉積等方面的重要作用。
圖I是本發明的PCR擴增Adiponectin基因圖示
圖2是本發明的Adiponecin在不同組織中的表達水平柱圖 圖3是本發明的Adiponectin基因酶切鑑定圖 圖4是本發明的進化樹分析圖 圖5是本發明的Adiponectin蛋白二級結構預測圖 圖6是本發明的Adiponectin蛋白磷酸化位點預測圖 圖7是本發明的Adiponectin蛋白糖基化位點預測圖 圖8是本發明的Adiponectin蛋白疏水性分析圖 圖9是本發明的Adiponectin蛋白的信號肽預測圖
具體實施例方式一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內脂肪沉積相關的脂聯素(Adiponectin)基因，其特徵在於基因的CDS序列全長為732bp,其⑶S核苷酸序列如說明書核苷酸和胺基酸序列表SEQ. ID. NO. I。並且，⑶S核苷酸序列編碼243個胺基酸，胺基酸序列如說明書核苷酸和胺基酸序列表SEQ. ID. NO. 2。對上述特徵的肌內脂肪沉積Adiponectin基因設計引物，進行PCR擴增，檢測Adiponectin基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達譜，結果顯示Adiponectin基因在脂肪組織中表達量最高,初步表明Adiponectin基因在脂肪細胞中調控脂肪沉積的功能。具體為
I、肌肉組織中總RNA的提取
採取50kg成年版納微型豬肌肉組織立即放入液氮中保存備用。利用RNA提取試劑提取版納微型豬肌肉組織總RNA，具體操作參照試劑盒說明進行。將提取的RNA反轉錄成cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物設計及PCR反應條件
根據 GenBank 中豬 Adiponectin 序列信息(GenBank 登錄號 EF601160. 1)，利用 PrimerPremier 5.0設計引物,併合成。用於克隆的Adiponectin基因的引物序列為
F :5，- GTCTGTGGCTCTGATTCCA -3，
R:5』 - TCATTCAATGTTGTGGTAGAGA -3』
用於突光定量的Adiponectin基因的引物序列為
F :5，- GGCTCTGTGCTCCTCTATCT -3，
R:5』 - TTGGCAGTGCTCATCATTC -3』
內參18S rRNA的引物序列為
F :5』 -CTGCCTCCTTGGATGTG-3』
R :5』 -GCGGCTTTGGTGACTCTA-3』
Adiponectin基因克隆的PCR反應條件為94°C預變性3min ;94°C變性0. 5min、52°C退火lmin、72°C延伸Imin 35個循環；72°C後延伸IOmin進行擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定其亮度和特異性。通過PCR擴增，得到了長度為768bp的片段。PCR擴增產物經I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測後，確認擴增的產物的長度大小同於目的片段大小。螢光定量PCR的反應條件為94°C預變性3min;94 °C變性30 s，53°C退火30s、72°C延伸30 8，39個循環；721後延伸7min進行擴增。數據處理的方法為，檢測心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪七個組織中Adiponectin基因的相對表達量，實驗數據以18S rRNA作為內參，採用雙標準曲線法處理。結果顯示，Adiponectin在被檢測的7個組織中都有表達，在脂肪中高量表達，在腎和脾中大量表達，在肌肉、肝、心中少量表達，在肺中微量表達。3、Adiponectin基因的克隆及序列分析
按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒書說明書回收特異性條帶，產物連接於pMD-18T載體，轉化至ToplO感受態細胞，氨苄篩選挑取陽性克隆，分別接種於IOmL LB液體培養基中，37°C振蕩過夜，提取質粒經Ecor I和Hind III雙酶切鑑定為陽性，進行測序。4、測序結果
所得到的版納微型豬Adiponectin編碼區(⑶S)全長732bp，核苷酸序列如說明書核苷酸和胺基酸序列表SEQ. ID. NO. I所示，並提交到Genbank資料庫，登錄號為JN634961。⑶S序列編碼243個胺基酸，其胺基酸序列如說明書核苷酸和胺基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。
5、測序結果與Genbank中提供的序列比對
登錄http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版納微型豬的核苷酸序列同GeneBank中豬Adiponectin基因(登錄號為EF601160. I)的⑶S序列進行序列比對。結果沒有發現突變位點。因而，版納微型豬Adiponectin相應的胺基酸序列也沒有突變位點。如說明書核苷酸和胺基酸序列表。6、Adiponectin基因核苷酸與胺基酸序列同源性分析
