寡核苷酸微陣列的製作方法

2023-06-30 03:54:21 2

專利名稱：寡核苷酸微陣列的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含短的化學修飾的RNA寡核苷酸的寡核苷酸微陣列和此類微陣列在基因組學應用中的用途。
背景技術：
生物聚合體的微陣列在生物醫學研究中已成為有價值的工具。微陣列技術已發展到這樣的程度，使得微陣列是具有成本效益的且能提供給研究者所需的靈活性和質量保證(Barrett J Carl；Kawasaki Ernest S，Microarraysthe use of oligonucleotides and cDNA for the analysis of geneexpression.Drug Discovery Today，2003，8，134-41)。可利用具有不同類型生物聚合體陣列的許多微陣列平臺，例如蛋白質或肽陣列，包括抗體或酶陣列。其它可獲得的微陣列平臺使用DNA陣列，根據表面結合的寡核苷酸探針的不同，其有幾種類型例子包括使用通常點樣在固體支持體表面上的長的多核苷酸的cDNA陣列，由點樣在陣列表面或通過末端連接附著的長的(例如40-80個核苷酸)寡核苷酸組成的DNA寡核苷酸陣列，和由原位合成的短的(例如25個核苷酸(nt))寡核苷酸組成的DNA寡核苷酸陣列(例如Affymetrix)。DNA微陣列作為實驗工具的能力依賴於經互補鹼基配對的特異分子識別，其使得對於高通量同時分析基因表達是非常有用的。在後基因組時代，微陣列已成為發展許多基於雜交的試驗，例如表達概況分析、單核苷酸多態性(SNP)檢測、DNA測序和大規模基因型分析的重要的工具。
最近，已發現真核細胞含有許多約18至約25個核苷酸的短RNAs。這些短RNAs作為例如RNA幹擾(RNAi)的效應物或在轉錄後水平上基因表達的調節物。RNAi是一種進化保守的過程，其基於轉換長的雙鏈(ds)RNA為20至23個核苷酸的短幹擾性dsRNAs(siRNAs)，其通過降解靶mRNA而沉默基因。其它短的RNAs包括microRNAs(miRNAs)和小的暫時RNAs(stRNAs)，其為miRNAs大組的一個子集，它們從內源編碼的髮夾前體(70至100核苷酸或更長)加工為單鏈的18至25個核苷酸RNAs，且通過與靶mRNAs的3』-UTRs的鹼基配經翻譯抑制而表現出功能(Lau N C；Lim L P；Weinstein E G；Bartel D P；Science(2001)，294，858-62)。
雖然在植物、線蟲(C.elegans)、果蠅(Drosphila)和哺乳動物中至今已確定了約200種不同的miRNAs，但是只有stRNAs lin-4和let-7已被詳細記錄在線蟲幼蟲發育期間調節翻譯水平上基因表達的計時。在脊椎動物中，許多miRNAs的表達具有重要的發育性或組織特異性模式，但目前只有很少的功能被確定。miRNAs的不斷增多的數目和多樣性(Lim，Lee P.；Glasner，Margaret E.；Yekta，Soraya；Burge，Christopher B.；Bartel，DavidP.Vertebrate microRNA genes.Science 2003，299，1540)認為miRNAs在不同於發育計時的多種途徑中起重要作用。這被如下發現所支持在果蠅中，miRNAs涉及調節細胞死亡和增殖且是正常脂代謝所需的(Xu等，2003；見Current Biol.13，790-795(2003)；Brennecke等，2003(Cell 113，25-36(2003)。此外，miRNAs似乎與人類疾病相關。最近在果蠅中進行的研究已將RNAi/miRNA途徑與蛋白質dFMR1相聯繫，該蛋白質是智力遲鈍的最常見遺傳形式即脆性X染色體症候群中受影響的人蛋白質FMR1的同源物(Caudy，Amy A.；Myers，Mike；Hannon，Gregory J.；Hammond，Scott M.，Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interferencemachinery.GenesDevelopment 2002，16，2491-2496)。此外，已發現定位於染色體13q14上的兩種miRNAs在多數B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)中被缺失或下調(Calin George Adrian等人；PNAS 2002，99，15524-9)。
為了解釋短RNAs在生物學過程中的作用，特別是它們在疾病中的關聯，需要一種檢測短RNAs的工具。該工具應該理論上允許同時分析真核細胞中的多種短RNAs。然而，由於長度短且豐度低，用目前可利用的工具分析此類RNAs很難且耗時。本發明現提供能檢測短RNAs的新的工具，因此對短RNAs的作用和功能的闡明是特別有用的。根據本發明的公開，本領域的技術人員顯而易見的是，然而，該工具的應用不限於短RNAs的檢測和分析，而能應用於一般核酸的檢測或分析。
