一種嗜鹼芽孢桿菌及其培養方法和應用的製作方法

2023-06-29 07:04:11

專利名稱：：一種嗜鹼芽孢桿菌及其培養方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種嗜鹼芽孢桿菌，具體涉及一種嗜鹼芽孢桿菌(S""7/ma/c"/opM^)SD7903及其及其培養方法和應用。
背景技術：
：當微生物處於高滲環境時，多數中度嗜鹽菌可以在體內積累小分子有機溶質，如糖、多元醇、甜菜鹼及胺基酸等，以維持細胞內外滲透壓平衡，這類物質被稱為"相容性溶質"。其中，胺基酸的衍生物四氫嘧啶(ectoine)，幾乎為所有中度嗜鹽菌的主要累積。如應用13C-NMR、HPLC等技術，已在ifo/owo"osspp.、Sa"7/^spp.等多種嗜鹽菌中發現了四氫嘧啶，由此可見它對耐鹽細菌調滲功能的重要性。四氫嘧啶(1,4,5，6-tetrahydro畫2-methyl-4畫pyrimidinecarboxylicacid)，又名1，4，5，6，-四氨-2-甲基-4-嘧啶羧酸，一種環狀胺基酸，首先是在光合紫細菌的鹽生綠色外硫紅螺菌(Ectothiorhodospirahalochloris)中發現並得名，具有高度的可溶性和生理pH條件下的非離子特性，所以成為嗜鹽光合細菌主要的滲透壓調節劑。不僅可以維持內外滲透壓平衡，保護細胞免受高鹽傷害，還有廣泛的抗逆保護效果，能穩定酶蛋白、DNA和細胞膜結構，幫助細胞抵抗冷凍、乾旱、高溫、高滲、輻射等各種逆境。目前已經開發出許多商業用途，酶的穩定劑、微生物的保護劑、護膚品中的保溼劑和醫學上保護化療健康細胞的保護劑等。由於四氫嘧啶很難用化學方法合成，目前國外利用一種稱為細菌泌乳的工藝(Bacterialmilking)來生產四氫嘧啶。其原理是利用高滲和低滲環境的反覆交替來刺激菌體產生大量四氫嘧啶，釋放到細胞外(泌乳)。目前該工藝可應用的菌株大多為革蘭氏陰性菌，如短桿菌(5"W6acteWMmspJCM6894)、延長鹽單胞菌0f/^/o附o"oye/o"ga^3f)、鹽月兌氣鹽單胞菌(f/ia/o附o"as/2a/o(ie""ri/ca"s)等。革蘭氏陽性菌只有海球菌(Tl^W"oco"wM52)，可以採用一次培養工藝進行四氫嘧啶的生物發酵，所以一般認為革蘭氏陽性細菌不適合細菌泌乳工藝。嗜鹼芽孢桿菌DTY1(張薇等，微生物學報，2006，46(6):956-960)受鹽的誘導可生成四氫嘧啶，但是四氫嘧啶的產量不高。
發明內容本發明的目的在於提供一種嗜鹼芽孢桿菌(Bacz7/^"/ca/o;Mus)SD7903，為革蘭氏陽性菌。本發明的另一目的在於提供上述嗜鹼芽孢桿菌的培養方法。本發明的目的還在於提供上述嗜鹼芽孢桿菌(5""7/ma/ca/opM^)SD7903在生產四氫嘧疲方面的應用。本發明的嗜鹼芽孢桿菌(Sfl"7/wa/ca/c;p/n7w)SD7903，自山西五寨縣檸條種植區鹽鹼土壤中分離，已於2009年7月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.3158。上述嗜鹼芽孢桿菌的培養方法，具體操作如下將所述嗜鹼芽孢桿菌接種於NaCl濃度為0-12wt。/。的LB液體培養基內，在培養溫度為25-37'C的條件下，振蕩培養至飽和後，離心收集菌體。所述LB液體培養基中NaCl濃度為5-9wt%。所述LB液體培養基的pH為7-10。所述培養溫度為32-35'C。本發明所使用的LB培養基同生物學領域常用LB培養基相比，成分相同，僅NaCl濃度和pH不完全相同，其他成分濃度均與常用LB培養基相同。其中,NaCl濃度和pH如上所述。上述嗜鹼芽孢桿菌(Sacz7/^"/ca/o/M^)SD7903用於生產四氫嘧啶。本發明菌株嗜鹼芽孢桿菌SD7903具有以下微生物學特徵(1)菌落形態在LB培養基上菌落呈圓形，邊緣整齊，表面隆起光滑，直徑0.5lmm。(2)細胞形態革蘭氏陽性菌，可運動，菌體杆狀，大小為0.61^imx34^im，產芽孢，橢圓形(見圖1)。(3)生長條件可以在NaCl濃度為0-12wt^的LB液體培養基內生長(見圖2)，其中，最適生長的NaCl濃度為5-9wt%，最適生長溫度32-35°C，最適生長pH為7-10。(4)生理生化特徵過氧化氫酶反應陽性，甲基紅反應陽性，可以分解吐溫60;不能水解酪氨酸，苯丙氨酸脫氨酶反應、卵磷脂酶反應、v-p反應、精氨酸雙水解反應陰性，不能利用檸檬酸鹽，不能合成H2S;與模式菌Bac/〃wa/ca/o;/7//1^DSM485T相比，SD7903兼性厭氧，不水解澱粉和明膠，脲酶反應和酪蛋白反應陰性。