對大腸桿菌o41的o－抗原特異的核苷酸的製作方法

2023-06-07 15:30:21

專利名稱：對大腸桿菌o41的o－抗原特異的核苷酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及大腸桿菌O41(Escherichia coli O41)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及大腸桿菌O41中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對O-抗原特異的寡核苷酸快速、準確地檢測人體及環境中的大腸桿菌O41並鑑定這些致病菌中的O-抗原。
背景技術：
位於大腸桿菌表面的脂多糖是大腸桿菌致病的誘因，而O-抗原是脂多糖最外層結構，是免疫系統識別的目標和噬菌體吸附的位點。O-抗原的缺失會造成許多病原體的血清敏感，或者嚴重削弱病原體的毒力[Frank etal(1987)「The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria」.Rev Infect Dis 1771750-1753.Pluschke G et al「Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18K1Escherichia coli tocomplement-mediated king」.J Bacteriol 42907-913]。大腸桿菌是一個種，種內的菌株一般通過O-抗原和H-抗原(有時通過K-抗原)來鑑定。其中O-抗原具有高度多樣性，大腸桿菌有166種不同的O-抗原，O-抗原的變化可能是大腸桿菌的起源和維持其多樣性的主要原因[Reeves，P.R(1992)「Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations」.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]。
O-抗原是革蘭氏陰性細菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重複的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉移酶將核苷二磷酸單糖轉移到一個固定在細胞內膜的脂分子上，然後在內膜的內側合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過o-抗原轉運酶被轉移到內膜外側，而後通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)「Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens」.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)「Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria」.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。編碼負責O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)「Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature」Trends in Microbiology，4495-503]。在大腸桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位於galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)「Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships」.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)「The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved」.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉移酶基因，寡糖單位處理基因，其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括o-抗原轉運酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉移到細菌內膜外側，再聚合成多糖。糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因只存在於攜帶這些基因的基因簇裡。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯結鍵的不同和寡糖單位之間聯結鍵的不同構成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯結鍵及寡糖單位之間的聯結鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因為O-抗原是極強的抗原，是大腸桿菌重要的致病因素之一，同時它又具有極強的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準確地檢測大腸桿菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標的血清學免疫反應自上世紀30年代以來一直被用於對細菌的分型和鑑定，是鑑定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數量不足，大量的抗血清在製備和儲存中也存在一些困難。另一方面此法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準確性差，所以，現在普遍認為這種傳統的血清學檢測方法將為現代分子生物學方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑑定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)「Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)」，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應於沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列後得到對不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用對E.coli O111的O-抗原特異的源於wbdI基因的寡核苷酸鑑定了一株產毒素的E.coli O111的血清型[「Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli」.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是後來的研究表明Paton，A.W et.al的用源於wbdI基因的寡核苷酸鑑定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結果出現。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認為，這是由於wbdI基因是一個推測的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)「Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111」.Gene 16417-23]，而在其它細菌的O-抗原的結構中也可能有這個糖，所以糖合成路徑基因對於O-抗原並不是高度特異的。

發明內容
本發明的目的是提供了一種對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸。它是大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源於o-抗原轉運酶基因、聚合酶基因及糖基轉移酶基因的特異的核苷酸。
本發明的另一個目的是提供了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列。
