吲哚咔唑生物鹼及其製備方法和用途的製作方法

2023-06-29 17:00:41 2

專利名稱：吲哚咔唑生物鹼及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及新穎的吲哚咔唑生物鹼類化合物，由海洋來源的馬杜拉放線菌Actinomadurasp.007發酵製備該吲哚咔唑生物鹼類化合物的方法，以及該類化合物在製備細胞周期抑制劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術：
吲哚咔唑類生物鹼星形孢菌素(staurosporine)自從鏈黴菌AM-2282產物中分離報導(S.Omura，Y.Iwai，A.Nalagawa，et al.，J.Antibiot.，1977，30，275；A.Furusaki，N.Hashiba，T.Matsumoto，et al.，J.Chem.Soc.Chem.Comm.，1978，800-801)以來陸續發現具有多種重要的生物活性，如抗菌、擴張血管、細胞毒活性以及抑制血小板凝集和抑制蛋白激酶C等。由於星形孢菌素苷元對其相關生物活性具有重要意義(D.Meksurriyen，G.A.Cordell，J.Nat.Prod.1988，51，884-892)，因而以星形孢菌素苷元為母體的吲哚咔唑生物鹼類化合物作為重要的生物活性分子受到極大關注。
含有星形孢菌素苷元骨架的吲哚咔唑生物鹼類化合物除了非苷類衍生物以外主要還有以Staurosporine、K-252a(H.Kase，K.Iwahashi，Y.Matsuda，J.Antibiot.，1986，39，1059-1065)和K-252d(T.Yasuzawa，T.Iida，M.Yoshida，et al.，J.Antibiot.，1986，39，1072-1078)為代表的三個類型的苷類化合物。這四大吲哚咔唑生物鹼類化合物均已從自然界分離得到，而且數百個苷類衍生物也已被人工合成(金井文彥，網城 宣善，北村 雄志，等，WO01/004125，國際
公開日2001年1月18日；マイケル·イ一·ルイス，コラ·ネフ，ヅル·ロバ一ッ-ルイス，等，特開2003-113184)。但迄今尚未見有關糖環上並有雜環的天然星形孢菌素類似物的報導。另外，經X-線單晶衍射分析(A.Furusaki，N.Hashiba，T.Matsumoto，et al.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1978，800-801；N.Funato，H.Takayanagi，Y.Konda，et al.，Tetreahedron Lett.，1994，35，1251-1254)和核磁共振研究(P.D.Davis，C.H.Hill，W.A.Thomas，et al.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1991，182-184)，已確定了星形孢菌素及其類似物的吡喃環在固態和溶液狀態中的構型，即游離鹼取椅式構型，而4′-N被質子化的鹽則取船式構型(其中O-1′和C-4′為船頭和船尾)。但迄今尚未見吡喃環取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構型的化合物。

發明內容
本發明旨在提供一類新化學結構的具有細胞周期抑制、腫瘤細胞增殖抑制等抗腫瘤活性的化合物，具體而言，是要提供一種在糖環3′和4′位並氧氮雜環、糖吡喃環取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構型的星形孢菌素類化合物。
本發明的目的還在於提供該類新化合物的製備方法。
本發明的另一目的在於提供該類新化合物在製備細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑、腫瘤細胞殺傷劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
本發明首次從自然界微生物發酵物中發現了一種新的吲哚咔唑生物鹼類式I化合物 式I式I中，R1、R2、R4、R5、R6、R7均可為氫、羥基、烴氧基、醯氧基、氨基、醯氨基；R3和R8可為氫、烴基、羥基、醯基。
優選的本發明化合物是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7均為氫，R8為甲基的式I化合物。
本發明所提供化合物其最顯著的結構特點在於在糖環3′和4′位並氧氮雜環、且吡喃環取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構型。
本發明式I化合物的製備方法是，通過發酵培養可生產吲哚咔唑生物鹼類化合物的微生物，如放線菌007株，首先獲取含式I化合物的發酵產物，再利用相關專業技術人員熟知的分離純化技術，如液液萃取、柱層析、高效液相等，純化製備並獲得式I化合物。
本發明的實施例中列舉了利用放線菌007株製備優選的本發明式I化合物的實例。
該放線菌007株由從青島近海海泥樣品中分離，並經分類學研究鑑定為馬杜拉放線菌屬的一株微生物Actinomadura sp.007。該菌株已於2004年12月13日保藏在中國典型培養物保減中心(保減編號CCTCC M204076)。該馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCCM204076株具有如下微生物菌學特徵(見表1)
表1 007菌株的微生物菌學特徵