與嗜鹼芽孢桿菌(5ac/〃^a/c"/o//n71^)DTY1(張薇等，微生物學報，2006，46(6):956-960)相比，硝酸鹽反應陽性。SD7903能利用木糖、樹膠醛糖、蜜二糖產酸，能較好利用鼠李糖、阿拉伯糖、甲硫氨酸、半乳糖、乳糖、果糖、木糖、葡萄糖、麥芽糖和肌醇等碳源。本發明與S"C77/船a/ca/o;M^DSM4857相比，不能利用甘露糖產酸。與Bacz'〃船a/c/c|pM^DTYl相比，可以利用肌醇。具體如表l:表1SD7903生理生化試驗結果tableseeoriginaldocumentpage6注+表示陽性反應，-表示陰性反應(5)功能特徵該菌最高可以耐受12n/。NaCl高鹽環境，遠遠高於模式菌5ac/〃wsa/ca—MwsDSM48575%和Ba"'〃wsa/ca/qpMwsDTY17%耐鹽度。並且表現出隨鹽度升高四氫嘧啶生成量增加的趨勢，在含10%NaCl的LB液體培養基中四氫嘧啶產量可達到170.6mg/g'cdw。(6)抗生素抗性特徵該菌對氨苄青黴素、硫酸卡那黴素、氯黴素、四環素和利福平均無抗性。(7)質粒特徵該菌不攜帶質粒，避免了質粒的不相容性，可以用作構建具多種降解能力的基因工程菌。本發明嗜鹼芽孢桿菌SD7903的16SrDNA序列測定擴增約1.4kb的16SrDNA序列，測序鑑定結果如SEQIDNO.l所示。將其在GenBank資料庫中進行同源序列比對，發現菌種SD7903與嗜鹼芽孢桿菌Sa"'〃wa/c"/o//2//i具有99%同源性。結合形態觀察、生理生化結果和16SrDNA分子測序，確定本發明分離到的高產四氫嘧啶菌株為嗜鹼芽孢桿菌Ba"7/wsa/ca/opMus。本發明菌株有較高的耐鹽性和四氫嘧啶合成能力，與屬於同一菌種的^^7/wa/cfl/op/2z7mDTYl相比，耐鹽性強且四氫嘧啶產量高，且是一株革蘭氏陽性菌，對目前工業上主要應用革蘭氏陰性菌生產四氫嘧啶而言，拓寬了生物資源利用空間，有良好的工業應用前景；此外，本發明的菌株對氨苄青黴素、硫酸卡那黴素、氯黴素、四環素和利福平均無抗性，在實際使用過程中不會向環境傳遞這些耐藥因子，保證了生態安全性；且不攜帶質粒，避免了質粒的不相容性，可以用作構建具多種降解能力的基因工程菌。圖1為本發明SD7903菌電鏡照片；圖2為本發明SD7903菌株在不同NaCl濃度中的生長情況；圖3為本發明SD7903菌株含有四氫嘧啶合成基因片段；其中M為1KbMarker,泳道1D7903菌株，泳道2陰性對照菌株圖4為本發明SD7903在不同鹽域環境下四氫嘧啶的合成能力。具體實施例方式本發明實施例中培養基配方的比例均為重量百分比，特別標明的除外，採用常規方法配製。實施例中一些分子生物學操作如未註明具體試驗條件和方法，均參照SambrookJ等主編，科學出版社，2002，分子克隆實驗指南(第三版)。本發明所使用的LB培養基同生物學領域常用LB培養基相比，成分相同，僅NaCl濃度和pH不完全相同，其他成分濃度均與常用LB培養基相同，其中，NaCl濃度和pH見實施例。生物學領域常用LB培養基配製常用液體LB培養基的配製以配製1升為例，在950ml去離子水中加入胰化蛋白腖10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搖動容器直至溶質溶解。用NaOH或HC1調pH至7.0，用去離子水定容至1L，高壓滅菌20min。常用固體LB培養基的配製以配製l升為例，在上述常用液體LB培養基中再加入15g瓊脂，其他同常用液體LB培養基的配製。實施例l:嗜鹼芽孢桿菌(Bacz7/wa/ca/o/M船)SD7903的獲得該菌株自山西五寨縣擰條種植區鹽鹼土壤中分離，取lg上述土樣用無菌水系列稀釋為10x、100x、1000x濃度，分別塗於含5%NaCl、PH為7.0的LB固體培養基，33'C培養5d後挑取單菌落，反覆劃線直至獲得純菌，從100x稀釋土樣中篩選到本發明菌。此為第一次篩選，即使用篩選培養基篩選耐鹽細菌。第二次用PCR方法復篩可產四氫嘧啶的耐鹽細菌，CTAB法提取經初篩的各耐鹽菌株的基因組DNA，以其為模板，設計特異性引物ectll98和ect1966，擴增約750bp的四氫嘧啶基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳檢査，如有該750bp條帶，則為含四氫嘧啶合成基因，為產四氫嘧啶的耐鹽菌(見圖3)。