生產分泌性三聚受體類似物和生物活性融合蛋白的方法與組合物的製作方法

2023-06-30 02:57:01 2

專利名稱：生產分泌性三聚受體類似物和生物活性融合蛋白的方法與組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質表達的方法，更具體來說涉及產生和表達例如三聚可溶性受體的 分泌性和生物活性的三聚蛋白的方法。
背景技術：
在例如人的多細胞生物體中，細胞通過所謂的信號轉導途徑彼此通訊，其中分泌性 配體(例如細胞因子、生長因子或激素)結合其細胞表面受體，導致受體激活。受體是 膜蛋白，其由負責配體結合的胞外域、中心跨膜區和負責向下遊發送信號的胞質域組成。 取決於分泌信號的來源和表達受體的靶細胞的位置，信號轉導可以以下三種方式發生 旁分泌(鄰近細胞間通訊)、自分泌(細胞自身通訊)和內分泌(遠端細胞之間通過循 環進行通訊)。受體激活(其在細胞膜下面引起包括基因表達激活在內的事件級聯)的 一種一般機制是，多肽配體(例如細胞因子)以寡聚形式存在，例如同型二聚體(homo-dimmer)或三聚體，其當在細胞外表面結合至其單體受體時導致受體的寡聚化。 信號轉導途徑在正常細胞發育和分化以及響應例如細菌和病毒感染的外部損害中起重 要作用。在此信號轉導途徑中，激活不足(例如缺乏配體)或過度激活(例如配體過多) 形式的異常是例如關節炎、癌症、AIDS和糖尿病的病理病狀和疾病的根本原因。治療這些虛弱疾病的當前策略之一涉及使用誘殺受體如僅由胞外配體結合結構域 組成的可溶性受體來攔截配體，從而克服受體的過度激活。此策略的最佳實例是由Immunex (其現在是Amgen —部分)產生的Enbrel---種二聚可溶性TNF-a受體免疫球蛋白(IgG)融合蛋白(Mohler等人，1993; Jacobs等人，1997)。細胞因子的TNF 家族是身體為響應感染或組織損傷而產生的一種主要促炎信號。然而，已經證明這些細 胞因子的異常產生(例如在不存在感染或組織損傷下)是諸如關節炎和牛皮癬的疾病的 根本原因。TNF-cc受體在結合至其配體TNF-a之前在細胞表面上天然以單體形式存在， 相反，TNF-a以同型三聚體(homotrimer)的形式存在(Locksley等人，2001 )。因此，將可 溶性TNF-a受體與能夠通過二硫鍵自發二聚化(Sledziewski等人，1992和1998)的免疫 球蛋白Gl的Fc區融合，使得可以分泌二聚可溶性TNF-a受體(Mohler等人，1993; Jacobs 等人，1997)。與單體可溶性受體相比，二聚TNF-a受體II-Fc融合體對同型三聚配體具 有極為增大的親和力。這為其在治療類風溼性關節炎(RA)中的臨床使用提供了分子基 礎，所述類風溼性關節炎是其中組成性提高的TNF-ot (—種主要促炎細胞因子)起到重 要致病作用的自身免疫疾病。儘管已證明Enbrel對TNF-a具有pM範圍(ng/mL)內的 Ki (Mohler等人，1993)，但是RA患者需要進行每周兩次25 mg (其可變為用pg/mL 水平的可溶性受體的形式表示)皮下注射，以達到臨床效果(www.enbrel.com)。每個 RA患者高水平反覆消費Enbrel已經對藥物供應造成極大壓力以及高額費用，這僅在本 國(注指美國)就限制數百萬潛在患者得到所述藥物。除TNF-a家族的有效促炎細胞因子之外，引起AIDS的HIV病毒也使用同型三聚外 被蛋白gpl20以進入我們身體內的CD-4陽性T輔助細胞(Kwong等人，1998)。 HIV感 染期間的一個最早期事件涉及gpl20結合其在T輔助細胞的細胞表面獨特表達的受體 CD-4 (Clapham等人，2001)。十多年前已證明單體可溶性CD-4是抗HIV感染的有效藥 劑(Clapham等人，1989)，然而，當證實其功效僅限於實驗室HIV分離物時(Daar等人, 1990)，人們的興奮黯然破滅。事實證明來自AIDS患者的HIV株與實驗室分離物不同， 其對單體可溶性CD-4具有極低的親和力，可能是因為gpl20上的序列變異(Daar等人, 1990)。儘管已經製成二聚可溶性CD-4-Fc融合蛋白，但是由於對gpl20的低親和力， 這些誘殺性CD-4 HIV受體無論是在實驗室還是在臨床上對來自AIDS患者的天然HIV 均表現出極弱的抗病毒作用(Daar等人，1990)。顯然，極其需要能夠產生分泌性同型三聚可溶性受體或生物活性蛋白，其可具有對 其天然同型三聚配體(例如TNF家族的細胞因子和HIV外被蛋白)的完美對接(dock) 結合位點，因而具有更高的親和力。理論上這種三聚誘殺受體對其三聚配體具有的親和 力應比其二聚對應物更高。這種合理設計的可溶性三聚受體類似物可顯著提高臨床效果 以及降低各患者的藥物注射量或頻率。為了在治療上切實可行，和免疫球蛋白Fc—樣， 所需的三聚蛋白部分理想地應為在體內含量豐富並能夠有效發生自身三聚化的天然分 泌蛋白的一部分。膠原是作為胞外基質的主要組分的纖維狀蛋白質的一個家族。其為哺乳動物中含量最豐富的蛋白質，構成將近25%的體內總蛋白質。膠原在骨、腱、皮膚、角膜、軟骨、血管和牙齒的形成中起著主要的結構作用(Stryer, 1988)。原纖型膠原I、 II、 III、 IV、V和XI均被合成為稱作前膠原的較大的三聚前體，其中由幾百個"G-X-Y"重複(或稱甘氨酸重複)組成的中央連續三股螺旋結構域的側翼為非膠原結構域(NC)、 N-前肽和C-前肽(Stryer, 1988)。 