含稀有人參皂甙的組合物及其製備方法以及用途的製作方法
2023-06-29 15:18:41
專利名稱：含稀有人參皂甙的組合物及其製備方法以及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有稀有人參皂甙-Rh2和-Rg3的組合物，這種組合物的應用及其製備工藝。
背景技術：
五加科(araliaceae)人參屬(Panax)植物，如人參(P.ginseng)、西洋參(P.quenquefolinus)、三七(P.notoginseng)、竹節參(P.uaponicus)，葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍(Gynostemma pentaphyllum Thrunb Mak)等均為我國習用藥用植物，其主要有效成分為人參皂甙。目前已發現的人參皂甙有42種，分為三種類型人參二醇甙，人參三醇甙，齊墩果酸皂甙。各組中甙元均相同，而糖鏈有所不同。
人參二醇甙組中的稀有人參皂甙Rh2和Rg3均為日本學者北川勳於1983年由紅參中分離得到的微量組分。
前此的大量實驗研究已經證實，人參皂甙-Rh2可誘導腫瘤細胞的逆向轉化，從而使增殖的癌細胞逆轉為正常細胞(Chemical studies on crude drugsI[J].Yakugaku Zasshi 1983，103(6)612-62)。試驗研究表明，人參皂甙Rh2對培養的小鼠肺癌細胞、大鼠Morris肝癌細胞及小鼠B16黑色素瘤細胞具有明顯的特異性抑制作用，表現為黑色素生成能力明顯增加；形態向正常上皮細胞分化；細胞呈網狀結構；黑色素顆粒增多；生成變緩慢。細胞動力學研究結果表明，人參皂甙Rh2可使B16黑色素瘤細胞阻斷在G1期，藥物作用後，G1期細胞明顯增加，S期細胞明顯減少，進一步說明人參皂甙Rh2對B16黑色素瘤細胞具有分化誘導作用(藥學學報，1996，31(10)742-745.)。此外，人參皂苷Rh2可以改善局部缺血導致的腦損傷(Biol Pharm Bull.2004 Mar；27(3)433-6.)，並有細胞膜穩定作用，對LPS刺激RAW264.7細胞產生NO和PGE2具有抑制作用(Biol PharmBull.2003，26(11).-1581～1584)。
人參皂甙Rg3具有選擇性地抑制腫瘤細胞浸潤和轉移的作用。人參皂甙Rg3可促進NO的生成，阻礙腫瘤細胞對纖維粘連蛋白和層粘連蛋白的粘附，抑制血管內皮細胞的增殖和腫瘤新生血管的形成，降低細胞內C2+濃度，破壞其在血管壁的著床和進入浸潤血管內壁，特別是能抑制細胞生長因子和血管內皮生產因子的產生與表達。從而起到抑制腫瘤生長、擴散和轉移的作用(中國中西醫結合外科雜誌，2001，7(4)289-290.)。高勇等人利用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)觀察人參皂甙Rg3作用後腫瘤新生血管的生長狀況，結果表明人參皂甙Rg3可明顯抑制Lewis肺癌的生長，同時人參皂甙Rg3具有與蘇拉明類似的抗新生血管作用(第二軍醫大學學報，2001，22(1)40-42.)。人參皂苷Rg3可以逆轉酒精和東莨菪鹼所致記憶功能紊亂(Arch Pharm Res.2005 Mar；28(3)335-42.)；拮抗NMDA受體，對缺血和穀氨酸所致腦細胞壞死有明顯改善作用(Neurochem Res.2004Dec，29(12)2257-66.)，對腦細胞Na+通道有電壓依賴性和劑量依賴性的可逆抑制作用。人參皂苷Rg3對家兔基底動脈平滑肌有明顯的舒張作用，且呈劑量依賴性，其機理可能與血管平滑肌細胞上的鈣通道和鈣激活的鉀通道有關，而與內皮細胞的功能無關。
上述藥理實驗研究結果表明，人參皂甙Rh2和Rg3具有多方面很高的生物活性。但迄今尚未見含有人參皂甙Rh2和Rg3的組合物藥用和/或作功能性食品應用的公開資料。
人參皂甙Rh2和Rg3為人參屬植物中的痕量成分，在原植物中含量很低或幾乎不能檢出。如人參皂甙Rh2在紅參中含量僅為十萬分之一，在白參中幾乎不存在。人參皂甙Rg3在紅參(曬乾或蒸製後)中含量也僅有十萬分之三左右。