需要特別說明的是，經發酵微生物製取本發明式I化合物的方法可採用其它任何能生產吲哚咔唑生物鹼類化合物的微生物，只要能生產該類化合物的微生物均可用作產素菌用於製備式I化合物。
本發明採用麗絲胺羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)法、四氮唑鹽(MTT)還原法和流式細胞術結合顯微鏡下檢測細胞形態特徵的方法，測試評價了本發明式I化合物對小鼠乳腺癌tsFT210細胞、人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、小鼠白血病P388細胞、人白血病HL60細胞的細胞增殖抑制、細胞周期抑制和細胞凋亡誘導以及對腫瘤細胞的直接殺傷等作用。實驗證實，式I化合物對腫瘤細胞可通過抑制細胞周期周轉、誘發癌細胞凋亡或直接的殺傷等方式，顯示抑制腫瘤細胞增殖的生物學活性，從而發揮其抗腫瘤作用，尤其對人肺癌A549細胞具有非常強的抗腫瘤活性。
本發明的式I化合物與藥物可接受的各種載體、賦形劑或輔料配伍，可製成作細胞周期抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑等抗腫瘤藥物，用於腫瘤的治療。
本發明的式I化合物還可作為抑制細胞周期的低分子生物探針用於生命科學研究。當把式I化合物作為細胞周期抑制劑用於生命科學研究時，可溶於甲醇或含水甲醇中，也可溶於二甲基亞碸的含水溶液中加以應用。
具體實施例方式下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
在如下的實施例中所指的化合物I的化學結構是式I化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7為氫，R8為甲基，吡喃環取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構型 式I實施例1 化合物I的發酵生產及分離精製1發酵生產產素菌的發酵培養 按培養微生物的常規方法，取馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076適量，接種於高氏合成1號瓊脂固體斜面培養基上，在28攝氏度培養箱中培養7天。
取斜面培養7天的馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076適量，接種到一個含100毫升種子培養液(培養基組成葡萄糖20.0克，K2HPO40.5克，MgSO40.5克，牛肉膏3.0克，玉米漿3.0克，酵母膏10.0克，澱粉10.0克，CaCO32.0克，人工海水1升，調pH7.0)的三角燒瓶中，在28℃、120轉/分鐘條件下搖床培養48小時，獲種子培養液。取該種子培養液，按5％接種量分別接種於100個內裝100毫升生產培養液(培養基組成同上)的三角燒瓶中，裝載於28℃、120轉/分鐘搖床上進行為期7天的生產發酵，獲得含有吲哚咔唑生物鹼類目標化合物的發酵物。相同條件下發酵兩次，共獲發酵物約20升。
2含化合物I的菌體粗提物的製備將上述馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076的發酵物(約20升)抽濾，濾取菌體部分，用1.5升80％丙酮水溶液浸泡並在室溫下攪拌過夜提取，4000轉/分鐘離心15分鐘，取上清液，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合併乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得含化合物I的菌體粗浸膏(4.8克)。
3化合物I的分離精製取含化合物I的Actinomadura sp.007 CCTCC M204076的菌體粗浸膏(4.8克)，用氯仿-甲醇混合溶劑溶解後加20克200-300目矽膠H(青島海洋化工集團公司產品)拌樣，添加到裝填有50克青島海洋化工集團公司產薄層層析用矽膠H的玻璃減壓柱上，以氯仿→氯仿-甲醇混合液為洗脫劑，進行減壓柱層析。洗脫溶劑的極性通過提高氯仿中甲醇的用量來梯度遞增，每個洗脫流份兒分別接收150毫升，根據薄層層析和活性檢測結果，進行合併，得到含化合物I的活性組份Fr-3(520毫克，氯仿-甲醇98∶2→85∶15洗脫物)。將Fr-3同法上矽膠H減壓柱，以石油醚-丙酮混合液為洗脫劑，進行減壓柱層析，經薄層層析和活性檢測，合併相關流份，得到用石油醚-丙酮(5∶5)洗脫的目標化合物部分，再經SephadexLH-20柱層析分離(氯仿-甲醇5∶5洗脫)，得到含化合物I的目標組分Fr-3-6。將該組分Fr-3-6幹法上反相矽膠RP-18減壓柱，用甲醇-水混合溶劑洗脫，經HPLC檢測合併，得到化合物I粗品，再經半製備HPLC(Capcell Pak C18柱，5μm，20×250mm；流動相40％乙腈-水，流速4毫升/分鐘，檢測波長288納米)純化製備，得化合物I純品(15毫克，保留時間15分鐘)。
化合物I淡黃色結晶(氯仿-甲醇)，mp 283.4-285.5℃，[α]D20+83.2(c 0.10，MeOH)，分子式C28H22N4O4。正離子TOF-MS m/z479[M+H]+；正離子HR-TOF-MS實測值479.1704，C28H23N4O4[M+H]+計算值479.1719。UVλmaxMeOHnm(ε)232(19613)，243(19020)，275(19720)，290(33212)，318(9936)，332(9636)。IR(KBr)νmaxcm-13377(NH)，2924，2935(CH2)，1739(惡唑酮C＝O)，1677(內醯胺C＝O)，1589，1458，1399，1354，1321，1275，1228，1150，1133，1105，1030，774，751。1H及13CNMR數據見表2。
表2 化合物I在氘代DMSO中的600MHz1H和150MHz13C NMR數據