本發明的次一目的是提供了構成大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的基因轉運酶基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因；糖合成路徑基因，包括gmd，fcl，gmm，manC，manB。它們在O-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本發明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源於大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中編碼轉運酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源於編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；源於編碼糖基轉移酶的基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。它們是上述基因內的寡核苷酸，長度在10-20nt；它們對大腸桿菌O41的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的源於編碼轉運酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它們對大腸桿菌O41的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合後的寡核苷酸對大腸桿菌O41的O-抗原也是高度特異的。
本發明的還一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用於核酸擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列，從而通過這些方法來檢測和鑑定大腸桿菌O41的O-抗原及檢測和鑑定大腸桿菌O41。
本發明的再一目的是提供了分離大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細菌的基因簇的全序列。
本發明的目的是由以下技術方案實現的。
本發明對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，其是如SEQID NO1所示的分離的核苷酸，全長15377個鹼基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O41型的O-抗原特異的核苷酸，其中包括命名為wzx，orf2，orf3，wzy，orf5，orf6，gmd，fcl，gmm，manC，orf11，manB的12個基因組成，都位於galF基因和gnd基因之間。
前述的對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，所述基因中具有高度特異性的基因包括轉運酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。其中所述的轉運酶基因是SEQ ID NO1中的1114至2433鹼基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ IDNO1中的4649至5845鹼基的核苷酸；所述的orf2基因是SEQ ID NO1中的2433至3362鹼基的核苷酸；orf3基因是SEQ ID NO1中的3374至4630鹼基的核苷酸；orf5基因是SEQ ID NO1中的5842至6591鹼基的核苷酸；orf6基因是SEQ ID NO1中的6588至7445鹼基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，其還包括源於所述的wzx基因或wzy基因或糖基轉移酶基因的寡核苷酸；以及它們的混合或它們的重組。
前述的對大腸桿菌O41的O-抗原高度特異的核苷酸，其特徵在於，所述的源於wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的1805至1822鹼基的核苷酸和2393至2410鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1510至1527鹼基的核苷酸和2106至2123鹼基的核苷酸；所述的源於wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5012至5029鹼基的核苷酸和5406至5389鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5272至5289鹼基的核苷酸和5645至5662鹼基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O41型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達O-抗原的細菌、鑑定細菌的O-抗原和細菌的其它多糖抗原中的應用。
前述的對大腸桿菌O41型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達而提供表達大腸桿菌O41型的O-抗原，以及製備細菌疫苗中的應用。
前述的對大腸桿菌O41型的O-抗原特異的核苷酸的應用，其特徵在於，它作為引物用於PCR、作為探針用於雜交反應與螢光檢測、或者用於製造基因晶片或微陣列，供檢測細菌的應用。
前述的對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特徵在於，包括下述步驟(1)基因組的提取在培養基中培養大腸桿菌O41型，離心收集細胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增大腸桿菌O41型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O41型的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合併該long PCR產物，並用DNA純化試劑盒純化PCR產物；(3)構建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產物應用鳥槍法構建O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實驗室常用的DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進行測序，序列達到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應用生物信息學軟體拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O41型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O41型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設計引物；在每個基因內各設計了兩對引物，每對引物分布在相應基因內的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，確定wzx、wzy基因對大腸桿菌O41型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測培養大腸桿菌O41，細菌計數後分別將5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養基，取一些與樣品混合過的LB培養基過濾，將過濾液進行培養，從培養好的菌液中取數毫升處理後作為PCR模板用寡核苷酸進行PCR反應，檢測其對大腸桿菌O41的靈敏度。
前述的對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特徵在於，包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養基中37℃過夜培養大腸桿菌O41，離心收集細胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然後加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之後加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘餘的酚，上清液用2倍體積乙醇沉澱DNA，用玻璃絲卷出DNA並用70％乙醇洗DNA，最後將DNA重懸於30ul TE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增大腸桿菌O41中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O41的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇；首先根據經常發現於O-抗原基因簇上遊的galF基因設計上遊引物(5』-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3』)，再根據O-抗原基因簇下遊的gnd基因設計下遊引物(5』-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3』)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法擴增O-抗原基因簇，PCR反應程序如下在94℃預變性2分鐘，然後94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進行30個循環；最後，在68℃繼續延伸7分鐘，得到PCR產物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性；合併6管long