近年來，國內外研究者一直在探尋批量生產人參皂甙Rh2和Rg3的工藝技術，並已取得了一些進展。目前已公開的生產人參皂甙Rh2或Rg3的工藝路線主要有1、半合成法製取人參皂甙Rh2前蘇聯學者提出了兩個半合成法製備人參皂甙Rh2的方法，一條路線為用人參三醇和乙醯溴代葡萄糖縮合合成人參皂甙Rh2。但選擇性較差，混合物難以分離。另一條路線則採用從樺樹葉分得的白樺烯三醇為原料，通過五步區域選擇性和立體選擇性反應合成人參皂甙-Rh2(中國藥物化學雜誌，1992，2(1)64-70)。1995年韓國專利申請公告95-7250則公開了首先用強鹼的醇溶液水解人參葉和/或根莖的乾燥粉末，得到20(S)-Rh2甙元，然後再在碳酸銀等催化劑存在下與葡萄糖縮合製備20(S)-Rh2的方法。上述方法反應步驟繁瑣，經濟上也不實用。
2、鹼水解法製取人參皂甙Rh21992年，宋長春等人報導，利用西洋參莖葉總皂甙為起始材料，經用20％的NaOH水解後，經純化得到20(S)-人參皂甙Rh2，回收率1.42％(中國藥學雜誌，27(1)6，1992)。而韓國人參菸草研究所1994年公開了一種從人參組分中製備製備20(R)-人參皂甙Rh2的方法，其特徵在於首先用酸水解人參皂甙原人參二醇組分，再經乙醯化及水解處理得到20(SR)-人參皂甙Rg3，再用鹼水解得到20(SR)-人參皂甙Rh2(韓國專利申請公告94-8291)。另一項專利申請公開了用酸水解原人參二醇組分(系列)單體皂甙製得Rg3，然後乙醯化處理並用半製備HPLC法分離得到20(S)-人參皂甙Rh2的方法。CN1225366A，1999-8-11；CN1293198A，2001-05-02；CN1352977A，2002-06-12也分別公開了以人參二醇組皂甙為起始材料，用強鹼水解法製備人參皂甙Rh2的方法。上述方法收率在1.42～5.6％之間。
3、酶水解法製備人參皂甙Rh2CN1229086A，1999-09-22公開了一種用皂甙β-葡萄糖苷酶等皂甙酶製取人參皂甙Rh1、Rh2等的方法。該法用自微生物中分離純化的皂甙酶水解人參皂甙Rg3得到Rh2，水解人參皂甙Re得到Rg1，水解人參皂甙Rg2得到Rh1。並稱可水解人參混合皂甙，使其中的稀有抗癌皂甙Rh2、Rh1含量增加幾百倍。酶法水解有較好的定向性，但皂甙酶本身需要提取純化，成本較高。就收率而言，按專利說明書中所聲稱稀有人參皂甙含量提高了幾百倍計，人參皂甙Rh2在其混合皂甙中的理論含量也僅能達到5％以下。
4、酸水解法製取人參皂甙Rg3。
1991年，日本學者發現動物胃液和鹽酸可使人參皂甙Rb2部分地水解為人參皂甙Rg3(Chem Pharm Bull(Tokyo).1991 Feb；39(2)400-4.)。在國內，2002年，CN1092204C，2002-10-09公開了一種20(S)-人參皂甙Rg3的半合成工藝，首先用乙酸乙酯與正丁醇萃取人參總皂甙分離出人參皂甙二醇組，再用鹽酸的醇溶液對人參皂甙二醇組進行水解，製取20(S)-人參皂甙Rg3。該法需用有機溶劑萃取人參皂甙二醇組作為水解起始材料，並需在有機溶劑系中進行水解，工藝仍較為繁複，有機溶劑用量大，回收困難，且僅能獲得20(S)-人參皂甙Rg3，收率僅能達到5～7％。2003年，CN1417225A，2003-05-14公開了一種由人參皂甙直接酸水解製備人參皂甙Rg3的方法，以純度人參皂甙≥90％，不含有三醇型皂甙的人參二醇型皂甙，在含有保護劑的有機溶劑酸溶液中、惰性氣體保護下進行水解，製備人參皂甙Rg3。
上述方法均可以分別獲得人參皂甙Rh2或Rg3，但大多對半合成或水解條件有比較嚴格的要求，如要求以人參二醇甙甚至單體皂甙為水解起始原料，或/和須在有機溶劑系中水解，或/和須添加保護劑，或/和須使用保護氣體等。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，提供一種具有預防和治療神經細胞損傷性疾病、心腦血管疾病、惡性腫瘤及抗衰老、抗疲勞功能的含有特定比例的稀有人參皂甙Rh2和Rg3的組合物。
本發明的另一目的在於提供這種組合物的製備方法。
本發明的再一目的是提供這種組合物的用途。
本發明所述的含稀有人參皂甙的組合物為組合物中人參皂甙Rh2和Rg3的總含量為重量百分比5％～49.9％，人參皂甙Rh2與Rg3兩組分間的相對重量比例人參皂甙Rh2∶人參皂甙Rg3為1∶0.1～8。
上述組合物中更佳的範圍為組合物中人參皂甙Rh2和Rg3的總含量為重量百分比20％～49.9％，人參皂甙Rh2與Rg3兩組分間的相對重量比例人參皂甙Rh2∶人參皂甙Rg3為1∶0.1～8。