C-末端和N-末端突出物均在前膠原分泌時被蛋白酶解加工，這是引發成熟蛋白質組裝為形成不溶性細胞基質的膠原原纖維的事件(Prockop等人, 1998)。發現I型膠原的脫落三聚C-前肽在正常人的血液中濃度在100-600 ng/mL的範圍， 兒童具有較高水平，表明骨形成活躍。I型、IV型、V型和XI型膠原主要組裝為由兩條a-1鏈與一條a-2鏈(對於I型、 IV型、V型來說)或者在序列上高度同型的三條不同鏈(對於XI型來說)組成的異型 三聚形式。II型和III型膠原均為a-l鏈的同型三聚體。對於作為含量最豐富的膠原形式 的I型膠原來說，也形成穩定的a-l (I)同型三聚體，並且在不同組織中以不同水平存 在(Alvares等人，1999)。當這些膠原C-前肽鏈在細胞內單獨過量表達時，大部分可以 自組裝為同型三聚體。儘管首先合成N-前肽結構域，但是分子組裝為三聚膠原始於C-前肽的定位締合(in-register associatkm)。據認為，C-前肽複合體通過形成鏈間二硫鍵 得以穩定，但是為恰當鏈定位(registration)而形成二硫鍵的必要性不明。甘氨酸的三 股螺旋重複出現，然後以拉鏈似的方式從發生締合的C-末端傳至N-末端。這一認識導 致通過利用重組DNA技術交換不同膠原鏈的C-前肽而製造出非天然類型的膠原基質 (Bulleid等人，2001)。例如細胞因子和生長因子的非膠原蛋白質也已被融合到前膠原或 成熟膠原的N-末端，使得可以形成新的膠原基質，這旨在使非膠原蛋白質從細胞基質緩 慢釋放(Tomita等人，2001)。然而，在此兩種情況下，均需要C-前肽在重組膠原原纖維 組裝為不溶性細胞基質之前被切割。發明概述本文所公開的發明使得可將任何可溶性受體或生物活性多肽製備成三聚形式的分 泌性蛋白質。本發明的實質在於使用重組DNA技術將任何可溶性受體和生物活性蛋白 質同框融合到能夠自身三聚化的原纖維型膠原的C-前肽域。當在真核細胞中表達時所產 生的融合蛋白分泌為基本上全部為三聚形式的可溶性蛋白質，所述三聚形式由在三條 C-前肽間所形成的分子內二硫鍵共價加強。本發明的一個方面公開生產分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟 (a)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的DNA構建物，所述開 放讀碼框由框內連接到待三聚化的非膠原多肽的信號肽序列組成，而所述信號肽序列又 框內連接至能夠自身三聚化的膠原的C-末端部分；(b)在生理條件下在適當的生長培養 基中生長宿主細胞，使得可以分泌由所述DNA序列編碼的三聚融合蛋白；和(c)從宿 主細胞分離分泌性三聚融合蛋白。在一個實施方案中，信號肽序列是待三聚化的蛋白質的天然序列。在另一個實施方
案中，信號肽序列來源於與待三聚化分泌性蛋白質不同的分泌性蛋白質。在一個實施方 案中，待三聚化的非膠原多肽是由配體結合結構域所組成的可溶性受體。在一個實施方 案中，膠原的C-末端部分是無任何膠原三股螺旋區的C-前肽(序列ID: 3-4)。在另一 個實施方案中，C-末端膠原由膠原三股螺旋區的一部分組成，所述部分作為與待三聚化 的非膠原蛋白質的接頭(序列ID: 1-2)。在另一個實施方案中，膠原的C-末端部分具 有突變的或缺失的BMP-1蛋白酶識別位點(序列ID: 3-4)。本發明的一個方面公開生產分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(a)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的DNA構建物，所述開 放讀碼框由框內連接到待三聚化的非膠原多肽的信號肽序列組成，而所述信號肽序列又 框內連接可以自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自pro.ct.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)禾口 pro.a.3(XI); (b)在生理條件下在適當的生長培養基中生長宿主細胞，使得可以分泌由 所述DNA序列編碼的三聚融合蛋白；和(c)從宿主細胞分離分泌性三聚融合蛋白。在一個優選實施方案中，待三聚化的非膠原多肽是可溶性TNF-RII(p75)(序列ID: 9-12)。在另一個優選實施方案中，待三聚化的非膠原多肽是可溶性CD-4，其為HIV的 共受體(序列ID: 13-16)。在另一個優選實施方案中，待三聚化的非膠原多肽是分泌性 胎盤鹼性磷酸酶(序列ID: 5-8)。本發明的一個方面公開生產分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(a) 向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的第一 DNA構建物，所述開 放讀碼框由框內連接到到待三聚化的非膠原多肽的信號肽序列組成，而所述信號肽序列 又框內連接可以自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和 pro.a.3(XI); (b)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的第二 DNA 構建物，所述開放讀碼框由框內連接到待三聚化的第二非膠原多肽的第二信號肽序列組 成，而所述信號肽序列又框內連接可以自身三聚化的第二膠原C-末端部分，所述第二 C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (c)在生理條件下在適當的生長培養基中生長宿 主細胞，使得可以分泌由所述第一與第二DNA序列編碼的三聚融合蛋白；和(d)從宿 主細胞分離分泌性三聚融合蛋白。