利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴王的方法

2023-06-28 16:08:06

專利名稱：利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴王的方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物的鑑定方法，具體涉及利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種 猴王的方法，屬生物技術領域。
背景技術：
職柳ericiimi erinaceus)肉嫩味美，營養豐富。很早以前，人們把它與熊掌、 海參、鯊魚翅並列為「四大名菜」，有「山珍猴頭，海味燕窩」的美稱，在古代被作為貢品。人 體必需的9種胺基酸，猴頭菇都含有。據報導，猴頭菇所含有的營養成分與目前人工栽培的 其它食用菌品種相比都居第一、二位，因而顯得更加珍貴。我國食用菌資源豐富，品種比較多，但是由於部分生產者有意或無意的改名，造成 猴頭菇的栽培菌種存在「異種同名或同種異名」的混亂現象。這種現象極大地損害了育種 者和生產者的利益，不但給科學研究和學術交流帶來障礙，而且對規範生產和產品質量標 準的制定帶來很大困難。優質菌種在猴頭菇單產和質量中的貢獻舉足輕重，這決定了猴頭菇菌種在猴頭菇 產業中的重要地位。隨著大規模的工廠化栽培方式的出現，對猴頭菇栽培菌株質量的要求 越來越高，需要更為簡便、快速、準確的菌株鑑定技術，以保證每批次的用種都準確無誤。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴王的快速檢測方法。本發明的利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴王的方法有2種，2種鑑定方法都 包括菌絲培養與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標記的檢測建立和SCAR-PCR產物 的檢測；
方法一的特徵在於
1、SCAR-PCR分子標記的檢測，使用的檢測引物是猴王F1/R1，其中，猴王Fl是5』-CTCC TCCCTTCACAATAAATAGCCA-3，，，猴王 Rl 是 5，-TCCCTGAACTTCTTTGTCTTCCCGT-3，；
2、SCAR-PCR分子標記的檢測建立SCAR-PCR擴增體系為10XPCRbuffer 2. 5 μ 1， 25mmol/L MgCL2 1 μ 1，2. 5 m mol/L dNTP 2 μ 1,5 U/ul Taq DNA Polymerase 0. 3 μ 1， 1(^11101/1檢測引物各1 μ 1，Ing lOng/μ 1 模板 DNA 1 μ 1，ddH20 16. 2 μ 1 ；
SCAR-PCR 反應條件為 94°C Imin ；94°C 45second, 62°C 45second, 72°C lmin，30 個循 環；72°C 5min ；
3、SCAR-PCR產物的檢測結果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示，擴增出的分子量為 1012bp的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標誌。方法二的特徵在於
1、SCAR-PCR分子標記的檢測，使用的檢測引物是猴王F2/R2，其中，猴王F2是 5，-CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT-3，，猴王 R2 是 5，-CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC-3，；2、SCAR-PCR分子標記的檢測建立SCAR-PCR擴增體系為10XPCRbuffer 2. 5 μ 1， 25mmol/L MgCL2 1 μ 1，2. 5 m mol/L dNTP 2 μ 1,5 U/ul Taq DNA Polymerase 0. 3 μ 1， 1(^11101/1檢測引物各1 μ 1，Ing lOng/μ 1 模板 DNA 1 μ 1，ddH20 16. 2 μ 1 ；
SCAR-PCR 反應條件為 94°C Imin ；94°C 45second, 67°C 45second, 72°C lmin，30 個循 環；72°C 5min ；
3、SCAR-PCR產物的檢測結果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示，擴增出的分子量為371bp 的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標誌。本發明提供的利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種的方法，具有靈敏度高，所需要 的DNA用量少，與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短、準確性高、 容易判斷、重複性好等優點。具體如下