在上述組合物中，剩餘成分為Rh2和Rg3自然帶如的成分。
本發明所述的含稀有人參皂甙的組合物的製備方法為以人參總皂甙為起始原料，在水系溶劑系統中，在0.01～10mol/L酸濃度及40℃～160℃、常壓～1.5MPa(表壓)條件下，進行人參總皂甙水解20分鐘～960分鐘，降溫至28℃以下、加鹼中和至PH值為中性，沉澱，去除母液，沉澱物乾燥直接獲取含有稀有人參皂甙Rh2和Rg3總含量為5％～49.9％的組合物。
上述的降溫可以是自然降溫，也可為在8-10分鐘內的急速降溫；所加的鹼並不苛求，可用常用鹼。
本發明製備方法的特點是以人參總皂甙為起始原料，在不含任何有機溶劑的水系溶劑系統中進行，不需添加保護劑，或/和須使用保護氣體等，無有劑溶劑殘留，更簡單、經濟和在工業中批量生產。
其中人參總皂甙為由五加科(araliaceae)人參屬(Panax)植物，如人參(P.ginseng)、西洋參(P.quenquefolinus)、三七(P.notoginseng)、竹節參(P.uaponicus)，葫蘆科絞股藍屬絞股藍(Gynostemma pentaphyllum Thrunb Mak)等植物中的一種的全植物提取的總皂甙；或前述植物根、莖、葉、果中的一種或二種以上部位提取的總皂甙；以及前述總皂甙的精製品。人參總皂甙中皂甙含量範圍為20％～99％。酸為鹽酸、乙酸、磷酸、硫酸、冰醋酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、三氟乙酸、二氟乙酸、一氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一種或二種以上。
更佳的參數範圍為酸濃度0.08～4mol/L，溫度90℃～130℃，壓力0.05～0.8MPa，時間30分鐘～270分鐘。
上述組合物可用於神經細胞損傷性疾病的預防、治療和輔助治療，心腦血管疾病的預防、治療和輔助治療、實體性惡性腫瘤(肺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、卵巢癌、神經膠質瘤等)的預防、治療和輔助治療，以及抗衰老、抗疲勞等。可以製成藥物或功能性食品，如散劑、顆粒劑、膠囊劑、緩釋和控釋膠囊劑、素片和包衣片、緩釋和控釋片、分散片、口含片、口服液等。
上述組合物可以由人參皂甙Rh2與Rg3單體，和/或分別含有人參皂甙Rh2與Rg3的混合皂甙按上述比例配製而成，也可以按本發明所提供的製備工藝製取。
以下提供本發明所述組合物的藥效學及功能性實驗資料實驗一對腫瘤細胞株生長的抑制試驗(一)材料和儀器癌株S-180肉瘤株和Lewis肺癌瘤株均由中國醫學科學院藥物研究所提供。
受試藥物人參總皂甙水解組合物為自製，含人參皂甙Rh213.8％，Rg332.1％；人參皂甙Rh2為自製，含量為92.7％；人參皂甙Rg3為自製，含量為95.34％。
陽性對照藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)。
陰性對照含5％新生牛血清的RPMI-1640培養基。
0.4％臺盼藍溶液；
Hank’s平衡鹽水(HBSS)。
二氧化碳培養箱；生物顯微鏡；超淨工作檯。
2實驗方法取對數生長期的腫瘤細胞，用含5％新生牛血清的RPMI1-640配成濃度為4×104個/ml的腫瘤細胞懸液，分裝於每個培養瓶中，接種細胞懸液4ml的第2天每瓶加入受試藥物40μl(受試藥物用時溶於少量DMSO和95％乙醇，用含5％新生牛血清的RPMI-1640培養基分別稀釋成0.2，1，5，10μg/ml(人參總皂甙水解組合物以人參皂甙Rh2，Rg3總含量計，人參皂甙Rh2，Rg3均以純物質計)4個濃度，每個濃度3瓶，陰性對照組加等體積的含5％新生牛血清的RPMI1640，陽性對照組加等體積的5-氟尿嘧啶(濃度為1μg/ml)，繼續在37℃，5％CO2的培養箱中培養72h，搖勻組織培養瓶，取懸浮液0.2ml，加入0.4％臺盼藍溶液0.5ml及平衡鹽水0.3ml，充分混合，在血球計數板上分別計數(200個以上)其中未染色的活細胞及染色的死細胞。計算出抑制率(公式抑制率＝染色細胞/總細胞×100％)，並通過X2(2×2)統計法對數據進行統計。
3實驗結果實驗結果見表1、表2。
表1人參總皂甙水解物和Rh2，Rg3對S180肉瘤株的抑制作用
表2人參總皂甙水解物和Rh2，Rg3對Lewis肺癌瘤株的抑制作用