本發明的一個方面公開生產分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟 (a)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的第一DNA構建物，所 述開放讀碼框由框內連接到待三聚化的非膠原多肽的信號肽序列組成，而所述信號肽序 列又框內連接可以自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和 pro.a.3(XI); (b)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的第二 DNA 構建物，所述開放讀碼框由框內連接到待三聚化的第二非膠原多肽的第二信號肽序列組 成，而所述信號肽序列又框內連接可以自身三聚化的第二膠原C-末端部分，所述第二膠 原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (c)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框 轉錄的啟動子的第三DNA構建物，所述開放讀碼框由框內連接到待三聚化的第三非膠 原多肽的第三信號肽序列組成，而所述信號肽序列又框內連接可以自身三聚化的第三膠 原C-末端部分，所述第三膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 p腦.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (d)在生理 條件下在適當的生長培養基中生長宿主細胞，使得可以分泌由所述第一與第二 DNA序 列編碼的三聚融合蛋白；和(e)從宿主細胞分離分泌性三聚融合蛋白。以下為本發明的優點(1)膠原是哺乳動物體內所分泌的最豐富的蛋白質，組成將近25%的體內總蛋白質；(2)膠原的主要形式天然以三聚螺旋出現，其球狀C-前肽負責引發三聚化；(3)據發現，經蛋白酶解從成熟膠原釋放的膠原的三聚C-前肽在哺乳動 物血液中天然為亞微克/毫升水平，並且未知對身體有毒性；(4)膠原的線性三股螺旋區 可作為具有預測的每殘基2.9 A間距的接頭而被包括，或者被排除作為融合蛋白的一部 分，從而可以精確調節待三聚化蛋白質與膠原C-前肽間的距離，以實現最佳生物活性；(5)可使將C-前肽從前膠原上切割下來的BMP1的識別位點突變或缺失，以防止三聚 融合蛋白被破壞；(6) C-前肽結構域提供通用親和標記物，其可以用於純化本發明所制 造的任何分泌性融合蛋白。與可以製造分泌性二聚融合蛋白的Fc標籤技術(Sledziewski等人，1992和1998) 相反，本文所公開的適時的本發明首次使製造和分泌可溶性三聚融合蛋白成為可能。已 知如下事實，即同型三聚體具有3重對稱性，而同型二聚體具有2重對稱性，因此所述 兩種截然不同結構形式理論上不可能完全重疊(

圖1)。這樣，同型二聚可溶性TNF-R-Fc(例如Enbrel)和可溶性CD4-Fc融合蛋白均不可能具有分別結合其對應的同型三聚配體TNF-a與HIV gpl20的最佳界面。相反，由本發明所製造的同型三聚可溶性TNF受體和CD4是三價的，在結構上具有與對應同型三聚配體完美對接的潛力。因此，這些三聚可溶性受體類似物可尤為有效地中和其三聚配體的生物活性。根據適時的本發明，可
以容易且合理地設計出更為有效且更便宜的藥物，例如優選實施方案中所描述的三聚可 溶性TNF-R和CD4，用以對抗例如關節炎和AIDS的虛弱疾病。也可以根據本發明製造 三聚可溶性gp120，其可以更好地模擬HIV病毒上所發現的天然三聚gpl20外被蛋白復 合體，並且用作與先前所用的非三聚gpl20抗原相比更有效的疫苗。也可以根據本發明 製造三聚形式的嵌合抗體，這可使抗體在中和其抗原中親和力極大提高親合力。附圖簡述圖1A、圖1B、圖1C和圖1D是本發明方法與已有二聚免疫球蛋白Fc融合體比較 的示意圖。圖1A是側視圖，且圖1B是俯視圖所示無配體或配體結合形式的同型二聚可溶性 sTNF RII受體-Fc融合體(例如Amgen的Enbrel)的結構特徵。標記1的結構域代表可溶性TNF-RII。應注意，Fc (標記為2，具有鏈間二硫鍵3) 融合蛋白是二聚結構。由於其2重對稱性，二聚Fc融合蛋白是二價的，並且因此理論 上不具有結合同型三聚配體(例如具有3重對稱性的TNF-a (標記4))的最佳構象。圖1C是側視圖，圖1D是俯視圖三聚可溶性sTNFRII受體-C-前肽融合的結構特 徵。由於其3重對稱性，sTNFRII-三聚體融合蛋白本質上是三價的，因此可與其三聚配 體TNF-a完全對接。能夠自身三聚化的膠原的C-前肽標記為5，其具有鏈間二硫鍵3。圖2A和圖2B說明用於製造分泌性三聚融合蛋白的pTRIMER質粒載體的結構。任 何編碼可溶性受體或生物活性多肽的cDNA均可克隆進唯一Hind III位點或Bgl II位點， 以使可以在C-末端處框內融合到含用於三聚化的C-前肽序列的a (I)膠原。圖2A: pTRIMER(TO)構建物在C-前肽的上遊含有部分甘氨酸重複(GXY)n;圖2B:而pTRIMER (T2)僅含有具有突變BMP-1蛋白酶識別位點的C-前肽域。