引物序列如下ectl1985'-TCGATTTCTTCGCAGGTGCAGG-3'(SEQIDNO.2)ectl9665'畫GGAATGTGCCATTATGTTCGCC-3'(SEQIDNO.3)PCR反應組分為10xPCRbuffer5^1dNTP(各2.5mM)5^1引物ectll98(l(HiM)2^1引物ectl966(1OpM)2^1gDNA(O.l嗎)lplPfuTaq(5U/jxL)0.5^1ddH2034.5^1總體積50^1PCR程序95。C變性5min,95。C40s,58。C40s，72°C1min,共30個循環，72。C延伸10min。第三次復篩高產四氫嘧啶的細菌菌株。將經前兩次篩選的耐鹽菌株接種於NaCl濃度為7wt。/。的LB液體培養基內，在160rpm，33'C的條件下，培養至00578約為1時，用HPLC法(具體操作見實施例6的相應部分)檢測四氫嘧啶產量，最終篩選出產量最高的嗜鹼芽孢桿菌SD7903。實施例2嗜鹼芽孢桿菌(石aci7/wsa/caZop/n7ws)SD7903的16SrDNA的擴增、測序及序列比對CTAB法提取菌株SD7903基因組DNA為模板，引物序列如下-27F5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,(SEQIDNO.4)1495R5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'(SEQIDNO.5)按照下列擴增體系擴增約1.4kb的片段。PCR反應組分為10xPCRbuffer5ji1dNTP(各2.5mM)5pl引物27F(10pM)2^1引物1495R(1(^M)2^1gDNA(O.l昭)lplPfoTaq(5U4d)01ddH2034.5^1總體積50plPCR反應程序:95。C5min;95。C40s，52。C40s，72。Clmin,共30個循環；72。C延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化後連接到T載體上克隆，經藍白篩選後提取質粒測序，測序結果具有序列表中SEQIDNo,l的核苷酸序列，測序公司為上海生工。應用BLAST對序列同源性比較，發現該菌與5ac/〃wa/ca/o//n7^DSM485T(BA16SRRX)同源性最高，達到99%。因此，參照《Bergey，sManualofDeteriminativeBacteriology》第9版禾f]《常見細菌系統鑑定手冊》芽孢桿菌屬特徵，結合其形態特徵、生理生化指標、16SrDNA基因序列相似性，鑑定菌株SD7903為嗜鹼芽孢桿菌Sfl"'〃z^a/ca/op/n7ws，保藏號為CGMCCNo.3158。實施例3嗜鹼芽孢桿菌(萬""7/w"/c"/opMw)SD7903的抗性檢測將該菌分別接種於含50mg/L濃度的氨苄青黴素、硫酸卡那黴素、氯黴素、四環素和利福平抗生素的常用LB固體培養基中，33"C溫箱中靜置培養5d，觀察菌體是否在培養基上生長。結果表明，該菌對氨苄青黴素、硫酸卡那黴素、氯黴素、四環素和利福平均無抗性，在實際使用過程中不會向環境傳遞這些耐藥因子，保證了生態安全性。實施例4嗜鹼芽孢桿菌(Sacz7/wsa/ca/opMw)SD7903的質粒檢測用改進的鹼裂解法提取SD7903的質粒。具體方法如下1、常用LB液體培養基33X:、160rpm條件下培養至對數生長期；2、取1mL菌液裝於離心管中，4'C條件下12000r/min離心1min收集菌體；3、加入250iiL的P1溶液，振蕩懸浮沉澱；4、加入250pL的P2溶液，輕輕混勻，顛倒幾次至溶液澄清、黏稠；5、加入250的P3溶液，顛倒混勻(可稍微劇烈)至出現白色絮狀物，4。C條件下12000r/min離心10min;6、將上清轉移到新的離心管，加0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，12000r/min離心15min;7、去上清，力BlmL無水乙醇，輕混，12000r/min離心5min;8、去上清，無菌風吹乾，加20pLTE溶液溶解沉澱；9、瓊脂糖凝膠電泳分析。其中，所用試劑的配製如下.-BufferPl:在800mLMilli-Q中加入6.06gTrisbase,3.72gEDTA'2H20，用HCl調節pH至8.0,定容至1升，滅菌後4。C保存。BufferP2:在800mLMilli-Q中加入8.0gNaOH，10.0gSDS,定容至1升，不滅菌常溫保存。BufferP3:500mLMilli-Q中加入294.5g乙酸鉀，用冰醋酸調節pH至5.5，定容至l升，不滅菌4"C保存。