實施例2 化合物I的體外抗腫瘤活性測試1實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配製 測試樣品為上述實施例1中分離精製的化合物I純品。精密稱取適量樣品，用甲醇配製成所需濃度的溶液，供測活性。
細胞系及細胞的繼代培養 採用人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、人白血病HL60細胞、小鼠乳腺癌tsFT210細胞及小鼠白血病P388細胞等癌細胞系。各種細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養基，在32℃(tsFT210和P388細胞)或在37℃(A549、HL60及BEL-7402細胞)於通入5％二氧化碳的培養箱中繼代培養。
細胞增殖抑制活性測試方法麗絲胺羅丹明B(SRB)法 取對數生長期的人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞或小鼠乳腺癌tsFT210細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基配製成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種於96孔板中，每孔加入2微升不同濃度的樣品或空白溶液，32℃下培養17小時(tsFT210細胞)或37℃下培養24小時(A549或BEL-7402細胞)。取藥物作用下培養後的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態學變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態學特徵，繼而在4℃、3000轉/分鐘離心3分鐘，吸去上清。每孔細胞中加入20％三氯醋酸50微升，置於4℃固定1小時，用水衝洗5次並空氣乾燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升並在室溫靜置30分鐘。用1％醋酸水清洗4次，除去未結合的游離SRB染料。每孔加入150微升Tris緩衝液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白結合染料並利用MD公司產SPECTRA MAX Plus型酶標儀測定每孔在520nm處的光密度(OD)值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設置三孔，另設三孔空白對照和無細胞調零孔(如果藥物有顏色要做相應藥物濃度無細胞調零)。各孔OD值先做相應無細胞調零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
四氮唑鹽(MTT)法 取對數生長期的人白血病HL60細胞和小鼠白血病P388細胞，將細胞密度調至每毫升2×105個細胞，按每孔200微升接種於96孔細胞培養板中，於37℃通入5％CO2的培養箱中培養4小時。每孔加樣品液或空白液各2微升，培養24小時後，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理鹽水溶液)10微升，繼續培養4小時，37℃、2000轉/分鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結晶完全溶解後，利用MD公司產SPECTRA MAX Plus型酶標儀測定每孔在570nm處的吸光值(OD值)。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設置三孔，另設三孔空白對照和無細胞調零孔(如果藥物有顏色要做相應藥物濃度無細胞調零)。各孔OD值先做相應無細胞調零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
流式細胞術取對數生長期的tsFT210細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基配製成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔0.5毫升接種於24孔板中，每孔加入5微升不同濃度的樣品溶液，32℃下培養17小時。取藥物作用下培養後的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態學變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態學特徵，必要時進行拍照。繼而將細胞分別從24孔板轉移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4℃下3000轉/分離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩衝溶液(PBS)震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克檸檬酸納和200毫克NP-40)，4℃下染色30分鐘後，加入150微升PBS稀釋，用流式細胞儀分析測定細胞中DNA的含量分布。細胞在細胞周期各時相中的分布利用庫爾特公司產計算機軟體WinCycle進行分析計算。
2實驗結果化合物I對癌細胞增殖的抑制活性在SRB法測試中，化合物I在21和2.1微摩爾的濃度下對小鼠乳腺癌tsFT210細胞增殖的抑制率分別為28.3％和21％。
在SRB法或MTT法測試中，不同濃度的化合物I對人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、人白血病HL60細胞和小鼠白血病P388細胞的增殖抑制結果見表3。
表3 不同濃度的化合物I對癌細胞增殖的抑制率(％)