發明概述首先，本發明提供包含一個表面和多種寡核苷酸的寡核苷酸陣列，其中至少一個寡核苷酸具有至少一個經修飾的糖部分。在一個實施方案中，所述寡核苷酸的糖部分的2』-OH基團被取代。優選地，所述糖部分在2』位上包含F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可為經取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基、烷氧基烷基、C1至C10低級烷基，取代的C1至C10低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基。
在優選實施方案中，所述的糖部分包含2』-MOE、2』-DMAOE、2』-甲氧基或2′-氨基丙氧基。
在另一方面，本發明提供了檢測短RNAs的方法，其包括以下步驟(a)提供生物樣品，其中所述樣品包含短RNAs；(b)將所述樣品與本發明的寡核苷酸陣列接觸；(c)在短的內源RNAs和陣列中的寡核苷酸之間進行雜交反應。
在另一方面，本發明提供關聯生物樣品與生物學狀況的方法，其包括(a)提供生物樣品，其中所述樣品包含短RNAs；(b)將所述樣品與本發明的寡核苷酸陣列接觸，其中所述樣品包含適合於檢測短RNAs的一套預先確定的序列；(c)將獲得的雜交模式與標準雜交模式進行比較。
在另一方面，本發明提供預後或診斷疾病的方法，其包括(a)提供生物樣品，(b)接觸本發明的寡核苷酸陣列，其相應於用於檢測短RNAs的一套確定的序列，(c)獲得雜交模式，(d)將所述雜交模式與標準雜交模式進行比較，其中某種模式的存在或缺乏表明患疾病的可能性或疾病的存在。
附圖簡述

圖1，代表七個RNA樣品與1MM和2MM捕獲探針雜交的強度值對從各自匹配序列獲得的強度歸一化。定義強度為密度(平均)-背景(平均)。用與Cy5標記的RNA雜交的MOE探針提高的錯配分辨是通過將雜交溫度從37℃增加至42℃而獲得的。在相同條件下，具有相同長度的標準DNA探針沒有解釋任何信號強度。
發明詳述這裡引用的所有專利申請、專利和文獻作為整體引入作為參考。
本發明提供具有高靈敏度和選擇性的寡核苷酸微陣列，其特別用於短核酸分子的檢測。至今，短核酸如RNAs的檢測和分析已證明是困難的，因為此類核酸長度短且豐度低。目前可獲得的核苷酸微陣列不是合適的工具，因為它們的靈敏度和/或選擇性對於檢測短RNAs來說太低。相比較而言，本發明提供了特別適用於檢測短寡核苷酸，特別是短RNAs的寡核苷酸微陣列。
如這裡使用的，術語「寡核苷酸」和「寡核糖核苷酸」是可互換使用的，並且指由核糖核苷酸殘基或脫氧核糖核苷酸殘基組成的聚合物。由核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸殘基兩者組成的聚合物也屬於本發明的「寡核苷酸」和「寡核糖核苷酸」的意思範圍內。
術語「寡核苷酸陣列」或「陣列」或「微陣列」在這裡以下可互換使用，指基質，優選固體基質，其帶有至少一個表面，該表面具有附著到剛性表面中不同的已知位置的許多寡核苷酸。寡核苷酸陣列通常具有每cm2至少100個寡核苷酸的密度。在某些實施方案中，該陣列可以具有每cm2約至少500個、至少1000個、至少10000個、至少105個、至少106個、至少107個寡核苷酸的密度。
第一方面，本發明涉及包含表面和許多寡核苷酸的寡核苷酸陣列，其中所述的寡核苷酸陣列包含至少一個具有至少一個經修飾的糖部分的寡核苷酸，其以後稱作經修飾的寡核苷酸。優選地，該寡核糖核苷酸包含至少2個、更優選地至少5個或至少10個經修飾的糖部分。在特定的實施方案中，寡核苷酸的所有糖部分是經修飾的，或者在另一優選的實施方案中，寡核苷酸的幾乎1、2、3或4個糖部分是經修飾的。寡核苷酸陣列通常包含至少10％、更優選地至少25％，至少33％、至少50％、至少66％、至少75％、至少90％或至少95％的包含經修飾的糖部分的寡核苷酸。在特別優選的實施方案中，寡核苷酸陣列包含100％經修飾的寡核苷酸。
本發明的寡核苷酸微陣列包含帶有一個或更多經修飾的糖部分的寡核苷酸。在優選的實施方案中，在糖部分的2』-OH基團上修飾糖部分。多種2』-OH取代是本領域已知的(修飾參見Uhlmann，Eugen.的Recentadvances in the medicinal chemistry of antisense oligonucleotides.CurrentOpinion in Drug DiscoveryDevelopment(2000)，3(2)，203-213和Uhlmann，Eugen；Peyman，Anusch.的Antisense oligonucleotidesa newtherapeutic principle.Chemical Reviews(Washington，DC，United States)(1990)，90(4)，543-84)。在另一優選的實施方案中，糖部分的4』-C沒有被修飾，在一個更優選的實施方案中，寡核苷酸不包含鎖定的核酸(LNA，參見例如(Rajwanshi，Vivek K.等；The eight stereoisomers of LNA(lockednucleic acid)a remarkable family of strong RNA binding molecules.Angewandte Chemie，International Edition(2000)，39(9)，1656-1659)。