1、檢測時間短該檢測方法所需時間只需要2 — 3天，而常規的拮抗試驗所需時間至少 需要兩周時間，常規形態學檢測和出菇試驗則需要至少2個月的時間。2、準確性高、容易判斷，而且重複性好該檢測方法以基因組DNA為材料，DNA是穩 定的遺傳物質，不易受外界因素等的影響，同時它的1012bp或371bp的顯性標記判斷一目 瞭然，減少人為判斷的偏差，大大提高了準確性；常規的拮抗試驗中，拮抗表現形式至少有 3種，甚至更多，有時表現形式不明顯，還受培養環境的影響，拮抗表現不僅在種內的不同品 種之間會出現，同時在種間的菌株之間也會表現出來，給準確判斷造成困難；出菇試驗更容 易受到環境、時間等各方因素的影響，重複性差，加大了檢測困難；形態學檢測在同一屬種 內的不同品種之間可區別的特徵少，有些甚至沒有什麼差異，同時還需要判斷者具有豐富 的知識與經驗，方可做出準確的判斷。3、此外該方法得到的顯性標記可減少猴頭菇新品種認定的工作量，檢測時該方法 只需要1個陽性菌株和1個陰性菌株對照便可快速比較，而用常規形態學、拮抗試驗、出菇 試驗方法來認定一個新品種，需要將所有同種內的不同品種一起搬出來比較，才能做出正 確的認定，這就要很大的人力和物力，當品種多時可能使得認定工作無法進行。本發明對猴頭菇種質資源的利用和新品種的登記工作，提供了更為有效的菌種鑑 定體系，以及加強對我國猴頭菇種質資源的保護工作都具有重要意義。


圖1為採用第一種方法檢測猴頭菇菌種擴增的DNA圖譜。其中1 M為泳道編號；右側的數字表示DNA片段的分子量，箭頭所指是猴王菌株特異性標記。圖2為採用第二種方法檢測猴頭菇菌種擴增的DNA圖譜。其中M 17為泳道編 號；左側的數字表示DNA片段的分子量，箭頭所指是猴王菌株特異性標記。
具體實施方式
為了充分公開本發明的利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴 王的方法，以下結合實施例加以說明。實施例1 一種利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴王的方法 一種利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴王的方法，包括以下步驟
一、菌絲培養與收集。(一)若供測試猴頭菇菌株的保藏時間小於6個月，則菌絲培養按如下方法進行
1、用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養基，轉接入250ml三角瓶，含100 ml PDA液
體培養基中；
2、放置在25°C搖床上，轉速90 130r/min培養7 10 d ；3、用紗布過濾培養好的菌絲，蒸餾水衝洗，濾紙吸乾；
4、稱取0.5 1. 3g菌絲，用濾紙包好，保存於_20°C備用。(二)若供測試猴頭菇菌株保藏時間不小於6個月，則菌絲培養採用如下方法
1、取猴頭菇菌種豆塊大小轉接到PDA斜面上，25°C培養7 10天；
2、用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養基，轉接入250ml三角瓶，含100 ml PDA液 體培養基中；
3、放置在25°C搖床上，轉速90 130r/min培養7 10 d ；
4、用紗布過濾培養好的菌絲，蒸餾水衝洗，濾紙吸乾；
5、稱取0.5 1. 3g菌絲，用濾紙包好，保存於_20°C備用。二、基因組DNA的提取，所述基因組DNA可以從菌株的菌絲體或子實體中提取。1、取保存備用的猴頭菇菌絲0. 5 1. 3g，或子實體0. 5 1. 3g，放入研缽，加入液 氮迅速研磨成粉末，轉入7ml的離心管；
2、加2.5 mL 65°C預熱的抽提液，同時加入50 μ 1巰基乙醇，上下震蕩，使蛋白質變 性沉澱；
3、65°C水浴lh，每隔IOmin振蕩1次；
4、加入2.5 ml的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質； 5,8000 r/min, 4°C離心IOmin,取上清到7ml離心管；
6、加1/5體積65°C預熱的CTAB/NaCl混勻，加入2.5 ml的氯仿異戊醇混勻；
7、10000r/min,4°C離心 lOmin，取上清；
8、加入2.5 ml 65°C預熱的CTAB沉澱液，顛倒混勻，65°C水浴Ih至沉澱可見或可過
夜；
9、12000r/min，4°C離心IOmin後，小心去除上清液；
10、用0.5ml TE溶液或無菌水溶解沉澱IOmin ；
11、加入0.25ml飽和酚和0. 25m L氯仿異戊醇，混勻；
12,12000 r/min，4°C離心lOmin，取上清，加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻；
13、放置-20°C冰箱Ih或過夜；
14、12000r/min，4°C離心 10 min，棄上清；
15、自然風乾沉澱，用30μ TE溶液或無菌去離子水溶解沉澱，-20°C保存備用。三、SCAR-PCR分子標記的檢測建立。SCAR-PCR 擴增體系10XPCR buffer 2. 5 μ l,25mmol/L MgCL2 1 μ 1,2. 5 m mol/L dNTP 2 μ 1,5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 μ 1，10 μ mol/L 專用檢測引物猴王 F1/R1 1 μ 1，Ing IOng/μ 1 模板 DNA 1 μ 1，ddH20 16. 2 μ 1。SCAR-PCR 反應條件94°C Imin ；94°C 45second, 62°C 45second, 72°C lmin，30 個循環；72 °C 5min。所述專用檢測引物猴王Fl/Rl，是採用PCR技術，經過大量的篩選試驗， 獲得了猴頭菇菌種猴王的特異DNA片斷，以此片段的DNA序列為基礎，設計猴王 菌種的特異檢測引物。所述專用檢測引物猴王F1/R1具體內容為猴王Fl是 5，-CTCCTCCCTTCACAATAAATAGCCA-3，，猴王 Rl 是 5，-TCCCTGAACTTCTTTGTCTTCCCGT-3，。四、PCR擴增產物檢測。