流式細胞術檢測分析結果tsFT210細胞經化合物I處理17小時後測得的流式細胞術結果見表4。如表4所示，化合物I當在每毫升10微克以上濃度時可將tsFT210細胞的細胞周期顯著阻滯在G2/M期，在每毫升100微克時還顯示了較弱的細胞凋亡誘導活性。
表4 tsFT210細胞經化合物I處理17小時後在細胞周期各時相中的相對分布

注本表數據系將tsFT210細胞經碘化丙啶染色後用流式細胞術分析測得結果。
形態學檢測結果在光學倒置顯微鏡下觀測到，經高濃度的化合物I處理後，各種癌細胞呈不同程度的典型的壞死性細胞的形態學特徵，表明化合物I在高濃度時對哺乳動物癌細胞具有一定的直接殺傷性細胞毒活性。
3結論化合物I對多種人癌細胞及哺乳動物癌細胞具有直接殺傷作用和對細胞增殖的抑制、對細胞周期的G2/M期抑制以及細胞凋亡誘導等抗腫瘤活性，尤其是對人肺癌A549細胞具有非常強的增殖抑制作用。這些結果表明化合物I可製成細胞周期抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑等抗腫瘤藥物，用於腫瘤的治療，也可作為抑制細胞周期的低分子生物探針用於生命科學研究。
權利要求
1.式I化合物，其中，R1、R2、R4、R5、R6、R7為氫、羥基、烴氧基、醯氧基、氨基或醯氨基；R3和R8為氫、烴基、羥基或醯基；吡喃環取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構型。 式I
2.權利要求1所述的式I化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7均為氫；R8為甲基。
3.權利要求1所述式I化合物的製備方法，其特徵是發酵培養馬杜拉放線菌屬的吲哚咔唑生物鹼類化合物的生產菌，獲取含有該類化合物的發酵物，再從該發酵物中分離純化並製備出式I化合物。
4.權利要求3所述式I化合物的製備方法，其中所述吲哚咔唑生物鹼類化合物的生產菌是馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076。
5.權利要求1所述的式I化合物在製備細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導劑或腫瘤細胞殺傷劑中的用途。
6.權利要求1所述的式I化合物在製備腫瘤細胞增殖抑制劑中的用途。
7.權利要求1所述的式I化合物在製備抗腫瘤藥物中的用途。
8.馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007，其保藏編號為CCTCC M204076。
9.權利要求8所述的菌株用於生產權利要求1所述的式I化合物的用途。
全文摘要
本發明涉及新穎的吲哚咔唑類生物鹼及其製備方法和用途。本發明採用海洋來源的馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007發酵製備新穎化學結構的吲哚咔唑生物鹼類化合物，並經實驗證實可作為細胞周期抑制劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號C12P17/18GK1683374SQ20051005143
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月7日 優先權日2005年3月7日
發明者崔承彬, 韓小賢, 顧謙群, 朱偉明, 劉紅兵 申請人:中國海洋大學