PCR產物，並用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產物；(3)構建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構建O-抗原基因簇文庫；反應體系是300ng PCR純化產物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應在室溫中進行；酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而後加入2ul 0.1M EDTA終止反應；合併4管同樣的反應體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次後，用2.5倍體積的無水乙醇沉澱DNA，並用70％乙醇洗沉澱，最後重懸於18ul水中；隨後在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃反應30分鐘，將酶切產物補成平端，75℃終止反應後，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應的緩衝液並將體系擴大為80ul，70℃反應20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液抽提和等體積乙醚抽提後與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體於16℃連接24小時，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶；最後用1/10體積的3MNaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉澱連接混合物，再用70％乙醇洗沉澱，乾燥後溶於30ul水中得到連接產物；用Bio-Rad公司的電轉化感受態細胞的製備方法製備感受態大腸桿菌DH5α細胞，取2-3ul連接產物與50ul感受態大腸桿菌DH5α混合後，轉到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊後立即在杯中加入1ml的SOC培養基使菌復甦，然後將菌塗在含有氨苄青黴素、X-Gal和IPTG的LB固體培養基上37℃過夜培養，次日得到藍白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨苄青黴素的LB固體培養基上培養，同時從每個克隆中提取質粒並用EcoRI酶切鑑定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構成了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的100個克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進行測序，使序列達到80％的覆蓋率，再通過將相聯繫的序列進行反向測序及測通得到剩餘20％的序列，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學實驗室出版的Staden package軟體包的Pregap4和Gap4軟體拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列，序列的質量主要由兩個方面來保證1)對大腸桿菌O41的基因組作6個Long PCR反應，然後混合這些產物以產生文庫。2)對每個鹼基，保證3個以上高質量的覆蓋率；在得到大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸序列後，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發現基因，找到12個開放的閱讀框，用blast系列軟體與GenBank中的基因比較以發現這些開放的閱讀框的功能並確定它們是什麼基因，再用英國sanger中心的Artemis軟體完成基因注釋，用Clustral W軟體做DNA和蛋白質序列間的精確比對，最後得到大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的結構；
(6)特異基因篩選針對大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因設計引物；在每個基因內各設計兩對引物，每對引物分布在相應基因內不同地方以確保其特異性；用這些引物以166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌基因組為模板進行PCR，所有引物在大腸桿菌O41中得到陽性結果，在其他組中沒有擴增到任何大小正確的帶，也就是，在大多數組中沒有得到任何PCR產物帶，雖在少數組中得到PCR產物帶，但其大小不符合預期大小，所以wzx、wzy基因對大腸桿菌O41及其O-抗原都是高度特異的。
(7)引物靈敏度的檢測將大腸桿菌O41的凍存菌液接種到有LB培養基的三角瓶中，30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時至飽和，取培養好的菌液稀釋，取稀釋菌液塗布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養數小時計數，計算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌，攪拌均勻，加入LB培養基，過濾，過濾液於30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時；從培養好的菌液中取數ml於6,000g離心數分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉澱並混勻，放入100℃沸水中煮數分鐘，裂解液於12,000g離心數分鐘，取上清做為PCR模板；用4對寡核苷酸對，SEQ ID NO1中的1805至1822鹼基的核苷酸和2393至2410鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1510至1527鹼基的核苷酸和2106至2123鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5012至5029鹼基的核苷酸和5406至5389鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5272至5289鹼基的核苷酸和5645至5662鹼基的核苷酸進行PCR反應，PCR反應體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個循環；反應結束後，取10μl反應產物電泳，若有與預期大小相符的擴增帶，則結果為陽性，若沒有，則結果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個活菌的每份豬肉餡均在4對引物的PCR反應中得到陽性結果；參入0個活菌的豬肉餡在4對引物的PCR反應中得到陰性結果；說明使用上述方法時，這4對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O41的檢測靈敏度均為0.25個菌/g。
也就是，本發明的第一個方面，提供了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長15377個鹼基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發明的方法得到了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的結構，如表3所述，它包括命名為wzx，orf2，orf3，wzy，orf5，orf6，gmd，fcl，gmm，manC，orf11，manB的12個基因組成，都位於galF基因和gnd基因之間。
本發明的第二個方面，提供了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中的基因，即轉運酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因；細菌多糖抗原中特殊的糖合成路徑基因，包括gmd，fcl，gmm，manC，manB。它們在O-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。本發明尤其涉及到o-抗原轉運酶基因和聚合酶基因，因為糖合成路徑基因即合成核苷二磷酸單糖的基因現在被預示對較多胞外多糖是常見的、共同的，對細菌的O-抗原並不是特異的，而本發明涉及到的o-抗原轉運酶基因、聚合酶基因和糖基轉移酶基因對大腸桿菌O41的O-抗原是特異的。