4結論不同濃度(125，25，5，1μg/ml)的人參總皂甙水解組合物(含人參皂甙Rh213.8％，Rg332.1％)，人參皂甙Rh2，Rg3對體外培養的S180肉瘤瘤株和Lewis肺癌瘤株均有抑制作用，並且抑制作用呈劑量依賴性增強。人參總皂甙水解組合物與人參皂甙Rh2，Rg3相比較，抑制作用相當(P＞0.05)或稍強於單體人參皂甙Rh2，Rg3(P＜0.05)。
實驗二舒張血管作用1實驗材料人參總皂甙水解組合物自製，HPLC檢測含人參皂甙Rh213.8％，Rg332.1％，人參皂甙Rg3為自製，HPLC檢測含量為95.34％。
苯腎上腺素(phenylephrine，PE)。
Cremophor EL。
人參總皂甙水解組合物，人參皂甙Rh2，人參皂甙Rg3均以Cremophor EL製成10μg/ml的母液(人參總皂甙水解組合物以人參皂甙Rh2，Rg3總含量計，人參皂甙Rg3以純物質計)。實驗開始前，上述藥物均用Krebs-Henseleit(K-H)液配製成梯度稀釋液備用。
雄性成年家兔，體重2.7±0.5kg。
張力換能器。
8導生理記錄儀。
恆溫水浴。
2實驗方法家兔經擊頭和頸動脈放血致死，取椎基底動脈置入富氧的K-H溶液中；除去血管外脂肪，以螺旋狀連續剪成3mm×15mm的平滑肌條，一端固定於含K-H液的5ml浴槽底部，另一端固定於量程為5.0g的張力換能器上，並將整個平滑肌條自始至終浸泡於K-H液中，連續充以95％O2與5％CO2混合氣，浴槽以(37.0±0.5)℃循環水恆溫水浴。換能器接8導生理記錄儀，加2.0g基礎負荷，平衡20min，每隔10min換液1次。肌條張力穩定後備用。
加入10μmol/mlPE使平滑肌條張力達到3.0g，後累積加入供試藥物人參總皂甙水解組合物，人參皂甙Rg3，控制終濃度為50、100、200、400、800、1600ng/ml，空白對照加同溶劑濃度的Cremophorel，給藥間隔為5min，每個實驗濃度進行3個標本重複，取平均值，計算基底動脈平滑肌條舒張率。
舒張率(％)＝100×(前負荷-實際張力)/前負荷。
3實驗結果，見表3。
表3人參總皂甙水解組合物及人參皂甙Rg3的舒張血管作用
4結論人參總皂甙水解組合物及人參皂甙Rg3均具有顯著的劑量依賴性舒張血管平滑肌的作用，起效濃度＜5μg/ml。人參總皂甙水解組合物較人參皂甙Rg3作用稍弱，但組間比較差異不顯著(P＞0.05)。
實驗三對腦皮層神經細胞的保護作用1材料1.1藥品與試劑人參總皂甙水解組合物與人參皂甙Rg3自製，HPLC檢測含人參皂甙Rh213.8％，Rg332.1％，人參皂甙Rh2為自製，含量為92.7％，人參皂甙Rg3為自製，HPLC檢測含量為95.34％。先用60％乙醇溶解為20mg·ml-1，再用雙蒸水配製濃度為2mg·ml-1受試溶液。氯酯醒(meclofenoxane，MEC)，雙蒸水溶解。上述三種藥物均以微孔濾膜除菌過濾，4℃冰箱保存備用。實驗時以DMEM培養液稀釋至所需濃度。DMEM培養基及馬血清。連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)。葡萄糖氧化酶。硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)。咖啡因(caffeine，Caf)、NMDA(N-methyl-D-aspartate)。多聚賴氨酸。胰蛋白酶。
1.2動物Wister乳鼠，1～2日齡。
2方法2.1原代大鼠乳鼠腦皮層神經細胞的製備及培養取Wister大鼠乳鼠數隻，常規消毒頭頸部，解剖大腦，分離出腦皮層，Hank’s液洗滌3次，剪碎成1mm3小塊，置0.25％胰酶中，37℃消化1h，吸棄消化液，Hank’s液洗滌3次，滴管吹打至細胞分散。用DMEM生長液(含10％馬血清，10％小牛血清)調整細胞濃度為1×106ml-1，將細胞懸液加至用0.01％多聚賴氨酸浸泡過夜的96孔細胞培養板中，37℃，5％CO2溫箱中培養，每周換液2次。培養至第7天，換含10μmol/L阿糖胞苷的DMEM培養液培養48h，以抑制非神經原細胞增殖，再換成DMEM生長液，繼續培養至11～14d進行實驗。
2.2藥物對實驗模型的保護作用2.2.1藥物對缺糖損傷模型的保護作用不同濃度的人參總皂甙水解組合物、人參皂甙Rg3和氯酯醒(DMEM維持液稀釋)作用細胞24h後，吸棄藥液，加入無糖Earle’s液，作用10h後，換成DMEM維持液，繼續培養18h，觀察實驗結果。實驗同時設損傷模型對照及正常細胞對照。
