抗耐藥性細菌感染多肽Cbf-14及其用途
2023-06-29 20:32:41 2
抗耐藥性細菌感染多肽Cbf-14及其用途
【專利摘要】本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種抗菌多肽。本發明依據Cathelicidin家族的抗菌多肽，將其部分活性胺基酸位點進行突變，採用固相化學合成法獲得對青黴素耐藥性細菌具有高抑制活性的抗菌多肽。藥效學試驗結果表明，本發明的抗菌多肽對耐藥性細菌具有較好的體外抗菌活性，可用於治療耐藥性細菌感染方面的疾病。
【專利說明】抗耐藥性細菌感染多肽Cbf-14及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學【技術領域】，具體涉及一種抗菌多肽及其應用，本發明的抗菌多肽具有抗耐藥性細菌感染的用途。
【背景技術】
[0002]隨著抗生素的大量應用，特別是無指徵用藥、不恰當地選擇備用抗菌藥、過度治療及頻繁換藥，導致細菌的耐藥率越來越高，耐藥程度越來越嚴重。自發耐藥突變的存在與抗生素選擇壓力的持續作用，以及病原菌的環境適應能力與人體微環境生態變化的進化催動，是臨床上耐藥菌和多重耐藥菌產生的基礎。多重耐藥菌，廣義上包括廣泛耐藥菌或超級細菌，其產生和發展給臨床診治帶來了巨大的挑戰。
[0003]抗菌肽是一種很有潛力的新抗菌藥物來源，由於其獨特的抗菌機理和多樣的生物活性，自研發至今，其研究及應用已成為生物製藥和臨床醫學領域中的熱點。與傳統抗生素相比具有分子量小、抗菌譜廣、抗菌機理獨特、不易產生耐藥性等優點。陽離子抗菌肽被廣泛定義為少於50個胺基酸的富含正離子的多肽，且有一半或以上的疏水殘基。多肽的所含的正電荷來源於賴氨酸和精氨酸所攜帶的正電荷。大多數抗菌肽具陽離子性和雙親性，因長度、電荷數、胺基酸序列和二級結構的位置不同而多肽的特性不同。多肽按照其二級結構分為四類，分別是α螺旋、β片層、無規則捲曲和線性肽。這種多肽具有廣譜殺菌作用，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都有效果。一些抗菌肽還有其他生理活性，抗病毒，抗癌，促進傷口癒合，激活免疫應答等。陽離子多肽的這些特性使得其成為新的治療藥物的有力候選者。陽離子抗菌肽的作用機理的研究也越來越廣泛。抗菌肽的作用機理有很多種，有些可以使細胞膜透化，有些作用於細胞壁，還有一些抑制細胞內大分子的合成。
[0004]但目前，抗菌肽的發展存在三大瓶頸，即:抗菌肽的生產成本高；抗菌肽的毒性較大；抗菌肽對蛋白酶體的穩定性差。已有諸多學者研究表明可從設計上改善原有抗菌肽的結構，保留其活性位點，縮 減肽鏈，以減少抗菌肽的生產成本。在進行抗菌肽設計的時候，需要考慮到毒性及穩定性等因素，使其與原有天然抗菌肽在毒性及穩定性方面保持一致，通過統籌電荷、疏水性、二級結構等諸因素，使其更加低毒聞效穩定。
【發明內容】
[0005]本發明依據Cathelicidin家族的抗菌多肽，將其部分活性胺基酸位點進行突變，採用固相化學合成法獲得對青黴素耐藥性細菌具有高抑制活性的抗菌多肽，本發明抗菌多肽，胺基酸序列如SEQ ID:Ν0:1所示。簡稱Cbf-14，全序列為:精氨酸_亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸。
[0006]Cbf-14是將Cbf-K16的C端胺基酸進行截短，同時加入α螺旋重複序列，採用固相化學合成法獲得了對細菌及其耐藥株具有高抑制活性的具有14個胺基酸的抗菌肽突變體。經改造後，其含有7個正電荷，分子量為1819.33，等電點為12.31。固相合成成本降低了 2/3，毒性沒有明顯變化，因此大大解決了抗菌肽的生產成本高的問題，有利於抗菌肽在治療耐藥細菌感染方面的應用。
[0007]採用固相化學合成法即可得到本發明的抗菌多肽。
[0008]體外抗菌活性研究表明，本發明的多肽Cbf-14具有顯著的殺滅耐藥性細菌的作用，可用來製備抗耐藥性細菌感染的藥物。所述耐藥性細菌優選金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌。