圖3A和圖3B說明二硫鍵連接的三聚膠原融合蛋白的表達和分泌。圖3A.人胎盤鹼性磷酸酶(AP)當融合到a (I)膠原的C-前肽時三聚化的Western 印跡分析。將pTRIMER載體中單獨編碼AP或編碼AP-C-前肽融合體的表達載體瞬時轉 染進HEK293T細胞內。48小時後，將所示各轉染細胞的條件培養基(20pL)在有或無 還原劑(巰基乙醇)的等體積2xSDS樣品緩衝液中煮沸5分鐘，在10% SDS-PAGE上 分離，並用抗AP多克隆抗體(GenHunter Corporation)進行Western印跡分析。應注意， 所分泌的67 kDa AP單獨不形成分子間二硫鍵，而所分泌的AP-T0和AP-T2融合體均有 效組裝為二硫鍵連接的三聚體。
圖3B.可溶性人TNF-RII當融合到a (I)膠原的C-前肽時三聚化的Western印跡 分析。將所示pTRIMER載體內編碼AP-C-前肽融合體(T2)(作為抗體特異性的陰性對 照)或者人可溶性TNF-RII-C-前肽融合體的表達載體瞬時轉染進HEK293T細胞內。48 小時後，將所示各未經轉染和經轉染細胞的條件培養基(20 ^L)在有或無還原劑(巰 基乙醇)的等體積2xSDS樣品緩衝液中煮沸5分鐘，在10% SDS-PAGE上分離，並用 抗人TNF-RII單克隆抗體(克隆226, R&D Systems, Inc.)進行Western印跡分析。應 注意，單克隆抗體僅可識別具有二硫鍵的分泌性TNF-RII。可溶性TNF-RII-TO和 TNF-RII-T2融合體均有效組裝為二硫鍵連接的三聚體。圖4和圖5說明顯示三聚可溶性人TNF-RII-C-前肽融合蛋白對抗人TNF-a所介導的細胞凋亡的有效中和活性的生物測定。圖4. TNF-a敏感性WEHI-13VAR細胞(ATCC)以1百萬個細胞/毫升濃度重懸於 含有10% FBS的RPMI培養基中。100 細胞懸浮液鋪於96孔微量滴定板的各孔內。 向各孔內加入500 ng/mL濃度的放線菌素D，接著在所示三聚可溶性人TNF-RII-T2的存 在或不存在下加入500 pg/ml人TNF-a (R&D Systems)。加入三聚AP-T2替代 TNF-RII-T2作為陰性對照。在組織培養箱內溫育16小時之後，用倒置顯微鏡以20x放 大倍數檢查細胞生存力，或者通過向各孔加入10。/。(v/v)的細胞生存力指示劑染料Alamar Blue (BioSonrce,Inc.)來進行檢査。活細胞能夠將染料從藍色變為粉紅色。應注意，三 聚可溶性人TNF-RII-T2顯示出抗TNF-a的有效中和活性，從而保護細胞免受TNF-a介 導的細胞凋亡。圖5.三聚可溶性人TNF-RII-T2抗人TNF-a的中和活性的定量分析。如圖4A進行 實驗。加入AlamarBlue染料兩小時後，在OD575下分析來自各孔的所示培養基。對比 未添加TNF-a (100%生存力)或者添加TNF-a但未添加中和劑(0%生存力)的各孔， 將讀數進行歸一化。序列表簡述SEQIDNO:l (963個鹼基)編碼人膠原a(I)T0構建物的C-前肽的核苷酸序列。將cDNA構建物克隆進pAPtag2 載體，以代替AP編碼區。下劃線序列代表用於構建對應pTRIMER載體的限制酶切位 點。粗體密碼子代表TO編碼區的起點和終點。SEQIDNO:2 (311個胺基酸)預測的人膠原a (I) C-前肽T0蛋白質序列。下劃線序列代表C-前肽上遊的"甘氨
酸重複"區。紅色的胺基酸殘基表示BMP-1蛋白酶識別位點。 SEQ ID NO: 3 (771個鹼基)編碼人膠原a(I)T2構建物的C-前肽的核苷酸序列。將cDNA構建物克隆進pAPtag2 載體，以代替AP編碼區。下劃線序列代表用於構建對應pTRIMER載體的限制性酶切 位點。粗體密碼子代表T2編碼區的起點和終點。SEQIDNO:4 (247個胺基酸)預測的人膠原a(I)C-前肽T2蛋白質序列。紅色的胺基酸殘基表示經突變的BMP-1 蛋白酶識別位點的位置。SEQ ID NO: 5 (2487個鹼基)編碼融合到人a (I)膠原的TOC-前肽的人胎盤鹼性磷酸酶(AP) (AP-T0)的核苷 酸序列。下劃線序列表示用於融合構建物的限制位點。標記序列中部所示的融合位點的 限制位點是Bgl II。SEQ ID NO: 6 (819個胺基酸)預測的AP-T0融合蛋白的蛋白質序列。藍色的胺基酸殘基表示人胎盤鹼性磷酸酶 (AP)與a (I)膠原TO多肽間的融合位點。粗體密碼子代表融合蛋白的起點和終點。 下劃線序列代表人a (I)膠原的C-前肽上遊的"甘氨酸重複"區。紅色的胺基酸殘基表 示BMP-1蛋白酶識別序列。SEQ ID NO: 7 (2294個鹼基)編碼融合到人a (I)膠原T2C-前肽的人胎盤鹼性磷酸酶(AP) (AP-T2)的核苷酸 序列。粗體密碼子代表融合蛋白的起點和終點。下劃線序列表示用於融合構建物的限制 位點。標記序列中部所示的融合位點的限制位點是BglII。SEQ ID NO: 8 (755個胺基酸)預測的AP-T2融合體的蛋白質序列。藍色的胺基酸殘基表示人胎盤鹼性磷酸酶(AP) 與a (I)膠原T2多肽間的融合位點。紅色的胺基酸殘基表示經突變的BMP-1蛋白酶識 別位點的位置。SEQ ID NO: 9 (1734個鹼基)編碼融合到人a (I)膠原的TOC-前肽的人可溶性TNF-RII (sTNF-RII-TO)的核苷 酸序列。粗體密碼子代表融合蛋白的起點和終點。下劃線序列表示用於融合構建物的限 制位點。標記序列中部所示的融合位點的下劃線序列是BamHI/BglII連接接界。SEQ ID NO: 10 (566個胺基酸)預測的人可溶性TNF-RII-T0融合體的蛋白質序列。藍色的胺基酸殘基表示人可溶