2.2.2藥物對缺氧損傷模型的保護作用將Na2S2O4乾粉加入DMEM培養液中，使終濃度為5mmol/L，充分攪拌，調整pH為7.2，即為缺氧溶液。缺氧損傷8h造成損傷模型。實驗除設損傷對照及正常對照外，還設非低氧溶液(配製同缺氧溶液，但需放置3d以上)對照，以消除Na2S2O4在水中分解產物的影響。
2.2.3藥物對自由基損傷模型的保護作用含葡萄糖(25mmol/L)-葡萄糖氧化酶(12.5mU/ml)的無血清DMEM培養基，作用3h造成自由基損傷模型。實驗分組及結果觀察同上。
2.2.4藥物對咖啡因損傷模型的保護作用含10mmol/L咖啡因的DMEM培養液作用45min後，造成細胞損傷模型。實驗分組及結果觀察同上。
2.2.5藥物對NO神經毒性損傷模型的保護作用含SNP100μmol/L的DMEM培養液作用細胞10min後，造成NO神經毒性損傷模型。實驗分組及結果觀察同上。
2.2.6藥物對NMDA神經毒性損傷模型的保護作用用無Mg2+Earle’s液洗滌細胞3次，加入含30μmol/L的NMDA，0.5μmol/L甘氨酸的無Mg2+Earle’s液，37℃，5％CO2溫箱中作用4h後，吸棄培養上清，Earle’s液洗滌3次，再換成正常維持液，37℃，5％CO2溫箱中繼續培養18h，觀察實驗結果。
2.3觀察指標2.3.1細胞形態倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞形態。
2.3.2結晶紫活細胞染色模型損傷18h後，吸棄上清，以37℃，pH7.4 PBS洗滌3次，加入0.2％結晶紫溶液(內含0.2％乙醇)染色1min，洗滌6次，加1％SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液100μl/孔，37℃溫育30min，使細胞徹底裂解，用DG3002酶聯檢測儀測定OD值(λ＝630nm)。組間數據進行t檢驗。
3結果3.1培養細胞形態學觀察細胞接種於多聚賴氨酸處理過的細胞培養板，37℃，5％CO2溫箱孵育2h後，倒置顯微鏡觀察鏡下見細胞貼壁，形狀呈圓形，分布均勻。培養48h，細胞逐漸伸出突觸。d4，細胞大多伸展，突觸相互交織成網狀，胞體呈梭形，三角形。培養至d11，細胞生長成單層。
3.2藥物對實驗模型的保護作用3.2.1藥物對損傷模型中結晶紫染色活細胞吸光度的影響存活細胞吸收結晶紫著色，通過測量染色活細胞在630nm波長處的吸光度，可計算存活神經細胞的比值，結果見表4。
表4對原代培養的大腦皮層神經細胞缺血損傷的保護作用(OD值)(n=10，
表4結果顯示與正常細胞組相比，六種腦缺血樣損傷模犁組細胞的OD值有極顯著降低，表明活細胞數顯著減少。加入藥物保護後，可明顯提高損傷細胞的OD值，相應的存活細胞數增加。某些組別中藥物的量效關係不明顯，可能是由於進行原代細胞培養時，個別培養孔中殘存的其它非皮層神經細胞量的差異所致。
3.2.2藥物對腦缺血模型中損傷細胞形態的影響倒置顯微鏡下觀察在各類缺血性損傷模型中，神經細胞均出明顯的細胞病變，表現為胞體腫脹，折光性減弱，突觸斷裂，呈拉網狀，最終細胞圓縮，脫落。細胞加藥保護後，細胞損傷明顯減輕，細胞形態基本保持完整，僅見部分突觸斷裂、胞體略有腫脹等現象。
4討論腦缺血最初過程為神經細胞能量供應缺乏，藥物是否具有保護作用，可通過缺氧和缺糖損傷模型進行驗證。實驗證實人參總皂甙水解組合物對這兩種細胞損傷模型具有不同程度的保護。
自由基、NO和NMDA所致神經細胞損傷模型可模擬腦缺血損傷的具體過程，高濃度Caf也導致細胞內鈣釋放，從而引起神經細胞死亡。以上模型從不同方面反映出腦缺血損傷過程中，由於細胞缺氧導致鈣內流，同時受損細胞器內的鈣離子釋放，使鈣離子濃度上升，出現Ca2+超載而致細胞死亡。實驗發現人參總皂甙水解組合物能抑制氧自由基損傷過程，對NO-氧自由基損傷途徑同樣發揮抑制作用，尤其對Caf導致的Ca2+大量釋放所致細胞死亡表現出非常顯著的保護作用。推測人參總皂甙水解組合物抗氧自由基的作用可能與增強超氧化物歧化酶作用相關。NMDA受體激活後可引起受體型鈣通道開放，刺激Ca2+內流，引起鈣超載。同時激活誘導型一氧化氮合成酶產生NO，進一步損傷細胞。人參總皂甙水解組合物對此類模型的保護作用提示其作用機理可能是直接抑制了NMDA受體依賴性的鈣通道。