登錄 http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版納微型豬 Adiponectin 基因測序結果與牛(登錄號為匪_174742)、人(登錄號為NM_004797)、小鼠(登錄號為NM_009605)和大鼠(登錄號為NM_144744) Adiponectin基因的核苷酸和胺基酸序列比對分析，結果顯示版納微型豬與牛、人、小鼠和大鼠的Adiponectin基因的⑶S序列同源性分別為84%、86%,81%和80% ;CDS序列所編碼胺基酸的同源性分別為84%、83%、81%和80%。如說明書核苷酸和胺基酸序列表。7、Adiponectin基因的進化樹分析
利用Meg4軟體的鄰近(Neighbor-joining)方法構建版納微型豬(Genbank登 錄號JN634961)、牛(登錄號為NM_174742)、人(登錄號為NM_004797)、小鼠(登錄號為NM_009605)和大鼠(登錄號為NM_144744) Adiponectin蛋白的系統進化樹，結果顯示版納微型豬與人的親緣性較近，其次是牛、小鼠、大鼠。8、Adiponectin蛋白分子量、等電點預測分析
使用ExPASy的在線軟體Compute pi/MW分析版納微型豬Adiponectin蛋白的等電點(pi)為 5. 68、理論分子量(pW)為 26369. 74 Da。9、Adiponectin蛋白質二級結構預測分析
登陸 http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/,對版納微型豬 Adiponectin 蛋白質二級結構進行預測，共有10個螺旋、56個伸展鏈和177個捲曲結構。10、Adiponectin蛋白質磷酸化位點預測
登陸 http: //www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,對豬 Adiponectin 蛋白質憐酸化位點進行預測，結果顯示，共有8個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點有3個、蘇氨酸磷酸化位點有
I個、酪氨酸磷酸化位點有4個。IUAdiponectin蛋白質糖基化位點預測
登錄 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/,對版納微型豬 Adiponectin 蛋白糖基化位點預測，結果顯示Adiponectin蛋白共有2個糖基化位點，分別在第49和229位。12、Adiponectin蛋白質疏水性分析
登陸 http://web. expasy. org/protscale/,對 Adiponectin 蛋白質疏水性進行分析，結果顯示為親水性蛋白。13、Adiponectin蛋白質信號肽的預測分析
登陸 http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/,對 Adiponectin 蛋白的信號妝進行預測。採用signalP-NN and signalP-HMM兩種方法對信號肽可能存在的分割位點進行預測，兩種方法顯示的結果一致，即Adiponectin蛋白序列存在一個可能的信號肽結構，且分割位點在第17至18個胺基酸之間。
權利要求
1.一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內脂肪沉積相關的脂聯素(Adiponectin)基因，其特徵在幹基因的CDS序列全長為732bp,其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1，並且，⑶S核苷酸序列編碼243個胺基酸，胺基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。
2.根據權利要求I所述ー種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，其特徵在於對上述特徵的肌內脂肪沉積Adiponectin基因設計引物,進行PCR擴增,檢測Adiponectin基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達譜，結果顯示Adiponectin基因在脂肪組織中表達量最聞，初步表明Adiponectin基因在脂肪細胞中調控脂肪沉積的功能。
全文摘要
本發明公開一種肌內脂肪沉積Adiponectin基因，是從版納微型豬肌肉組織中分離、克隆的與肌內脂肪沉積相關的脂聯素(Adiponectin)基因，基因的CDS序列全長為732bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。並且，CDS核苷酸序列編碼243個胺基酸，胺基酸序列如SEQ.ID.NO.2。檢測Adiponectin基因在豬心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪七個組織的組織表達譜，結果顯示Adiponectin基因在脂肪組織中表達量最高，初步表明Adiponectin基因在脂肪細胞中調控脂肪沉積的功能。
文檔編號C12N15/12GK102634520SQ201110339189
公開日2012年8月15日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者劉維全, 朱寶利, 潘洪彬, 王聰, 王靜, 趙素梅, 高士爭, 黃英 申請人:雲南農業大學