性TNF-RII與a (I)膠原TO多肽間的融合位點。下劃線序列代表人a (I)膠原C-前肽 上遊的"甘氨酸重複"區。紅色的胺基酸殘基表示BMP-1蛋白酶識別位點。 SEQIDNO:ll (1542個鹼基)編碼融合到人a (I)膠原的T2C-前肽的人可溶性TNF-RI1 (sTNF-RII-T2)的核苷酸序列。粗體密碼子代表融合蛋白的起點和終點。下劃線序列表示用於融合構建物的限 制位點。標記序列中部所示的融合位點的下劃線序列是BamHI/BglII連接接界。 SEQIDNO: 12 (502個胺基酸)預測的人可溶性TNF-RII-T2融合蛋白的蛋白質序列。藍色的胺基酸殘基表示人可 溶性TNF-RII與a(I)膠原T2多肽間的融合位點。紅色的胺基酸殘基表示經突變的BMP-l 蛋白酶識別位點的位置。SEQIDN0:13 (2139個鹼基)編碼融合到人a (I)膠原T0C-前肽的人可溶性CD4的核苷酸序列。下劃線序列表 示用於融合構建物的限制位點。標記序列中部所示的融合位點的下劃線序列是BglII位點。SEQIDNO: 14 (699個胺基酸)預測的人可溶性CD4-T0融合體的蛋白質序列。藍色的胺基酸殘基表示人可溶性 CD4與a (I)膠原TO多肽間的融合位點。下劃線序列代表人a (I)膠原C-前肽上遊的 "甘氨酸重複"區。紅色的胺基酸殘基表示BMP-1蛋白酶識別位點。 SEQIDNO:15 (1947個鹼基)編碼融合到人a (I)膠原T2 C-前肽的人可溶性CD4的核苷酸序列。下劃線序列表 示用於融合構建物的限制位點。標記序列中部所示的融合位點的下劃線序列是BglII位點。SEQIDNO:16 (635個胺基酸)預測的人可溶性CD4-T2融合體蛋白質序列。藍色的胺基酸殘基表示人可溶性CD4 與a (I)膠原T2多肽間的融合位點。紅色的胺基酸殘基表示經突變的BMP-1蛋白酶識 別位點的位置。發明詳述在闡述本發明之前，先闡述下文將使用的某些術語的定義可能有助於理解本發明。DNA構建物:通常是質粒或病毒載體形式的單鏈或雙鏈DNA分子，其經過重組DNA技術修飾含有以一定方式連接的DNA節段，所述連接方式使其作為整體不會存在
於自然界。DNA構建物含有指導表達和/或分泌所編碼的目的蛋白質所需的信息。信號肽序列:起到指導成熟多肽或蛋白質從細胞分泌的作用的一段胺基酸序列。信 號肽的特徵在於疏水胺基酸核心，並且通常發現於待分泌或錨定在細胞表面上的新近合 成蛋白質的氨基末端。信號肽通常在分泌期間從成熟蛋白切割下來。這種信號肽含有的 加工位點使得當其經過蛋白分泌途徑時信號肽可以從成熟蛋白切割下來。信號肽序列當 連接到另一種無信號肽的蛋白質的氨基末端時，可以指導融合蛋白的分泌。大部分分泌 性蛋白質，例如生長因子、肽激素、細胞因子和膜蛋白(例如細胞表面受體)，當合成 為新生蛋白質時含有信號肽序列。可溶性受體:細胞表面受體的部分或全部胞外結構域，其能夠結合其配體。其通常 不含有任何一段負責膜錨定的內部疏水性胺基酸序列。膠原的C-前肽:膠原的C-末端球狀非三股螺旋結構域，其能夠自組裝為三聚體。 與膠原的三股螺旋區相反，C-前肽不含有任何甘氨酸重複序列，並且通常在前膠原分泌 時膠原原纖維形成之前經蛋白酶解從前膠原前體除去。甘氨酸重複:膠原的中央線性三股螺旋形成區，其在胺基酸序列中含有數百個(Gly-X-Y)n重複。這些重複在X或/和Y位置也富含脯氨酸。在N-前肽和C-前肽除去 時，含甘氨酸重複的膠原三股螺旋可以組裝為更為有序的不溶性膠原原纖維，其構成細 胞基質的主要組分。cDNA:代表互補DNA或者說與信使RNA互補的DNA序列。總體來說，cDNA序 列不含有任何內含子(非蛋白質編碼)序列。在本發明之前，幾乎所有的治療用抗體和可溶性受體-Fc融合蛋白(例如Enbrel) 都是二聚體結構(圖1)。儘管已證明這些分子與其單體對應物相比以更高的親合力結合 其靶抗原或配體，但是由於結構限制，預計它們仍不能完全其結合其具有同型三聚結構 的靶標。這種治療上重要的三聚配體的實例包括TNF家族的細胞因子和HIV外被蛋白 gpl20。因此，從結構角度來說，希望也可以產生可完全對接其靶標三聚配體或抗原(圖 1)從而完全封閉配體活動的三聚可溶性受體或抗體。期望這種三聚可溶性受體或嵌合 抗體對其耙標具有最高親和力，並且因此可以更加有效果和有效率地治療例如關節炎和 AIDS的疾病。本發明公開通過將其融合到膠原的C-前肽(其能夠自組裝為三聚體)來產生這種分泌性三聚受體和生物活性蛋白質的方法。以下為本發明的優點(l)膠原是哺乳動物體內所分泌的最豐富的蛋白質，構成將近25%的體內總蛋白質；(2)膠原的主要形式天然以三聚螺旋出現，其球狀C-前肽負責三聚化的引發，其隨後在三股螺旋形成時經蛋白酶