根據本發明，優選修飾的糖部分在2』位上包含以下之一F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-芳基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可為取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。其它優選的寡核苷酸在它們的糖部分的2』位上包含一個和多個以下的低級烷基、取代的C1至C10低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基。在另一優選的實施方案中，修飾的糖部分不包含2』-O、4』-C-亞甲基連接。特別優選的是用O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nNR2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和/或O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2取代的糖部分，其中n和m為1至約10。另一優選的修飾包括烷氧基烷氧基基團，特別是2』-甲氧基乙氧基(2』-O-CH2CH2OCH3，也稱作2』-O-(2-甲氧基乙基)或2』-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)。其他優選的修飾包括2』-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基團，也稱作2』-DMAOE，2』-甲氧基(2』-O-CH3)，2』-氨基丙氧基(2』-OCH2CH2CH2NH2)。本領域的技術人員可使用常規方法產生此類修飾的糖結構。教導製備此類修飾的糖結構的代表性美國專利包括，但不局限於美國專利號4,981,957、5,118,800、5,700,920和5,969,116，其每一個都作為整體引入本文作為參考。
給定的化合物中的所有位置都同樣地修飾是不必要的，實際上可以在一種化合物或者甚至在寡核苷酸範圍內的單個核苷中摻入一種以上的前述修飾。本發明也包括嵌合的寡核苷酸。本發明上下文中「嵌合的」寡核苷酸是含有兩個或更多化學上不同區域的寡核苷酸，每一個所述區域由至少一個單體單位組成。此類嵌合寡核苷酸可以例如包含帶有一個或更多如上所述修飾的糖部分的核苷酸區域和脫氧核糖核苷酸區域(Lima，Walt F.；Crooke，Stanley T；Biochemistry(1997)，36(2)，390-398)。本發明的寡核苷酸除了在糖部分2，位上的修飾外，可以還包含其它修飾。例如，該寡核苷酸可具有主鏈中的修飾。多種主鏈修飾是本領域已知的，此類修飾包括例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、亞磷醯胺等(關於修飾參見Uhlmann，Eugen的Recent advances in the medicinal chemistry of antisense oligonucleotides.Current Opinion in Drug DiscoveryDevelopment(2000)，3(2)，203-213和Uhlmann，Eugen；Peyman，Anusch.的Antisense oligonucleotidesa newtherapeutic principle.Chemical Reviews(Washington，DC，United States)(1990)，90(4)，543-84)。
本發明中寡核苷酸陣列的寡核苷酸通常具有約為10至100個核苷酸的長度。優選地長度為約12至50個核苷酸，更優選地15至30個核苷酸。在特別優選的實施方案中，寡核苷酸的長度為18至25個核苷酸。然而寡核苷酸陣列的寡核苷酸不必具有相同的長度，本發明的寡核苷酸陣列通常包含具有相似或相同長度的許多寡核苷酸。
寡核苷酸陣列，也通常稱作「基因晶片」，已在本領域中描述。寡核苷酸陣列通常包含具有至少一個表面的固體基質，寡核苷酸可附著在該表面上。該基質可以由無機材料如玻璃、SiO2、石英、Si形成。備選地，該基質可以由有機材料如聚合物，優選聚碳酸酯(PC)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚醯亞胺(PI)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、聚乙烯對苯二酸酯(PET)或聚氨基甲酸酯(PU)形成。在一個實例中，該基質是由玻璃形成的。表面可由與基質相同或不同的物質組成。也可選擇該基質和其表面以提供合適的光吸收特性。在優選的實施方案中，該基質和/或該表面是光透明的。在另一優選的實施方案中，該基質包含光透明層。該光透明層可由無機材料形成。備選地，它可由有機材料形成。在一個實例中，該光透明層是金屬氧化物，如Ta2O5、TiO2、Nb2O5、ZrO2、ZnO或HfO2。該光透明層是非金屬的。