[0009]抗菌肽在殺菌的同時也有可能作用於高等有機體包括人體細胞，因為抗菌肽的作用方式都是在細胞膜上穿孔使得細胞發生滲漏死亡。所以把抗菌肽能否使紅細胞發生滲漏及抗菌肽能否使小鼠原代脾細胞發生死亡作為是否有毒性的一個標準。如果抗菌肽能使紅細胞中的血紅蛋白發生滲漏，就可以通過檢測OD54tl測定其毒性大小。因此本發明還檢測了本發明的抗菌肽Cbf-14對綿羊紅細胞的溶血活性。實驗表明，本發明抗菌肽的溶血率很低。同時本發明發現在實驗濃度範圍內，本發明的抗菌肽對小鼠脾細胞沒有毒性作用。結果證實，本發明抗菌肽的毒性極小。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是本發明抗菌肽Cbf-14的HPLC圖譜
[0011]圖2 是 Cbf-14 的 Mass 圖譜
[0012]圖3是Cbf-14的圓二色譜
[0013]圖4是Cbf-14對青黴素耐藥的金黃色葡萄球菌的殺菌曲線
[0014]圖5是Cbf-14對青.黴素耐藥的表皮葡萄球菌的殺菌曲線
[0015]圖6是Cbf-14對青黴素耐藥的大腸埃希菌的殺菌曲線
[0016]圖7是Cbf-14對青黴素耐藥的銅綠假單胞菌的殺菌曲線
[0017]圖8是Cbf-14對青黴素耐藥的肺炎克雷伯菌的殺菌曲線
[0018]圖9是Cbf-14對綿羊紅細胞的溶血曲線
[0019]圖10是Cbf-14對小鼠原代脾細胞的毒性
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021]抗菌多肽Cbf-14的合成及結構確證:
[0022]按常規固相合成方法人工合成本發明多肽。具體實驗步驟如下:
[0023]製備的Cbf-14的多肽序列為:
[0024]H-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-OH
[0025]多肽的合成:多肽的合成從C端到N端逐個進行。將Fmoc-Val-Wang Resin用二氯甲烷浸泡15分鐘，待樹脂膨脹，抽去二氯甲烷；加入體積比為1:4的六氫吡啶/DMF溶液，使用氮氣鼓動，反應2次，時間為5分鐘和15分鐘，反應結束後用DMF洗滌樹脂9次。取少量樹脂加入驗色劑ABC各2-3滴(A液:茚三酮/無水乙醇溶液；B液:吡啶；C液:苯酚/無水乙醇溶液)在100°C下共熱3分鐘，溶液及樹脂顏色變為藍色，以脫除氨基保護。加入Fmoc-Val-OH和Η0ΒΤ，用適量DMF溶解，加入DIC和Collidine，氮氣鼓動，反應I小時，反應結束後用DMF洗滌樹脂6次，重複進行縮合反應，依次連接各Fmoc保護胺基酸，完成直鏈序列的合成，將樹脂用二氯甲烷和乙醚浸泡後抽乾。加入TFA，在恆溫搖床中反應2h，搖床轉速110r/min，溫度25°C。濾去樹脂，向濾液中加入無水乙醚,用離心機離心後獲得固體,加入無水乙醚洗滌，再離心，重複數次後烘乾即可獲得Cbf-14粗品多肽。
[0026]純化:稱取一定量粗品，加入適量乙腈，超聲至澄清用過濾器出去大顆粒雜誌。同時過製備型液相色譜儀，分段收取樣品。用分析色譜儀做梯度分析，將達到所需純度樣品進行保留。然後進行冷凍乾燥處理。純化後的多肽經過質譜及高效液相色譜鑑定。
[0027]由附圖1可以看出，本發明的多肽，通過HPLC確定其純度大於98.33%，。
[0028]由附圖2可以確定其分子量分別為1819.33，其分子量與理論值1819.30吻合。
[0029]使用M0S450圓二色譜儀於室溫下測定抗菌肽Cbf-14的二級結構。抗菌肽Cbf-14濃度為200 μ g/ml，溶液環境分別為純水和25mM的十二烷基苯磺酸鈉(SDS)以及三氟乙醇(TFE)0掃描範圍為190-250nm，0.1cm徑長的石英皿，狹縫lnm，掃描速度為100nm/min，每個樣品連續掃描3次，取平均值。結果見表I及附圖3。
[0030]表lCbf-14的二級結構
【權利要求】
1.一種抗菌多肽，其胺基酸序列如SEQ ID:N0:1所示。
2.一種藥物組合物，其中含有權利要求1的抗菌多肽及藥學上可接受的載體。
3.權利要求1的多肽用 於 製備抗耐藥性細菌感染藥物的用途。
【文檔編號】A61K38/10GK103435686SQ201310413721
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】周長林, 賈源賓, 田玉偉, 李冰, 李博, 王慧, 竇潔 申請人:南京映海月生物科技有限公司