解切割；(3)據發現，膠原的被切割可溶性三聚C-前肽在哺乳動物血液中天然為亞微克 /毫升水平；(4)膠原的線性三股螺旋區可作為接頭而被包括，或者被排除作為融合蛋白 的一部分，因此可以精確調節待三聚化蛋白與膠原C-前肽之間的距離，以獲得最佳生物 活性；(5)可使從前膠原切割下來的C-前肽的BMP 1的識別位點突變或刪除，以防止 三聚融合蛋白被破壞；(6) C-前肽域提供通用親和標記物，其可以用於純化本發明所制 造的任何分泌性融合蛋白；(7)與已知具有其它生物功能(例如結合其自身細胞表面受 體)的IgGlFc標籤不同，膠原C-前肽的僅有已知生物功能是其引發新生前膠原鏈的三 聚化並在新近產生的前膠原三聚體組裝為不溶性細胞基質之前保持可溶的能力。膠原 C-前肽的這種獨特特性意味著此獨特三聚化標籤不可能有毒性或免疫原性，這使其成為 治療應用的理想候選者。為了證明製造分泌性三聚融合蛋白的可行性，使用購自美國模式培養物保藏所 (ATCC)的EST克隆，通過RT-PCR擴增編碼人al (I)完整C-前肽的cDNA序列， 所述人al完整C-前肽含有一些甘氨酸重複三股螺旋區(T0構建物，序列ID No. 1-2)， 或不含甘氨酸重複但具有突變的BMP-1識別位點(T2構建物，序列ID No. 3-4)。將所 擴增的cDNA各自作為Bgl II-XbaI片段克隆進pAPtag2哺乳動物表達載體內(GenHunter Corporation; Leder等人，1996和1998)，以代替AP編碼區(圖2)。所產生的載體分別 稱為pTRIMER T2和T0。所述載體使得任何編碼可溶性受體或生物活性蛋白的cDNA 模板在唯一的Hind III和Bgl II位點處可以方便地進行框內融合。與天然前膠原類似， 這種融合蛋白具有位於C末端的膠原三聚化標籤。 實施例1:為了證明本發明的可行性，將編碼人分泌性胎盤鹼性磷酸酶(AP)的cDNA (包括其天然信號肽序列)從pAPtag4載體(GenHunter Corporation; Leder等人，1996和1998)上作為Hind III-Bgl II片段切下，並且克隆進pTRIMER-TO和pTRMER-T2載體的相應位點。所產生的AP-膠原融合構建物(序列ID No. 5-8)在轉染HEK293T細胞(GenHunterCorporation)之後在其中進行表達。可容易地用所轉染細胞的條件培養基通過AP活性分析來測定AP-膠原融合蛋白的成功分泌。在轉染2天後，AP活性達到約1單位/毫升(或者相當於約lpg/mL融合蛋白)。為了獲得穩定表達融合蛋白的HEK293T細胞，在與嘌羅黴素(puromycine)抗性載體pBabe-Puro (GenHunter Corporation)共轉染之後，選擇穩定克隆。將表達AP活性的克隆擴增並且保存，以供長期生產融合蛋白。為了確定AP-膠原融合蛋白是否組裝為二硫鍵連接的三聚體，將單獨含有AP或者含有AP-TO與AP-T2融合體的條件培養基在不含卩-巰基乙醇(非還原)或含有P-巰基乙醇(還原)的SDS樣品緩衝液中煮沸，通過SDSPAGE分離，並用抗AP多克隆抗體 (GenHunter Corporation)進行Western印跡分析。無融合體的單獨AP在非還原和還原 條件下均顯示為67 kDa條帶，如所預期其與缺少任何分子間二硫鍵的情況一致(圖3A)。 相反，所分泌的AP-TO和AP-T2融合蛋白顯示在非還原條件下(約300kDa)是在還原 條件下(90-100 kDa)的三倍大，表明兩種融合蛋白均完全組裝為同型三聚體(圖3A)。 此結果實質上使本發明的概念能付諸實踐。 實施例2:為了提供證據證明可以賦予三聚融合蛋白新的治療上有益的生物功能，接著用購自 ATCC的相應EST克隆構建三聚可溶性TNF-RII (p75)受體。如實施例1所描述，將人 TNF-RII的N-末端區(包括完整配體結合區但排除跨膜結構域)作為BamHI片段框內 克隆進pTRIMER-T0和pTRIMER-T2載體的Bgl II位點(序列ID No. 9-12)。所產生的 融合構建物在轉染HEK293T細胞之後在其中表達。如實施例1所描述，通過嘌羅黴素 共選擇獲得穩定克隆。在非還原條件和還原條件下均進行Western印跡分析，以確定所 產生的可溶性TNF-RII-膠原融合蛋白是否確實表達、分泌且組裝為三聚形式。如所預期， 抗人TNF-RII的單克隆抗體(購自R&D Systems, Inc.的克隆226)明顯識別由TO和T2 融合載體表達為220-240 kDa條帶的三聚可溶性TNF-融合蛋白，所述三聚可溶性TNF-融合蛋白大約是相應單體融合蛋白的三倍大(圖3B)。在還原條件下，TNF-RII抗體未 能檢測單體融合蛋白，這符合抗體廠商所說明的特性。作為抗體特異性的陰性對照，單 獨HEK293T細胞及表達AP-T2融合蛋白的細胞均不表達任何TNF-RI1 (圖3B)。為了確定三聚可溶性TNF-RII受體是否是其三聚配體TNF-a的有效抑制劑，基本上 如前所述用細胞因子敏感細胞系WEHI-13VAR (ATCC)進行TNF-a生物測定(Mohler 等人，1993)。圖4所示的結果清楚表明，三聚可溶性TNF-RII-C-前肽融合蛋白在放線菌 素D (500ng/mL) (Sigma)存在下極為有效地中和TNF-a介導的WEHI-13VAR細胞的 細胞凋亡。當使用0.5 ng/mL的TNF-a (R&D Systems)時，三聚可溶性TNF-RII-T2 (均來自無血清培養基或為純化形式)具有約2 ng/mL或8xl0—12 M (假設240 kDa的分 子量屬同型三聚體)的表觀Ki-M) (50%抑制)。此對TNF-a的親和力比單體TNF-RII四 個大數量級，比二聚可溶性TNF-RII-Fc融合體(例如Enbrel)大至少10-100倍(Mohler 等人，1993)。此關鍵性實施例證明，本發明可以製造具有新的生物特性的三聚融合蛋白，其可能具有極大治療應用。可以證明，這種可溶性三聚人TNF受體在治療自身免疫疾病(例如RA)中比當前市售的二聚可溶性TNF受體(例如Enbrel)更為有效。三聚TNF受體的