在特別優選的實施方案中，將寡核苷酸陣列置於WO01/02839中描述的消散波傳感器平臺上。因此，用於樣品分析的傳感器平臺可以例如包含具有折射率(n1)的光透明基質，形成於該基質的一個表面上的薄的光透明層，所述層具有大於(n1)的折射率(n2)，所述平臺在其中結合一個或多個包含周期性凹槽的波紋結構，所述凹槽定義一個或多個敏感區，每一個敏感區用於一個或多個捕獲成分，所述凹槽如此構造、規格和取向以至於a)所述平臺上相干光入射被衍射成單個光束或幹涉的衍射級，導致投射光束減少和入射光的異常高反射，由此在一個或多個傳感區的表面產生增強的消散場；或者b)在所述平臺上的相干且線性偏振入射光被衍射成單個光束或幹涉的衍射級，導致投射光束幾乎完全消失和入射光的異常高反射，由此在一個或多個傳感區的表面產生增強的消散場。
寡核苷酸陣列可通過原位寡核苷酸化學合成而形成。在該方法中，將寡核苷酸直接合成到基質的表面上，使用例如機械合成方法或光指導的合成方法，其可以結合光版印刷方法和固相寡核苷酸合成方法的組合，例如WO90/033382或WO92/10092中描述的，或者如WO98/27430中描述的很大規模的固定化聚合物合成(VLSIPS)。
備選地，天然或合成來源的寡核苷酸可以使用不同技術點樣於晶片上，所述技術例如包括噴墨印表機，其具有壓電傳動裝置、電磁傳動裝置、壓力/電磁閥傳動裝置或其它力傳動裝置，泡沫噴射印表機，其使用熱電傳動裝置、雷射傳動裝置，環針印表機或針點樣工具。(Heller MJ(2002)AnnuRev Biomed Eng；4129-53)。寡核苷酸可以共價地附著於基質的表面。這種共價附著通常需要活化表面和/或用官能團/反應基團修飾核酸分子。該固定也可以通過化學或光化學交聯劑來完成(WO98/27430和WO91/16425)。此類技術對於本領域的技術人員來說是已知的且顯而易見的。反應性或光反應性基團可附著在平臺的表面，其可用作錨定基團用於進一步的反應步驟。備選地，寡核苷酸可通過非共價結合附著在表面，例如通過靜電吸附在帶正電荷的表面薄膜上。在本發明優選的實施方案中，寡核苷酸非共價地附著到表面。可以使用官能化有機分子，其提供烴鏈致使平臺更加疏水，可以使用極性基團致使平臺更加親水，或可以使用離子基團或潛在的離子基團以導入電荷。例如可用聚乙二醇(PEG)或其衍生物致使平臺親水，其防止蛋白質對平臺/表面的非特異吸附。
為獲得可檢測的信號，可以標記樣品的核酸。可使用適於檢測寡核苷酸的任意標記。例如，可使用放射性同位素、化學發光標記、生物發光或量熱標記。在優選的實施方案中使用發光標記。可使用的發光染料包括但不限於鑭系絡合物(Kricka LJ(2002)Stains，labels and detection strategiesfor nucleic acids assays.Ann Clin Biochem；39(Pt 2)114-29)，並且可以化學或物理地結合寡核苷酸。在更優選的實施方案中，標記物是螢光標記。許多合適的螢光團是已知的，如螢光素、麗絲胺、藻紅蛋白、羅丹明、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX。將明白可使用具有不同光譜的不同螢光團以區分不同的探針。備選地，可用合適的標記物，如上述標記物標記寡核苷酸陣列的寡核苷酸。
樣品的核酸(「探針」)和寡核苷酸陣列的合適寡核苷酸將雜交，即在合適的條件下將發生互補序列的非共價結合。優選地，序列優選是互補的，但是根據雜交條件，具有1、2、3、4或5個錯配的序列還是可以雜交。合適的雜交條件是本領域已知的或可以憑經驗決定的。公知的影響反應特異性和動力學的參數包括鹽條件、溶劑的離子組成、雜交溫度、寡核苷酸配對序列的長度、鳥嘌呤和胞嘧啶(GC)含量、雜交促進劑的存在、pH、配對序列中發現的特定鹼基、溶劑條件和有機溶劑的添加。例如，對於高嚴緊條件，為了使僅有少數或沒有錯配的核酸雜交，鹽條件通常較低。普通高嚴緊條件可使用小於約1摩爾的鹽濃度，更常用小於約750毫摩爾，通常小於約500毫摩爾，可以低至約250或150或15毫摩爾。使用的典型的鹽是氯化鈉(NaCl)；然而，可以使用其它離子鹽，例如KCl，或四烷基銨鹽。對於較低嚴緊條件，根據所希望的嚴緊度雜交，鹽濃度可以小於約3毫摩爾，優選小於2.5毫摩爾，小於2毫摩爾，或更優選小於約1.5毫摩爾。雜交動力學和雜交嚴緊度也依賴於進行雜交的溫度。對於低度嚴緊雜交的溫度通常為較低的溫度，例如從約15℃或20℃至約25℃或30℃的溫度。需要高度嚴緊雜交時，進行雜交的溫度通常很高。例如，可使用至少37℃，至少42℃，至少48℃，或至少56℃的溫度。對於剝離，即破壞互補序列的結合，可使用高溫，例如80℃或更高。雜交反應後也可以進行洗滌步驟，其中沒有結合寡核苷酸的核酸被洗去。然而，例如當檢測消散場誘導的發光時，該步驟也可以省略(WO01/02839)。
在本發明優選的實施方案中，優化雜交條件用於經修飾的寡核苷酸特別是MOE修飾的寡核苷酸與短RNAs的雜交。此類最優可由經驗決定且不會本領域的技術人員造成困難。例如溫度可從約30℃至60℃，從約37℃至60℃或從約42℃至56℃。