質粒檢測結果表明，該菌不攜帶質粒，因此降解基因編碼於染色體上。這一特性使得在利用質粒進行水平基因轉移過程中，避免了質粒的不相容性，是構建具備多種降解能力的基因工程菌的良好材料。實施例5本發明的嗜鹼芽孢桿菌SD7903的培養方法按表2的培養條件將嗜鹼芽孢桿菌SD7903菌接種於含有NaCl的LB液體培養基內，在160rpm條件下，培養至飽和後，4T:條件下12000r/min離心1min收集菌體。tableseeoriginaldocumentpage11實施例6本發明的嗜鹼芽孢桿菌SD7903生產四氫嘧啶的實驗將實施例5中按編號1的培養方法培養的菌液，按體積百分比為1%的接種量分別將其接種於100ml,pH8，NaCl含量為1%、3%、5%、7%、9%、10%的LB液體培養基，於33。C，160rpm條件下繼續培養至OD578約為1，然後採用如下方法檢測不同鹽濃度條件下四氫嘧啶的生成量。檢測方法用改進的Bligh方法(KuhlmannAU,BremerE，ApplEnvironMicrobiol,2002,68:772-783)提取菌體中四氫嘧啶。將菌體在不同鹽濃度的LB培養基中培養至ODs78約為l。離心(12000rpm，5min)收集菌體凍幹，測菌體乾重。用400pl抽提液(甲醇氯仿水=10:5:4)溶解菌體，猛烈振蕩30min進行抽提。再加入等體積(約13(Hd)氯仿和水，繼續振蕩10min。離心(12000r/min,20min)分層收集水相、乾燥。乾燥物質用100^il水和400^il乙腈(ACN)重新懸浮，稀釋後溶解在80%(體積比)ACN中進行HPLC(Waters600，USA)分析。色譜柱為氨基反向色譜柱(250x4.6mm，5nm,nBondapak，USA);流動相乙腈:水(v:v)=60:40，流速1.0ml/min，柱溫25。C;檢測波長210nm;進樣體積10pl。滯留時間約6min，結果見圖4。在l%NaCl濃度的LB培養基中，SD7903可產四氫嘧啶19.1mg/gxdw，而同種菌DTY1產四氫嘧啶1.4mg/g.cdw。隨鹽濃度升高，四氫嘧啶含量也逐漸升高，10。/。NaCl濃度中四氫嘧啶產量最高，達170.6mg/gxdw(圖4)。在相同鹽濃度的LB液體培養基中，本發明SD7903的四氫嘧啶生成量遠遠高於屬於同菌種的菌株DTY1的生成量，此外，本發明菌株還受高鹽環境的誘導，一定範圍內鹽度升高，生成量也隨之增加。參考文獻1、張薇，胡躍高，張力群，高洪文，中度嗜鹽菌DTY1的鑑定及其耐鹽機制的初步分析，微生物學報，2006，46(6):956-9602、KuhlmannAU,BremerE.OsmoticallyregulatedsynthesisofthecompatiblesoluteectoineinBac"/ws/a他w"'z'andrelatedBacz7/z/sspp.ApplEnvironMicrobiol,2002,68:772-783SEQUENCELISTING華北電力大學—種嗜鹼芽孢桿菌及其培養方法和應用335Patentlnversion3.511437DNABacillusalcalophilus1gagcgaaccaaagggagcttgctcccagaggttagcggcggacgggtgagtaacacgtgg60gcaacctgccctgtagattgggataacatcgagaaatcggtgctaataccggataatcaa120ttgaatcacatggtttgattgtaaaagatggctccggctatcactacgggatgggcccgc180ggcgcattagctagttggtaaggtaatggcttaccaaggcgacgatgcgtagccgacctg240agagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcag300tagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaagg360ttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcgaataggtcggca420ccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatac480gtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtcttttaa540gtctgatgtgaaatctcggggctcaaccccgagcggtcattggaaactgggagacttgag600tacagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagatatgtggaggaa660caccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtgggg720agcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttag780gggtttcgatgcccttagtgccgaagttaacacattaagcactccgcctggggagtacga840ccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagtggagcatgtggt900ttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaccactctagag960atagagctttccccttcgggggacaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgt1020gtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagca1080tttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgt1140caaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagg1200gcagcaaaaccgcgaggtcgagccaatcccataaagccattctcagttcggattgtaggc1260tgcaactcgcctacatgaagccggaattgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtga1320atacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaa1380gtcggtggggtaaccttttggagccagccgcctaaggtgggacagatgattggggtg14372<211〉22DNAArtificialSequence擴增四氫嘧啶基因的上遊引物2tcgatttcttcgcaggtgcagg22322DNAArtificialSequence擴增四氫嘧嚏基因的下遊引物3ggaatgtgccattatgttcgcc22421DNAArtificialSequence擴增SD7903基因組DNA上遊引物4gagagtttgatcctggctcag520DNAArtificialSequence擴增SD7903基因組DNA下遊引物5ctacggctaccttgttacga權利要求1、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)SD7903CGMCCNo.3158。2、權利要求1所述嗜鹼芽孢桿菌的培養方法，其特徵在於，將所述嗜鹼芽孢桿菌接種於NaCl濃度為0-12wt。/。的LB液體培養基內，在培養溫度為25-37°C的條件下，振蕩培養至飽和後，離心收集菌體。3、根據權利要求2所述的培養方法，其特徵在於，所述LB液體培養基中NaCl濃度為5-9wt%。4、根據權利要求2所述的培養方法，其特徵在於，所述LB液體培養基的pH為7-10。5、根據權利要求2所述的培養方法，其特徵在於，所述培養溫度為32-35'C。6、權利要求1所述嗜鹼芽孢桿菌的應用，其特徵在於，所述嗜鹼芽孢桿菌用於生產四氫嘧啶。全文摘要本發明公開了一種屬於微生物
技術領域：
的嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)SD7903，保藏號為CGMCCNo.3158，本發明還公開了該菌株的培養方法以及該菌株在生產四氫嘧啶方面的應用，該菌具有較高的四氫嘧啶合成能力，且是一株革蘭氏陽性菌，對目前工業上主要應用革蘭氏陰性菌生產四氫嘧啶而言，拓寬了生物資源利用空間，有良好的工業應用前景。文檔編號C12N1/20GK101597581SQ20091008822公開日2009年12月9日申請日期2009年7月13日優先權日2009年7月13日發明者薇張申請人:華北電力大學