實驗四對免疫系統的作用1實驗材料藥物與試劑人參總皂甙水解組合物自製，HPLC檢測含人參皂甙Rh213.8％，Rg332.1％；5-FU；CTX；印度墨汁(1∶10)；RPMI1640；吩嗪二甲酯硫酸鹽；硝基氯化四氮唑鹽；氧化型輔酶。
動物昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄兼用；補體，3隻豚鼠的新鮮血清1∶10稀釋。
儀器設備DG3022A型酶聯免疫檢測儀，紫外分光光度計，CO2培養箱，分析天平，超淨工作檯。
2方法及結果2.1對碳粒廓清速率的影響將50隻小鼠雌雄分開，隨機分為5組，每組10隻，實驗組分三個劑量連續給人參總皂甙水解組合物，對照組給5-FU8d後，尾靜脈注射印度墨汁每隻100μl，於1min和5min後，分別眼眶取血，於680nm處測定吸收值，計算廓清指數。結果表明3個劑量組呈劑量依賴性明顯增加碳粒廓清速率(表5)。
廓清指數(K)＝(IgA1-IgA5)/(ts-t1)表5人參總皂甙水解物對小鼠碳粒廓清速率的影響(n＝10)
*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，與空白對照比較。
2.2對荷瘤鼠免疫器官重量的影響50隻小鼠雌雄分開，隨機分為5組，每組10隻。接種癌細胞S180細胞懸液0.2ml/只，次日實驗組分三個劑量連續給人參總皂甙水解組合物，對照組給5-FU，8d後解剖，取出脾臟和胸腺，稱重，計算10g體重的臟器mg重，結果人參總皂甙水解組合物3個劑量組可使荷瘤小鼠脾臟和胸腺的重量明顯的增加。
表6人參總皂甙水解組合物對臟器係數的影響(n＝10)
*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，與空白對照比較。
2.3對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響選擇KM種小鼠50隻，雌雄各半隨機分5組，每組10隻。實驗組分三個劑量給人參總皂甙水解組合物，對照組給CTX，連續給藥8d後，解剖取脾臟，製成脾細胞懸液，加入96孔細胞培養板中，每孔100μl，再加入PHA100μl，放置5％CO2，37℃培養箱中，48h後棄上清液加入MTT10μl，放置37℃，5％CO2孵箱內反應2h，每孔加入酸化異丙醇100μl，振蕩溶解，置酶標光度計570nm處測定OD值，結果表明，三個劑量組均能刺激淋巴細胞的增殖，結果見表7。
表7人參總皂甙水解組合物對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響(n＝10)
*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，與空白對照比較。
2.4對小鼠體液免疫功能的影響本實驗採用血清溶血素分光光度法，測定血清中溶血素含量。首先將小鼠用5％綿羊紅細胞腹腔注射0.2ml免疫，同時開始給藥，實驗組分三個劑量給人參總皂甙水解組合物，對照組給5-FU，4d後摘眼球取血，分離血清，稀釋500倍，再加0.5mlSRBC，在補體的作用下，37℃反應10min，離心取上清液，加都氏液，於540nm測定OD值，結果表明三個劑量組均能促進小鼠血清中溶血素生成，提高體液免疫功能。
HC50＝(給藥組OD值/SRBC半數溶血OD值)×500表8人參總皂甙水解組合物對小鼠體液免疫功能的影響(n＝10)
*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，與空白對照比較。
2.5對荷瘤鼠NK活性的影響選擇KM小鼠，分三個劑量給人參總皂甙水解組合物，給藥8d後取脾臟，製成脾細胞懸液，按效應細胞和靶細胞10∶1比例各加100μl置96孔培養板上，於5％CO2，37℃共孵24h，吸上清液100μl，加底物100μl，反應5min，加0.1mol/L檸檬酸50μl置酶標光度計570nm處測定OD值，計算NK活性，結果表明，三個劑量均能提高NK細胞活性結果見表9。
NK(％)＝(實驗管OD-自然釋放OD)/(最大釋放管OD-自然釋放管OD)×100％表9人參總皂甙水解組合物對荷瘤鼠NK活性的影響(n＝10)
P＞0.05，P＜0.05，P＜0.01，與空白對照比較。