用於確定發生雜交的位置的檢測方法將取決於所選擇的標記。可通過合適的雷射源誘導發光。適合的發光檢測器包括例如CCD照相機、光電倍增管、雪崩光電二極體、混合光電倍增管。當使用螢光標記的探針時，優選通過共聚焦雷射顯微術檢測。記錄信號且在優選的實施方案中，通過計算機分析，例如通過使用12位的模擬-數字轉換板分析信號。
第二方面，本發明提供了檢測短RNAs的方法。如本文所用的，術語「短RNAs」是指約15至約30個核苷酸的短RNAs，優選約18至約25個核苷酸的短RNAs。該短RNAs包括但不限於miRNAs、stRNAs、siRNAs或短的髮夾RNAs(shRNAs)，或所有上面的前體。該RNAs可在細胞中內源形成的，但也可以是轉染進細胞的RNAs，例如siRNAs。本發明的發明人現已發現，根據本發明，短RNAs和特別是短的內源RNAs可通過本發明的寡核苷酸陣列來檢測，該檢測具有比現有已知方法和工具高得多的靈敏度和特異性。
在一個實施方案中，本發明提供檢測短RNAs的方法，其包括將生物樣品與本發明的寡核苷酸陣列接觸。生物樣品可源自細胞、組織、器官、體液，例如血清、血漿、精液、尿、滑液和腦脊液。可選擇具有特定特徵的細胞或組織，例如可選擇癌性細胞或組織或者不同發展階段或病理條件下的細胞或組織。在優選的實施方案中，生物樣品源自哺乳動物，更優選嚙齒類，例如小鼠或大鼠，或最優選人類。生物樣品的核酸可通過純化步驟例如酚/氯仿萃取、乙醇沉澱或凝膠純化來富集。在優選的實施方案中，富集樣品中短RNAs，例如這可以通過凝膠純化或大小分級分離來實現。可使用的樣品是未稀釋的或加入溶劑稀釋。合適的溶劑包括水、水性緩衝液或有機溶劑。合適的有機溶劑包括醇、酮、酯、脂族烴、醛、乙腈或腈。
用於檢測短RNAs的適宜的方法包含以下步驟(a)提供生物樣品，其中所述樣品包含短的內源RNAs；(b)將所述樣品與本發明的寡核苷酸陣列相接觸；(c)在短的內源RNAs和陣列中的寡核苷酸之間進行雜交反應，和任選地；(d)檢測樣品的短RNA和陣列的寡核苷酸之間的雜交。在優選的實施方案中，生物樣品的短RNAs被標記，優選用螢光染料標記。
在另一實施方案中，本發明的方法用於短RNAs的序型分析。例如，相應於用於檢測短RNAs的一套確定的序列的寡核苷酸陣列可以與正常細胞或組織樣品和患病細胞或組織接觸。在陣列上雜交的寡核苷酸的模式將指示組織樣品中存在短RNA的缺乏。因此可以比較正常和患病細胞或組織中存在的短RNAs的模式，由此能將樣品與疾病狀態相關聯。因而，本發明提供了將生物樣品或特定短RNA的表達水平與健康狀態相關聯的方法，其包括(a)提供生物樣品，其中所述樣品包含短RNAs；(b)將所述樣品與本發明的寡核苷酸陣列接觸，其中所述樣品包含適合於檢測短RNAs的一套預定序列；(c)將獲得的雜交模式與標準雜交模式做比較。標準模式例如可獲自源於患病細胞或組織的樣品。因而相似的模式可表明細胞或組織樣品具有某種疾病狀態。在優選的實施方案中，細胞或組織被病原體感染，例如被人免疫缺陷病毒(HIV)感染、流感感染、瘧疾、肝炎、瘧原蟲、巨細胞病毒、單純皰疹病毒或口蹄疫病毒感染。在優選的實施方案中，細胞或組織被病毒或細菌病原體感染。在另一優選的實施方案中，疾病是癌症(例如參見McManus，Michael T.的MicroRNAs and cancer.Seminarsin Cancer Biology(2003)，13(4)，253-258)，在更優選的實施方案中是實體瘤或血液惡性腫瘤。在更優選的實施方案中，疾病是神經變性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默氏病或多發性硬化。在特別優選的實施方案中，疾病是脆性X相關的智力遲緩(例如參見Caudy AA等(2002)Genes Dev；162491-6和Dostie，Josee等RNA(2003)，9(2)，180-186)。
在另一優選的實施方案中，寡核苷酸陣列對於檢測生物的給定器官、組織或細胞的小RNAs是全面的，即該陣列包含針對特定生物中或者所述生物的器官、組織或細胞中形成的小RNAs的大部分或全部的寡核苷酸。在該上下文中的大部分是指至少60％，優選至少80％，更優選至少90％或最優選至少95％的小RNAs。該陣列也可包含細胞的特定階段或條件的標記物的全面的一套預定序列，例如特定腫瘤或特定類型細胞的已知的標記物或標記物組合。在另一優選的實施方案中，寡核苷酸陣列適合於檢測給定生物的或所述生物的器官、組織或細胞的小RNAs的特定子集，優選siRNA，更優選miRNAs或stRNAs。
如本領域的技術人員顯而易見的，上述方法可用於製作任何生物學狀況分布圖，其在細胞或組織中短RNAs特別是miRNAs的數量和/或組成上不同。例如，生物樣品可與不同的應激條件相關，例如與低氧或機械應力相關，通過該方法使用合適的生物樣品和合適的標準模式，可將使用生物樣品獲得的模式進行比較。備選地，生物樣品可與發育的不同階段相關聯。
