抗蟲融合基因、融合蛋白質及其應用的製作方法
2023-06-29 06:56:16 1
專利名稱：抗蟲融合基因、融合蛋白質及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種獲得高殺蟲能力的抗蟲融合基因的方法和一種高殺蟲能力的抗 蟲融合基因和融合蛋白、以及該融合蛋白的具體應用。
背景技術：
害蟲給全球農業生產帶來每年約80億美元的損失。害蟲的防治目前主要依靠使 用化學農藥，但是農藥殘留會對人體健康帶來危害。因此，人們成功的選擇了利用殺蟲毒素 轉基因作物進行抗蟲，目前轉基因抗蟲玉米和棉花已經大量種植。
轉基因作物抗蟲的關鍵技術是獲得性能優良的殺蟲蛋白質，殺蟲蛋白質有多種。 比較常用的是Bt晶體蛋白質，例如CrylAb，CrylC等，它們已被大量運用於轉基因抗蟲作 物。但是單個殺蟲毒素往往殺蟲譜都比較窄，殺蟲活性比較低。同時長期大量使用單一的 殺蟲蛋白質還可能引起害蟲抗性的發展。因此，獲得高殺蟲活性的新型蛋白質殺蟲毒素，對 提高殺蟲能力和減緩害蟲抗性的發生具有重要應用價值。
參考文獻如下
(1)、Crickmore, N. , Zeigler, D. R. , Feitelson, J. , Schnepf, Ε. , Van Rie, J., Lereclus, D. ，Baum, J. &Dean, D. H. (1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62,807-813. (芽孢桿菌及殺蟲晶體蛋白)
(2)、Ferre, J. &Van Rie, J. (2002) Annu. Rev. Entomo 1. 47，501-533.(抗蘇雲金芽 孢桿菌昆蟲的生物化學和遺傳學)
(3) >Estruch, J. J. , Warren, G. W. ,Mullins,M. A. ,Nye,G. J. ,Craig, J. A. &Koziel, M. G. (1996) Proc. Natl. . Acad. Sci. USA 93,5389-5394.(一種對鱗翅目昆蟲具有光譜殺蟲 活性的蘇雲金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白——VIP3A)發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種獲得高殺蟲能力的抗蟲融合基因的方法；同 時提供高殺蟲能力的融合抗蟲基因，相應的融合蛋白及其用途。
為了解決上述技術問題，本發明提供一種抗蟲融合基因，該基因包括從5』 -3』依 次為含有編碼BT晶體毒素Cryl的核苷酸序列和編碼Cry9Aa毒素的核苷酸序列；且上述2 個核苷酸序列位於同一個開放閱讀框內；Cryl晶體毒素為C端切除的活性毒素。
作為本發明的抗蟲融合基因的一步改進Cryl晶體毒素為CrylAb、CrylAc， CrylAa0
作為本發明的抗蟲融合基因的進一步改進當Cryl晶體毒素為CrylAb時，融合基 因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1 ；當Cryl晶體毒素為CrylAc時，融合基因的核苷酸序列為 SEQID NO :2。
本發明還提供了上述抗蟲融合基因編碼的融合蛋白，該融合蛋白從N端至C端依 次為Cryl晶體毒素和Cry9Aa毒素。
作為本發明的融合蛋白的一種改進當Cryl晶體毒素為CrylAb時，融合蛋白的氨 基酸序列為SEQ ID NO 3 ；當Cryl晶體毒素為CrylAc時，融合蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO :4。
本發明還提供了上述融合蛋白在轉基因抗蟲作物和轉基因殺蟲微生物方面的應用。
本行業的技術人員均知道以下理論
1、二個Cry殺蟲基因的融合併不是都能夠增強殺蟲能力的。例如CrylAb和CrylCa 的融合蛋白質的殺蟲能力比相同重量的單獨CrylAb和CrylCa的混合物的殺蟲能力還要 低。
2、即使兩個單獨蛋白質組合使用具有增效作用，但也並不能得出它們的融合蛋白 具有高效殺蟲能力；這是因為在蛋白質生物化學上，兩個單獨蛋白質的物理混和與融合 是不同的，不能根據物理混和所具有的增效作用來肯定融合後所獲得的增效作用；且在不 同位置融合所得的融合蛋白的活性是大相逕庭的。
本發明所設計的用一個Cryl晶體毒素與Cry9Aa毒素融合成的人工蛋白質分子， 與原先的Cryl和Cry9Aa晶體毒素物理混合相比，具有如下優點殺蟲活性提高了 10倍以 上，殺蟲譜更廣。本發明的殺蟲蛋白質可以殺滅粘蟲、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉 米和棉花的主要鱗翅目害蟲。此外，本發明發現的融合蛋白質還可以有效的減緩害蟲抗性 的發生。
具體實施方式
本發明的以下實施例所使用的分子生物學和生物化學方法均為已知的技術。在 Ausubel 編寫的 John Wiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology，禾口 J. Sambrook 等編寫 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺 Molecular Cloning =ALabortory Manual, 3rd ED.等文獻均有詳細的說明。
實施例1、CrylAb_Cry9A和CrylAc_Cry9A融合基因的構建
編碼Cry9Aa、CryIAb、CryIAcJP CrylCa的殺蟲蛋白的基因均由上海生工合成，其 DNA 序列分別為 SEQ ID N0:5，SEQ ID N0:6，SEQ ID NO :7 禾口 SEQ ID NO :8。這些基因分別 被克隆到載體pET28a表達載體中限制性內切酶BamHI和^cI的位點之間，得到的載體分 別命名為 pET-9Aa、pET-lAb、pET-lAc 和 pET-lCa。