實驗五抗疲勞作用1、材料和方法1.1試藥人參總皂甙水解組合物，自製，HPLC檢測含人參皂甙Rh213.8％，Rg332.1％。
1.2實驗動物18～22g的雄性昆明種小白鼠。
1.3劑量三批動物，每批60隻，分別做遊泳試驗、血清尿素氮和肝糖原試驗。每批小鼠隨機分為4組，每組15隻，空白對照組給予N.S，人參總皂甙水解組合物低、中、高劑量組的給藥劑量分別為200、600、1800μg/kg，每天一次。
1.4主要儀器與試劑全自動生化分析儀；超微量半自動生化分析儀；乳酸鹽分析儀；50×50×40cm3方形有機玻璃遊泳箱，自製；電子天平；手持式多功能粉碎器；尿素氮試劑盒。
1.5實驗方法1.5.1負重遊泳實驗小鼠於末次給予人參總皂甙水解組合物30分鐘後，使尾部負重5％體重的鉛皮，在水深30cm、水溫25℃的遊泳箱中遊泳，記錄小鼠自遊泳開始至死亡的時間。
1.5.2血清尿素氮測定小鼠於末次給予人參總皂甙水解組合物30分鐘後，在水深30cm、水溫30℃的遊泳箱中不負重遊泳90分鐘，休息30分鐘後，眼眶靜脈叢取血約0.5ml。待血液凝固離心，取血清測定尿素氮含量。
1.5.3肝糖原測定小鼠於末次給予人參總皂甙水解組合物30分鐘後，立即頸椎脫臼處死取出肝臟，經生理鹽水空白漂洗，濾紙吸乾，精確稱取肝臟100mg於試管內，加入8ml三氯醋酸勻漿1分鐘，3000r離心15分鐘。取上清液於另1支試管內，用蒽酮法測定肝糖原含量。
2結果2.1人參總皂甙水解組合物對小鼠負重遊泳時間的影響表10人參總皂甙水解組合物對小鼠負重遊泳時間的影響
由表10可見，人參總皂甙水解組合物低、中、高三個劑量組小鼠負重遊泳時間均明顯長於空白對照組，組間比較，差異具有顯著性意義(P＜0.05)，提示人參總皂甙水解組合物能明顯延長小鼠負重遊泳時間，增強小鼠耐疲勞的能力。
2.2人參總皂甙水解組合物對小鼠血清尿素氮的影響表11人參總皂甙水解組合物對小鼠運動時血清尿素氮的影響
由表11可見，人參總皂甙水解組合物低、中、高三個劑量組小鼠運動時血清尿素氮水平均低於與空白對照組，差異有顯著性意義(P＜0.05)，提示本試驗條件下人參總皂甙水解組合物能降低運動時小鼠血清尿素氮。
2.3人參總皂甙水解組合物對小鼠肝糖原含量的影響表12人參總皂甙水解組合物對小鼠肝糖原含量的影響
由表12可見，人參總皂甙水解組合物中、高劑量組肝糖原含量明顯高於空白對照組，差異有顯著性意義(P＜0.05)，提示人參總皂甙水解組合物能增加小鼠肝糖原的含量。
具體實施例方式
本發明以下引用實施例進一步說明，但所引用實施例並不對本發明涵蓋範圍形成限制。
實施例1稱取人參皂甙粉末200g，用3.0mol/L稀醋酸12000ml充分分散，置反應器中加熱至120℃，保持反應器內壓力為7.0MPa，水解40分鐘，急速降溫至28℃後用40％氫氧化鈉溶液將水解液中和，過濾，將固形物收集乾燥，即得含有稀有人參皂甙G-Rh2和G-Rg3的組合物。組合物得率為41.2％，組合物中G-Rh2含量為11.2％，G-Rg3含量27.6％。取該組合物40g研細，過100目篩，加入過100目篩的蔗糖粉600g，乳糖1200g，微晶纖維素150g，香蘭素10g，混合均勻，用適量的10％澱粉漿制粒，乾燥，分裝為1000份，製成顆粒劑型藥物或功能性食品。
實施例2稱取三七葉甙粉末200g，用0.5mol/L稀鹽酸10000ml充分分散，置反應器中加熱至90℃，保持反應器內壓力為2.0MPa，水解120分鐘，急速降溫至28℃後用40％氫氧化鈉溶液將水解液中和，過濾，將固形物收集乾燥，即得含有稀有人參皂甙G-Rh2和G-Rg3的組合物。組合物得率為33.2％，組合物中G-Rh2含量為9.1％，G-Rg3含量22.8％。取該組合物38g，研細，過80目篩，加入藥用澱粉200g，用10％澱粉漿制粒，乾燥，整粒後，加入3g硬脂酸鎂，混合均勻，填充入1#膠囊，製得1000粒，製成膠囊劑藥物或功能性食品，。
實施例3稱取西洋參總甙粉末200g，用1.0mol/L稀檸檬酸15000ml充分分散，置反應器中加熱至135℃，保持反應器內壓力為4.0MPa，水解270分鐘，急速降溫至28℃後用40％氫氧化鈉溶液將水解液中和，過濾，將固形物收集乾燥，即得含有稀有人參皂甙G-Rh2和G-Rg3的組合物。組合物得率為40.5％，組合物中G-Rh2含量為11.9％，G-Rg3含量32.6％。取該組合物27g，研細，過100目篩，加入澱粉40g，乳糖75g，微晶纖維素8g，交聯羧甲基纖維素2.5g混合，用適量的3％羧甲基纖維素溶液制粒，乾燥，整粒，加入1.5g硬酯酸鎂，2g微粉矽膠混合均勻，用8mm衝模，壓製成1000片素片。