本發明的另一實施方案提供了探究分化期間短RNA，特別是miRNA動力學的方法。例如，具有用於檢測短RNAs且特別是miRNA的一套確定序列的寡核苷酸陣列可與源自例如胚胎幹細胞的生物樣品接觸，所述幹細胞經歷分化形成不同譜系，如體外造血細胞的分化、成肌細胞的分化或PC12細胞分化成神經元。
本發明的另一方面提供了預後或診斷疾病，特別是人類疾病的方法。此類方法包括(a)提供生物樣品，其可分離自目的組織或器官或體液，並且可以任選地進行預先處理，(b)將對應於用於檢測短RNAs特別是miRNAs的一套確定序列的寡核苷酸陣列與所述樣品接觸，(c)獲得雜交模式，(d)將所述雜交模式與標準雜交模式比較，其中某種模式的存在或不存在表明患疾病的可能性或存在疾病。
例如，可通過某些短RNAs的組合指出癌性狀況。當此類短RNAs與具有合適的寡核苷酸的寡核苷酸陣列雜交時，這種組合將引起特定的模式。因此，這種寡核苷酸陣列與生物樣品的某種雜交模式的存在或缺乏將指出癌性狀況的存在或缺乏。該模式也可與獲自健康細胞、組織或器官等的標準模式進行比較，獲自生物樣品的模式相對於標準模式的差異將指示分析的生物樣品中的異常或疾病狀態。
僅僅為了舉例說明，以下的實施例中進一步描述了本發明。在本發明公開的內容和實施例中參考但沒有明確描述的分子遺傳學、蛋白質和肽生物化學和免疫學的方法在科學文獻中報導，且對於本領域的技術人員來說是熟知的。
實施例材料和方法MOE寡核苷酸的設計和合成為Lagos-Quintana M等；Science 2001，294，853-8，Lagos-Quintana M.等；Current Biology，2002，12，735-9，Lagos-Quintana M.；RNA 2003，9，175-9，Mourelatos Zissimos等；Genes And Development 2002，16，720-8鑑定的31種人miRNAs設計MOE捕獲探針。這些miRNAs的長度從20至24個核苷酸不等。這些miRNAs的豐度根據克隆各自miRNAs的頻率不同。由於用於鑑定miRNAs的克隆和測序方法不能經常準確地確定miRNA的5』和3』末端，將MOE捕獲探針設計成與對應於miRNA中心部分的19個核苷酸互補。對於20個核苷酸長的miRNAs，捕獲探針與miRNA的19個5』端核苷酸互補，對於21個核苷酸長和更長的miRNAs，捕獲探針與miRNA的核苷酸2-20互補。保持相同(19個核苷酸)長度的捕獲探針將各自探針-miRNA雙鏈體的解鏈溫度的差別減少到最小。
根據以下置換規則A→C；C→A；T→G；G→T，設計1bp和2bp的錯配對照寡核苷酸。使用保證所有miRNA種類間最大特異性的算法來導入錯配(J.Lange，LSI)。使用標準的亞磷醯胺化學法在ABI394或Expedite/Moss合成儀(Applied Biosystems)來製備本發明描述的合成的DNA和2』-MOE修飾的寡核苷酸。將亞磷醯胺溶解在0.05M濃度的乙腈中。通過乙腈中三氟甲磺酸苯並咪唑的0.2M溶液活化亞磷醯胺進行偶聯。偶聯時間通常包含3至6分鐘。使用標準的封端試劑產生首次封端。通過過氧化氫叔丁基在二氯甲烷中的0.5M溶液進行氧化兩分鐘。在氧化或硫化之後進行第二次封端。通過二氯己烷中的2％三氯乙酸將寡核苷酸生長鏈脫三苯甲基用於下一次偶聯。完成序列後，將支持體結合的化合物剪切，且通過32％氨水在80℃下脫保護形成「Trityl-on」。
將獲得的粗溶液直接通過RP-HPLC純化。通過電噴射質譜法(Electrospray Mass spectrometry)和毛細管凝膠電泳(Capillary GelElectrophoresis)分析純化的脫三苯甲基的化合物，且通過紫外線根據它們在260nM下的消光係數進行定量。
與miRNA序列互補(完美匹配＝PM)的MOE-寡核苷酸和對應於1(1MM)和2個鹼基對(2MM)錯配對照示於表1中。
表1
n(g，a，t)＝2』-O-(2-甲氧基乙基)-核糖核苷，c＝2』-O-(2-甲氧基乙基)-5-甲基胞嘧啶。3』-末端的大寫字母表示N(A，G，C，T)2』-脫氧核苷酸(nts)。由於實際的原因，所有序列都使用DNA支持物合成，導致在3』-末端位置具有一個2』-脫氧核苷酸的MOE寡核苷酸。
寡核苷酸微陣列的印刷和雜交基本上根據所述的製備、印刷和雜交NovaChips(D，Budach W，WankeC，Chibout SD (2003) EVanescent resonator chipsa universal platformwith superior sensitivity for fluorescence-based microarrays.BiosensBioelectron；18489-97)。雜交混合物含有3微克標記的microRNA(Budach，Wolfgang；Neuschaefer，Dieter；Wanke，Christoph；Chibout，Salah-Dine.Generation of transducers for fluorescence-based microarrays withenhanced sensitivity and their application for gene expression profiling.Analytical Chemistry(2003)，75(11)，2571-2577)。