CrylAb-Cry9Aa 構建過程=CrylAb 片段由 BamHI 和 XmaI 酶切 pET-lAb 獲得， Cry9Aa片段由XmaI和SacI酶切pET_9Aa獲得。載體pET28a經過BamHI和SacI酶切以後 和CrylAb以及Cry9Aa連接，得到載體PET-CrylAb-Cry9Aa。這個載體包含一個融合基因， CrylAb-Cry9Aa(如SEQ ID NO 1)，其編碼一個胺基酸序列為SEQ ID No 3的融合蛋白質。
CrylAc-Cry9Aa 構建過程CrylAc 片段由 BamHI 和)(mal 酶切 pET-lAc 獲得， Cry9Aa片段由XmaI和SacI酶切pET_9Aa獲得。載體pET28a經過BamHI和SacI酶切以 後和CrylAc以及Cry9Aa連接，得到載體PET-CryAC-Cry9Aa。這個載體包含一個融合基因， CryAc-Cry9Aa(如SEQ ID NO 2)，其編碼一個胺基酸序列為SEQ ID No 4的融合蛋白質。
說明SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核酸序列的表達框從第一個起始密碼子 (ATG)開始，到最後終止密碼子(TAA)前結束，長度均為3933bp，與SEQ ID NO :3和SEQ IDNO 4對應。第一個ATG前的核酸序列GGATCC為BamHl酶切位點，其後的ACC為核糖體結 合位點，最後GAGCTC為Mel酶切位點。
CrylAb-CrylCa 的構建過程CrylAb 片段由 BamHI 和)(mal 酶切 pET-lAb 獲得， CrylCa片段由XmaI和&icl酶切ρΕΤ-lCa獲得。載體pET28a經過BamHI和&icl酶切以後 和CrylAb以及CrylCa連接，得到載體pET-CrylAb-CrylCa。這個載體包含一個融合基因， CryAb-CrylCa，其核酸序列為 SEQ ID No :9。
實施例2、殺蟲蛋白質的製備
包含殺蟲基因的載體pET_9Aa、pET-lAb、pET-lAc、pET-lCa、CrylAb-Cry9Aa, CryAc-Cry9Aa 和 CrylAb-CrylCa 分別導入 BL21Star 細胞系(Ε. coli)，在包含 50mg/L 卡那 黴素的LB固體培養基上選取單克隆。單個菌落接種到100毫升LB細菌培養液，在37°C下 震動培養至 OD600 = 0 . 6，然後加 IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactoside)到 0. 5mM,並繼 續在同樣的條件下培養4小時。培養液經過5000g離心10分鐘沉澱大腸桿菌細胞，然後棄 上清收集沉澱。沉澱中加30毫升20mM Tris-HCl緩衝液，超聲粉碎。這樣獲得的重組蛋白 質用來進行殺蟲活性的測定。
實施例3、在大腸桿菌中表達的殺蟲蛋白的殺蟲活性測定
實施例2所獲得的殺蟲蛋白各100微升單獨或者混合塗在0. 5平方釐米昆蟲人工 飼料的表面，飼養新生一齡幼蟲用來進行殺蟲活性測定。陰性對照的準備方法與實施例2 相同，但質粒為不含任何插入DNA的pET28a載體本身。飼養7天以後統計殺蟲率，結果如 表1和2所示
表 1、CrylAb_Cry9Aa 的殺蟲率
權利要求
1.一種抗蟲融合基因，其特徵是所述基因包括從5』 -3』依次含有編碼BT晶體毒素 Cryl的核苷酸序列和編碼Cry9Aa毒素的核苷酸序列；且上述2個核苷酸序列位於同一個 開放閱讀框內。
2.根據權利要求1所述的抗蟲融合基因，其特徵是所述抗蟲融合基因包括CrylAa、 CrylAb, CryIAc, CrylAa的修飾基因、CrylAb的修飾基因或CrylAc的修飾基因；所述抗蟲 融合基因還包括Cry9Aa或者Cry9Aa經過修飾的基因。
3.根據權利要求1或2的抗蟲融合基因，其特徵是所述抗蟲融合基因的核苷酸序列 為以下任意一種SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、與 SEQ ID NO :3 相比具有彡 90% 的相同性、與 SEQ ID NO: 4相比具有彡90%的相同性。
4.根據權利要求1 3中任意一種抗蟲融合基因所編碼的融合蛋白，其特徵是所述 融合蛋白從N端至C端依次為Cryl晶體毒素和Cry9Aa毒素。
5.根據權利要求4所述的融合蛋白，其特徵是所述融合蛋白的胺基酸序列為以下任 意一種SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、與 SEQ ID NO :1 相比具有彡 90% 的相同性、與 SEQ ID NO: 2相比具有彡90%的相同性。
6.如權利要求4或5所述的融合蛋白在轉基因抗蟲農作物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗蟲融合基因，該基因包括從5』-3』依次含有編碼BT晶體毒素Cry1的核苷酸序列和編碼Cry9Aa毒素的核苷酸序列；且上述2個核苷酸序列位於同一個開放閱讀框內。該抗蟲融合基因包括Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Aa的修飾基因、Cry1Ab的修飾基因或Cry1Ac的修飾基因；還包括Cry9Aa或者Cry9Aa經過修飾的基因。本發明還同時公開了上述抗蟲融合基因所編碼的融合蛋白，該融合蛋白從N端至C端依次為Cry1晶體毒素和Cry9Aa毒素。本發明的融合蛋白能用於製備轉基因抗蟲農作物。
文檔編號C07K19/00GK102031266SQ201010132429
公開日2011年4月27日 申請日期2010年3月25日 優先權日2010年3月25日
發明者沈志成, 高建華 申請人:浙江大學