具體檢測方法為，取PCR擴增產物8 μ 1加上1.5 μ 1 6Χ溴酚藍上樣緩衝液，混 勻，在1. 0%瓊脂糖凝膠，含GoldviewTMDNA染料進行電泳，5V/cm恆壓電泳50 min,通過紫 外凝膠成像系統觀察並照像。或者，取PCR擴增產物8 μ ，與1.5 μ 6Χ溴酚藍上樣緩 衝液混勻，點樣於1%的瓊醋糖凝膠上，於0. 5 X TBE緩衝液中，5V/cm恆壓電泳0. 5 lh， 電泳結束後，用EB染色，然後在凝膠成像儀上照相。PCR擴增產物檢測結果採用檢測引物猴王F1/R1對猴頭菇菌株進行SCAR — PCR擴 增，只有猴王菌株能擴增出分子量為1012bp的DNA條帶。實施例2 —種利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴王的方法 一種利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴王的方法，包括以下步驟
一、菌絲培養與收集，具體方法與實施例1的步驟一相同；
二、基因組DNA的提取，所述基因組DNA可以從菌株的菌絲體或子實體中提取；具體方 法與實施例1的步驟二相同；
三、SCAR-PCR分子標記的檢測建立，其中，SCAR-PCR擴增體系與實施例1步驟三的擴增 體系相同；SCAR-PCR反應條件為94°C Imin ；
940C 45second，67°C 45second, 72°C lmin，30 個循環；72°C 5min。所述專用檢測引物猴王F2/R2，是採用PCR技術，經過大量的篩選試驗， 獲得了猴頭菇菌種猴王的特異DNA片斷，以此片段的DNA序列為基礎，設計猴王 菌種的特異檢測引物。所述專用檢測引物猴王F2/R2具體內容為猴王F2是 5，-CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT-3，，猴王 R2 是 5，-CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC-3，。四、PCR擴增產物檢測，具體方法與實施例1步驟四的具體檢測方法相同。PCR擴 增產物檢測結果採用檢測引物猴王F2/R2對猴頭菇菌株進行SCAR — PCR擴增，只有猴王菌 株能擴增出分子量為37 Ibp的DNA條帶。本發明所使用的主要試劑如下(所有化學試劑均為分析純)
1、CTAB抽提液100mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB，20 mmol/L EDTA, 1. 4 mol/L NaCl, pH 8. 0;
2、CTAB沉澱液50 mmol/L Tris-HCl, 1. 0% CTAB，10 mmol/L EDTA, pH 8.0;
3、CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
4、TE緩衝液10mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA ；
5、0·5XTBE 44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3U mmol/L EDTA ；
6、上樣緩衝液0.1%溴酚藍，40%蔗糖；
7、EB 10 mg/ml 溴化乙錠；
8、PCR擴增試劑購自大連寶生物公司。本發明所使用的主要儀器如下=SW-CJ-IFB型單人水平垂直兩用淨化工作檯蘇 州淨化設備有限公司；
手提式滅菌鍋上海三申；
HYG-A全溫搖瓶櫃太倉市實驗室；
冷凍離心機Sigma 3K30 ；
PCR 擴增儀Eppendorf AG22331 Hamburg ；
掌型離心機江蘇海門市麒麟醫用儀器廠Lx-100手掌型離心機；凝膠成像系統TAN0N-2008。
權利要求
一種利用分子標記技術鑑定猴頭菇(Hericium erinaceus)菌種猴王的方法，包括菌絲培養與收集、基因組DNA的提取、SCAR PCR分子標記的檢測建立和SCAR PCR產物的檢測；其特徵在於(1)SCAR PCR分子標記的檢測，使用的檢測引物是猴王F2/R2，其中，猴王F2是5' CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT 3'，猴王R2是5' CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC 3'；(2)SCAR PCR分子標記的檢測建立SCAR PCR擴增體系為10×PCR buffer 2.5 μl， 25mmol/L MgCL2 1 μl， 2.5 m mol/L dNTP 2 μl，5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 μl，10μmol/L檢測引物各1 μl，1ng～10ng/μl模板DNA 1μl，ddH2O 16.2 μl；SCAR PCR反應條件為94℃ 1min；94℃ 45second，67℃ 45second，72℃ 1min，30個循環；72℃ 5min；(3)SCAR PCR產物的檢測結果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示，擴增出的分子量為371bp 的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標誌。
全文摘要
利用分子標記技術鑑定猴頭菇菌種猴王的方法包括菌絲培養與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標記的檢測建立和SCAR-PCR產物的檢測。使用猴王F2/R2檢測引物，SCAR-PCR產物的檢測結果在DNA圖譜中顯示的分子量為371bp的特異DNA條帶，為猴頭菇菌種猴王的標誌。
文檔編號C12Q1/04GK101985657SQ20101053953
公開日2011年3月16日 申請日期2008年11月18日 優先權日2008年11月18日
發明者劉新銳, 江玉姬, 溫志強, 謝寶貴, 鄧優錦 申請人:福建農林大學