從人HeLa和小鼠P19細胞製備miRNA在37℃下將HeLa細胞生長在添加了10％FCS和2mM L-穀氨醯胺的Dulbecco’s改良的Eagle’s培養基中。用PBS清洗約1.5×107個細胞，並根據製造商說明書，每10cm2表面用1ml Trizol(Life-TechnologiesTM)提取RNA。每500μl用20U DNA酶I在37℃下消化水相中存在的DNA 1小時。接著進行苯酚/氯仿萃取，乙醇沉澱全部RNA，在無RNA酶的水中重懸浮，按照製造商的RNA清除方案，將100μg RNA應用於RNeasy小旋轉柱(Qiagen)。用乙醇沉澱包含在流動液中的小於～200nts的RNAs種類，將其在變性凝膠上樣緩衝液(70％甲醯胺，30mM EDTA，0.05％二甲苯腈藍，0.05％溴酚藍)中重懸浮，並在在TBE緩衝液中電泳的含8M脲-12.5％聚丙烯醯胺凝膠上分離。在紫外線光投影下從凝膠中切除大小範圍在15至30nts的RNAs，將其在4℃下用含有500mM醋酸銨、1mMEDTA和20％苯酚/氯仿的溶液洗脫16小時，乙醇沉澱並在無RNA酶的水中重懸浮。通過在260nm下測量光密度來估計回收的RNA的量。備選地，將RNA樣品應用於RNeasy小旋轉柱(Qiagen)且在省略了PAGE純化步驟的晶片實驗中使用。
合成的對照miRNA寡核苷酸和從HeLa和P19細胞分級分離的大小選擇的miRNAs的螢光標記互補於8種不同的miRNA序列的19-mer RNA寡核苷酸購自Xeragon。對於RNAs的標記，通過加入1μl新製備的100mM高碘酸鈉水溶液，之後在黑暗中室溫下孵育1小時，將9μl水中的9μg RNA氧化成二醛。通過加入1μl 200mM的亞硫酸鈉並在室溫下孵育20分鐘來除去多餘的氧化劑。在加入12μl 50mM pH 4的醋酸鈉緩衝液之後，將5μl 20mM pH7.2的乙二胺氫氯化物溶液加入到氧化的RNA中。將反應混合物在37℃下孵育1小時，通過用2μl新製備的乙腈中的200mM氰基硼氫化鈉還原來穩定RNA和間隔臂之間的醛亞胺鍵。在室溫下孵育30分鐘且在0℃下用2倍體積的丙酮中的2％高氯酸鋰沉澱1小時。將樣品在14000轉/分鐘下旋轉45分鐘(3-4℃)，在除去上清液之後，用丙酮清洗RNA沉澱並空氣乾燥。通過在5μl DEPC處理的水中重懸浮氨基修飾的RNA，並加入1M磷酸鈉緩衝液(pH 7.8)中的5μl 30mM Cy5 N-羥基琥珀醯亞胺基活性酯進行偶聯。在黑暗中室溫孵育1小時之後，在-20℃下用2.5倍體積100％冰預冷的乙醇沉澱RNA 1小時。將樣品在14000轉/分鐘下旋轉30分鐘(3-4℃)，在除去上清液之後，用冰預冷的70％乙醇水溶液清洗Cy5-RNA沉澱並空氣乾燥。通過毛細管凝膠電泳分析標記的RNA的質量和數量，且通過紫外線根據在260nm下的消光係數定量RNA。
表2中包含Cy5-標記的RNA序列。
表2用於與固定的互補「捕獲」寡核苷酸雜交的3』-Cy5標記的合成miRNA等價物的序列。鹼基配對的核苷酸用粗體高亮顯示。
結果使用含有一組點樣的MOE和DNA寡核苷酸以及它們對應的1和2核苷酸錯配對照的晶片來檢查寡核苷酸捕獲探針的親和性和特異性。互補於在晶片上代表的八種不同miRNA序列的RNA寡核苷酸用Cy5標記(表2)，並在不同的條件下與該晶片雜交。
對於所有DNA寡核苷酸微陣列的共同問題是關於平臺的靈敏度和特異性方面需要足夠的折衷。
如圖1所闡明的，用MOE修飾的1和2核苷酸錯配寡核苷酸獲得的螢光強度相對於完美匹配的雙鏈體顯示了顯著的強度增加。增加雜交溫度將進一步提高分辨力。相反，相應的標準DNA捕獲探針在所選擇的雜交嚴緊條件下不能形成穩定的雙鏈體，導致所有的DNA捕獲探針都沒有顯著的強度值。
在8種情況中的5種中，通過將雜交溫度從37℃提高至42℃，使用MOE探針的錯配分辨可以顯著提高(圖1)，且沒有損害它們的捕獲靈敏度。在寡核苷酸mir-99和mir-100的情況中，觀察到了顯著程度的交叉反應性，所述寡核苷酸代表僅有一個核苷酸不同的miRNAs。
來自人和小鼠細胞提取物的miRNAs與MOE NovaChips的雜交在下一步中，從HeLa/P19小鼠細胞中提取大小經選擇的miRNAs，將其用Cy5標記並用探針與具有高靈敏性的晶片在30℃至56℃的溫度範圍下雜交(NovachipGeneration of transducers for fluorescence-basedmicroarrays with enhanced sensitivity and their application for geneexpression profiling.Budach，Wolfgang；Neuschaefer，Dieter；Wanke，Christoph；Chibout，Salah-Dine.Novartis Pharma AG Switzerland，Basel，Switz.Analytical/Chemistry(2003)，75(11)，2571-2577)。