極大提高的效價可以大大減少每個患者每周所注射的TNF阻斷劑的量，同時有改善治療 並顯著降低患者的花費。三聚TNF受體的改善的效價也應該能緩和目前二聚TNF受體 生產中存在的瓶頸，所述生產目前僅可滿足治療美國約100，000個患者的需求。 實施例3:作為AIDS病因的HIV病毒主要感染並破壞我們身體內特殊譜系的T淋巴細胞。這 些所謂的CD4+ T細胞表達稱為CD4的細胞表面蛋白，其是HIV的受體。HIV通過其 結合CD4的病毒外被蛋白gpl20識別CD4+細胞。值得注意的是，gpl20作為巨大的同 型三聚複合體存在於病毒表面上，而CD4是細胞表面上的單體。目前提出的HIV感染 模式是，病毒RNA進入細胞需要HIV與CD4+ T細胞的完全對接，此時gpl20三聚體 的所有三個亞單位均各結合至CD4。顯然， 一種阻止HIV感染的直接了當的策略是用可 溶性CD4來蒙蔽病毒。確實，已經證明這種使用單體可溶性CD4和CD4-Fc融合體的 方法在抑制實驗室分離物的HIV感染中十分有效(Clapham等人，1989; Daar等人， 1990)。可惜的是，這些可溶性CD4在阻止AIDS患者中所發現的HIV病毒株的感染中 不夠有效，這可能是由於gpl20胺基酸序列變異降低與單體CD4和二聚可溶性CD4的 親和力所致。為了顯著提高可溶性CD4與HIV病毒上的任何gpl20變異體的親和力，理想的是， 可溶性CD4應是三聚形式，以使其可完全對接至其三聚配體即gpl20同型三聚體。與 AIDS作鬥爭的一個主要難題在於病毒基因組的高突變率，其導致藥物抗性。因此，由 於病毒突變，直接靶向例如HIV逆轉錄酶(例如AZT)和蛋白酶的病毒基因的任何藥 物可能被致無效。相反，無論其突變程度多少，HIV病毒都不得不結合細胞CD4受體來 引發感染。因此，高親和力可溶性CD4三聚體應該不受病毒突變的影響，因為病毒在 gpl20基因中的突變將使得病毒既不能結合三聚可溶性CD4，也不能結合細胞上的CD4。為了製造這種三聚可溶性CD4 HIV受體類似物，使用購自ATCC的EST克隆，擴 增編碼完整人可溶性CD4的cDNA，其包括其天然信號肽序列，但排除掉跨膜結構域和 短胞質結構域。隨後將所產生的cDNA作為Hind III-Bgl II片段克隆進pTRIMER-TO和 pTRIMER-T2表達載體的相應位點。所產生的可溶性CD4-膠原融合構建物(序列ID No. 13-16)在轉染HEK293T細胞(GenHunter Corporation)之後在其中進行表達。為了獲 得穩定表達融合蛋白的HEK293T細胞，在用嘌羅黴素抗性載體pBabe-Puro (GenHunter Corporation)共轉染之後，選擇穩定克隆。將表達融合蛋白的克隆擴大並保存，以供長 期生產融合蛋白。為了確定可溶性人CD4-膠原融合蛋白是否組裝為二硫鍵連接的三聚體，將含有可 溶性CD4-T0與CD4-T2融合體的條件培養基在不含P-巰基乙醇(非還原)或含有P-巰 基乙醇(還原)的SDS樣品緩衝液中煮沸，通過SDSPAGE分離，並用抗人CD4的單 克隆抗體(R&D Systems)進行Western印跡分析。證明所分泌的可溶性CD4-T0和 CD4-T2融合蛋白在非還原條件下(約300kDa)均是在還原條件下(90-100 kDa)的三倍大，表明其基本上完全組裝為同型三聚體(數據未顯示)。然後可容易地測試這些三 聚可溶性CD4的gpl20結合和抗HIV感染情況。
權利要求
1. 一種產生分泌三聚融合蛋白的方法，其包含(a)構建包含連接到編碼信號肽序列的模板的轉錄啟動子的DNA構建物，所述信 號肽序列框內融合到待三聚化的多肽，所述待三聚化的多肽又框內連接到能夠自身三聚 化的多肽，所述多肽與待三聚化的第一多肽異源(heterologous) ; (b)將所述DNA構 建物引入真核細胞內；(c)在生理條件下在適當的培養基中生長所述宿主細胞，使得 可以分泌由所述DNA序列編碼的三聚融合體蛋白；(d)從所述宿主細胞的培養基分離 所述三聚化融合蛋白。
2. 根據權利要求l的方法，其中所述三聚化多肽融合體是同型三聚體。
3. 根據權利要求1的方法，其中所述三聚化多肽部分包含能夠自組裝為三聚體的膠 原C末端部分，所述膠原C末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro,a.l(II)、 pro,a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI)。
4. 一種產生分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括(a)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的第一DNA構建物， 所述開放讀碼框由框內連接到待三聚化的非膠原多肽的信號肽序列組成，而所述信號肽 序列又框內連接能夠自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自 pro.a.l(I)、pro.a.2(I)、pro.a.l(II)、pro.a.l(III)、pro.a.l(V)、pro.a.2(V)、pro.a.l(XI)、pro.a.2(XI) 和pro.a.3(XI); (b)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的第二 DNA構建物，所述開放讀碼框由框內連接到待三聚化的第二非膠原多肽的第二信號肽序 列組成，而所述第二信號肽序列又框內連接能夠自身三聚化的第二膠原C-末端部分，所 述第二膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (c)在生理條件下在適當的生長培 養基中生長所述宿主細胞，使得可以分泌由所述第一與第二 DNA序列編碼的三聚融合 蛋白；和(d)從所述宿主細胞分離所述分泌性三聚融合蛋白。