如將上述素片作為片芯，在高效包衣機中用LE薄膜包衣劑(胃溶型或腸溶型)包衣，即可得薄膜衣片或腸溶片1000片，製成片劑藥物或功能性食品。
實施例4稱取絞股藍總甙粉末200g，用0.5mol/L稀硫酸12000ml充分分散，置反應器中加熱至90℃，保持反應器內壓力為2.0MPa，水解120分鐘，急速降溫至28℃後用40％氫氧化鈉溶液將水解液中和，過濾，將固形物收集乾燥，即得含有稀有人參皂甙G-Rh2和G-Rg3的組合物。組合物得率為23.7％，組合物中G-Rh2含量為9.4％，G-Rg3含量18.3％。取該組合物43g，研細，過120目篩，加入低取代羥丙基纖維素20g，可溶性澱粉80g，乳糖100g，甜葉菊甙4g，混合均勻。另取聚乙烯吡咯烷酮5g，用適量40％乙醇製成漿狀，將混合藥粉製成80目的顆粒，整粒，乾燥，加入硬酯酸鎂2g，混勻，用12mm衝模，壓製成1000片分散片。
實施例5分別稱取人參皂甙G-Rh2含量31.55％的混合皂甙43g，人參皂甙G-Rg3含量45.62％的混合皂甙57g，置混合器中混合45分鐘，即得含有稀有人參皂甙G-Rh2和G-Rg3的組合物。組合物中G-Rh2含量為13.57％，G-Rg3含量26.0％。按照常規工藝製成藥物或功能性食品。
權利要求
1.一種含稀有人參皂甙的組合物，其特徵在於組合物中人參皂甙Rh2和Rg3的總含量為重量百分比5％～49.9％，人參皂甙Rh2與Rg3兩組分間的相對重量比例人參皂甙Rh2∶人參皂甙Rg3為1∶0.1～8。
2.如權利要求1所述的含稀有人參皂甙的組合物，其特徵在於組合物中人參皂甙Rh2和Rg3的總含量為重量百分比20％～49.9％。
3.如權利要求1所述的含稀有人參皂甙的組合物的製備方法，其特徵在於以人參總皂甙為起始原料，在水系溶劑系統中，在0.01～10mol/L酸濃度及40℃～160℃、常壓～1.5MPa條件下，進行人參總皂甙水解20分鐘～960分鐘，降溫至28℃以下，加鹼中和至PH值為中性，沉澱，去除母液，沉澱物乾燥直接獲取含有稀有人參皂甙Rh2和Rg3總含量為5％～49.9％的組合物。
4.如權利要求3所述的含稀有人參皂甙的組合物的製備方法，其特徵在於所述的人參總皂甙中皂甙含量範圍為重量百分比20％～99％。
5.如權利要求3所述的含稀有人參皂甙的組合物的製備方法，其特徵在於所述的溫度為90℃～130℃。
6.如權利要求3所述的含稀有人參皂甙的組合物的製備方法，其特徵在於所述的壓力為0.05～0.8Mpa。
7.如權利要求3所述的含稀有人參皂甙的組合物的製備方法，其特徵在於所述的水解時間為30～270分鐘。
8.如權利要求3所述的含稀有人參皂甙的組合物的製備方法，其特徵在於所述酸的濃度為0.08～4mol/L。
9.如權利要求3所述的含稀有人參皂甙的組合物的製備方法，其特徵在於所述的酸為鹽酸、乙酸、磷酸、硫酸、冰醋酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、三氟乙酸、二氟乙酸、一氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一種或二種以上。
10.權利要求1或2所述的含稀有人參皂甙的組合物在製備治療神經細胞損傷性疾病的藥物中的應用。
11.權利要求1或2所述的含稀有人參皂甙的組合物在製備治療心腦血管疾病的藥物中的應用。
12.權利要求1或2所述的含稀有人參皂甙的組合物在製備治療實體性惡性腫瘤疾病的藥物中的應用。
13.權利要求1或2所述的含稀有人參皂甙的組合物在製備治療抗衰老、抗疲勞的藥物中的應用。
14.權利要求1或2所述的含稀有人參皂甙的組合物在製備功能性食品中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種含有稀有人參皂甙－Rh
文檔編號A61P39/06GK1981776SQ20051004869
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月15日 優先權日2005年12月15日
發明者劉學系, 韓穎, 王曙彩, 王娟, 陳錫強, 高心湘 申請人:昆明維泰爾健康科技有限責任公司