表3中顯示了對於晶片上31種不同標記的具有互補的MOE捕獲探針的miRNAs和1nt MM和2 nt MM對照測量的螢光強度。即使在30℃和37℃下已能觀察到一些miRNAs的特異雜交(根據用野生型和1MM和2MM MOE探針獲得的信號的比較)，在NovaChip上存在的錯配和完全互補序列之間的分辨在42℃或更高溫度下更好。在48℃和56℃下進行雜交允許幾乎所有miRNAs的特異性檢測，在較高溫度下伴隨著強度的減少。在56℃下，在很少的情況中沒有記錄到信號。通過在三種不同的溫度(42、48和56℃)下進行雜交，對於幾乎所有測試的miRNAs都可能記錄特異的信號。實際上，在任何測試溫度下，僅有六種miRNAs的信號似乎不存在或者是非特異性的。這可能是由於細胞分離物中特定miRNA的缺乏，或者是由於用於雜交的RNA樣品中存在交叉雜交的無關RNA。如通過一種情況例證的，如果單個錯配不允許miRNA的特定檢測，則兩個錯配允許更好的分辨。最後，在42℃下兩個各自進行的雜交的強度值(數據未顯示)顯示了相當的強度值，表明高水平的可再現性。
表3將Cy5標記的HeLa miRNA在不同溫度(T)下在所述條件下於晶片上雜交。對於晶片上的大多數探針，48℃(用粗體標記)的雜交溫度似乎是信號強度和特異性之間的最佳折衷。
權利要求
1.包含表面和許多寡核苷酸的寡核苷酸陣列，其中至少一個寡核苷酸具有至少一個經修飾的糖部分。
2.根據權利要求1的寡核苷酸陣列，其中所述糖部分的2』-OH基團被取代。
3.根據權利要求2的寡核苷酸陣列，其中所述糖部分在2』-位包含F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以為經取代或未經取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基、烷氧基烷基、C1至C10低級烷基，經取代的C1至C10低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基。
4.根據前面權利要求任一項的寡核苷酸陣列，其中糖部分包含2』-MOE、2』-DMAOE、2』-甲氧基或2′-氨基丙氧基。
5.根據前面權利要求任一項的寡核苷酸陣列，其中所述寡核苷酸具有約15至50個核苷酸的長度。
6.根據前面權利要求任一項的寡核苷酸陣列，其中所述寡核苷酸包含至少10個經修飾的糖部分。
7.根據前面權利要求任一項的寡核苷酸陣列，其中所述寡核苷酸陣列包含至少50％的具有經修飾的糖部分的寡核苷酸。
8.根據前面權利要求任一項的寡核苷酸陣列，其中所述寡核苷酸陣列包含與短的哺乳動物RNAs特異雜交的寡核苷酸。
9.權利要求8的寡核苷酸陣列，其中所述寡核苷酸與短的人RNAs特異雜交。
10.根據前面權利要求任一項的寡核苷酸陣列，其中所述寡核苷酸陣列對於檢測生物的給定器官、組織或細胞的小RNAs是全面的。
11.根據前面權利要求任一項的寡核苷酸陣列，其中所述寡核苷酸非共價附著到所述表面。
12.根據前面權利要求任一項的寡核苷酸陣列，其中所述寡核苷酸陣列包含具有一個或更多脫氧核糖核苷酸的寡核苷酸。
13.根據前面權利要求任一項的寡核苷酸陣列，其中該寡核苷酸陣列可在消散波傳感器平臺上使用。
14.檢測短RNAs的方法，其包括步驟(a)提供生物樣品，其中所述樣品包含短RNAs；(b)將所述樣品與根據權利要求1至13任一項的寡核苷酸陣列接觸；(c)在短的內源RNAs和陣列中的所述寡核苷酸之間進行雜交反應。
15.關聯生物樣品與生物學狀況的方法，其包括(a)提供生物樣品，其中所述樣品包含短RNAs；(b)將所述樣品與根據權利要求1至13任一項的寡核苷酸陣列接觸，其中所述陣列包含適於檢測短RNAs的一套預先確定的序列；(c)將獲得的雜交模式與標準雜交模式進行比較。
16.根據權利要求14或15的方法，其中所述的短RNAs是micro RNAs(miRNAs)。
17.根據權利要求15或16的方法，其中所述生物樣品與健康狀態相關。
18.預後或診斷疾病的方法，其包括(a)提供生物樣品，(b)接觸相應於用於檢測短RNAs的一套確定的序列的根據權利要求1至13任一項的寡核苷酸陣列，(c)獲得雜交模式，(d)將所述雜交模式與標準雜交模式進行比較，其中某種模式的存在或不存在表明可能患疾病或者存在疾病。
19.根據權利要求18的方法，其中所述生物樣品來源於人。
20.根據權利要求18或19的方法，其中所述疾病是癌症、神經變性疾病或傳染病。
全文摘要
本發明涉及包含短的經化學修飾的RNA寡核苷酸的寡核苷酸微陣列和此類微陣列在基因組學應用中的用途。更特別地，本發明提供了包含表面和許多寡核苷酸的寡核苷酸微陣列，其中至少一個寡核苷酸在2』－OH位上具有至少一個經修飾的糖部分。本發明的微陣列更特別地用於檢測小RNAs。
文檔編號C12Q1/68GK1867680SQ200480030055
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月13日 優先權日2003年10月14日
發明者J·魏勒, J·哈爾, C·旺克, J·B·蘭格, W·菲利波維奇, F·科爾布 申請人:諾瓦提斯公司, 諾瓦提斯研究基金會弗裡德裡克·米謝爾生物醫學研究所