5. —種產生分泌性三聚融合蛋白的方法，所述方法包括(a)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的第一DNA構建物， 所述開放讀碼框由框內連接到待三聚化的非膠原多肽的信號肽序列組成，而所述信號肽 序列又框內連接能夠自身三聚化的膠原C-末端部分，所述膠原C-末端部分選自 pro.a.l(I)、pro.a.2(I)、pro.a.l(II)、pro.a.l(III)、pro.a.l(V)、pro.a.2(V)、pro.a.l(XI)、pro.a.2(XI) 和pro.a.3(XI);(b)向真核宿主細胞內引入包含驅動開放讀碼框轉錄的啟動子的第二 DNA構建物，所述開放讀碼框由框內連接到待三聚化的第二非膠原多肽的第二信號肽序 列組成，而所述第二信號肽序列又框內連接能夠自身三聚化的第二膠原C-末端部分，所 述第二膠原C-末端部分選自pro.a.l(I)、 pro.a.2(1)、 pro.a.l(II)、 pro.a.l(III)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI); (c)向真核宿主細胞內引入包含驅 動開放讀碼框轉錄的啟動子的第三DNA構建物，所述開放讀碼框由框內連接到待三聚 化的第三非膠原多肽的第三信號肽序列組成，而所述第三信號肽序列又框內連接能夠自 身三聚化的膠原的第三C-末端部分，所述第三膠原C-末端部分選自pro.a,l(I)、pro.a.2(1)、 p歸,l(II)、 p歸.l(in)、 pro.a.l(V)、 pro.a.2(V)、 pro.a.l(XI)、 pro.a.2(XI)和pro.a.3(XI);(d)在生理條件下在適當的生長培養基中生長所述宿主細胞，使得可以分泌由所述第 一與第二DNA序列編碼的三聚融合蛋白；和(e)從所述宿主細胞分離所述分泌性三聚 融合蛋白。
6. 根據權利要求l-5任意一項所述的方法，其中所述信號肽序列和所述待三聚化的 非膠原多肽均來源於相同的天然分泌性蛋白。
7. 根據權利要求1-5任意一項所述的方法，其中所述信號肽序列和所述待三聚化的 非膠原選自兩種不同的分泌性蛋白。
8. 根據權利要求l、 4和5任意一項所述的方法，其中所述宿主真核細胞是真菌細 胞或昆蟲細胞。
9. 根據權利要求l、 4和5任意一項所述的方法，其中所述宿主真核細胞是培養的 哺乳動物細胞系。
10. 根據權利要求1-5任意一項所述的方法，其中所述膠原C-末端部分包括連接到 C-前肽的膠原"甘氨酸重複"三股螺旋區。
11. 根據權利要求IO任意一項所述的方法，其中所述膠原C-末端部分由序列ID No. 1-2標示。
12. 根據權利要求1-5任意一項所述的方法，其中所述膠原三聚化C-末端部分僅包 含C-前肽，而無任何膠原甘氨酸重複三股螺旋區。
13. 根據權利要求10-12任意一項所述的方法，其中所述膠原三聚化C-末端部分包 含發生突變或缺失的BMP-1蛋白酶識別序列，從而賦予所述融合蛋白對所述蛋白酶降 解的抗性。
14. 根據權利要求12-13任意一項所述的方法，其中所述膠原三聚化C-末端部分由 序列ID No. 3-4標示。
15. 融合蛋白的組合物，所述融合蛋白由根據權利要求1、 2、 3、 10、 11、 12、 13 和14任意一項所述的方法產生，是序列ID No. 9-12所標示的可溶性三聚人TNF-a受體 II (p75)。
16. 融合蛋白的組合物，所述融合蛋白由根據權利要求1、 2、 3、 10、 11、 12、 13 和14任意一項所述的方法產生，是序列IDNo. 13-16所標示的可溶性三聚人CD4。
17. 融合蛋白的組合物，所述融合蛋白由根據權利要求1、 2、 3、 10、 11、 12、 13 和14任意一項所述的方法產生，是序列ID No. 5-8所標示的可溶性三聚可溶性人胎盤 鹼性磷酸酶。
18. —種三聚化多肽融合體，所述三聚化多肽融合體包含三條多肽鏈，其中每條所述 鏈均包含連接到膠原C-前肽的受體的配體結合結構域，其中所述多肽融合體的三聚化導 致生物活性增強。
19. 一種阻斷TNF-oc生物活性的方法，所述方法使用由權利要求15所產生的三聚化 可溶性TNF-a受體II。
全文摘要
本發明公開生產三聚形式的分泌性可溶性受體和生物活性多肽的方法與組合物。所述方法包括將編碼具有配體結合域的可溶性受體或生物活性多肽的DNA模板融合到編碼膠原C-前肽的DNA序列，所述膠原C-前肽能夠自組裝為共價連接的三聚體。所產生的融合蛋白作為三聚可溶性受體類似物而分泌，可用於更有效地中和其天然三聚配體的生物活性。
文檔編號C12P21/04GK101146818SQ200480028746
公開日2008年3月19日 申請日期2004年10月4日 優先權日2003年10月2日
發明者鵬 梁 申請人:吉亨特公司