本發明的第三個方面，提供了源於大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中的wzy基因或與wzy有相似功能的基因和wzx基因或與wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基轉移酶基因包括orf2、orf3、orf5、orf6基因的寡核苷酸，它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優先被用的是列於表1中源於大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中的wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸對。在表1中也列出了這些寡核苷酸對在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應的產物的大小，這些PCR反應可用表中的退火溫度進行。這些引物只在以大腸桿菌O41為模板進行的PCR擴增中得到預期大小的產物，而在以表2所列的其它菌為模板進行的PCR擴增中都未得到預期大小的產物。更詳細地說，以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應在大多數細菌中均未得到任何產物，所以，可以確定這些引物即表1所列的寡核苷酸對大腸桿菌O41及它們的O-抗原是高度特異的。
所述的對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟1)基因組的提取；2)PCR擴增大腸桿菌O41中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文庫的構建；4)對文庫中的克隆測序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最終獲得O-抗原基因簇的結構；6)特異基因的篩選；7)引物靈敏度的檢測。
本發明的其他方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
如本發明所述，「寡核苷酸」主要是指來源於O-抗原基因簇中的編碼轉運酶的基因、編碼聚合酶的基因和編碼糖基轉移酶基因內的一段核苷酸分子，它們在長度上可改變，一般在10到20個核苷酸範圍內改變。尤其是源於wzx基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的1114至2433鹼基)，wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的4649至5845鹼基)內的寡核苷酸對大腸桿菌O41都是高度特異的。
此外，有時兩個遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產生新的O-抗原，從而產生新的細菌類型，新的突變株。在這種環境中，需要篩選出多對寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測的特異性。因此，本發明提供了一整套多對寡核苷酸的混合物，它們源於轉運酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源於聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；源於糖基轉移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。這些基因的混合物對一個特殊的細菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對這個細菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是源於轉運酶基因、源於聚合酶基因和源於糖基轉移酶基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發明涉及寡核苷酸的鑑定，它們可以用於檢測表達O-抗原的細菌和在診斷中鑑定細菌的O-抗原。
本發明涉及到一種檢測食品中的一個或多個細菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉運酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因(ii)編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因。(iii)編碼糖基轉移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細菌是大腸桿菌O41。可用PCR方法檢測，更可以將本發明方法中的核苷酸標記後作為探針通過雜交反應如southern-blot或螢光檢測，或者通過基因晶片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
本發明者考慮到以下情況當單個的特異的寡核苷酸檢測無效時，寡核苷酸的混合物能與靶區域特異性雜交以檢測樣品。因此本發明提供了一套寡核苷酸用於本發明所述的檢測方法。這裡所說的寡核苷酸是指源於編碼轉運酶基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、編碼聚合酶的基因包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和編碼糖基轉移酶基因包括orf2、orf3、orf5、orf6基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對一個特殊的細菌的O-抗原來說是特異的，這一特殊的細菌O-抗原是由大腸桿菌O41表達的。
另一方面，本發明涉及到一種檢測排洩物中的一個或多個細菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉運酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因(ii)編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因(iii)編碼糖基轉移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交。這些細菌是大腸桿菌O41。可用本發明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發明中的寡核苷酸分子標記後作為探針通過雜交反應如southern-blot或螢光檢測，或者通過基因晶片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
一般一對寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個寡核苷酸可雜交於非特異性區域。因此，當特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時，至少能選出一對寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當一個特殊的基因簇中所有基因都獨一無二時，此方法也能應用於識別此基因簇內的基因混合物的核苷酸分子。因此本發明提供了一整套用於檢測本發明方法的多對寡核苷酸，在這裡多對寡核苷酸是源於編碼轉運酶的基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源於編碼聚合酶的基因包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；源於編碼糖基轉移酶的基因包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。這套寡核苷酸對一個特殊的細菌多糖來說是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發明也涉及到一種檢測源於病人的樣品中的一個或多個細菌多糖抗原的方法。樣品中的一個或多個細菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個基因中的一對寡核苷酸中的一個特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉運酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因(ii)編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因(iii)編碼糖基轉移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與樣品中的至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細菌是大腸桿菌O41。可用本發明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發明中的寡核苷酸標記後作為探針通過雜交反應，或者通過基因晶片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
更詳細地說，以上描述的方法可以理解為當寡核苷酸對被使用時，其中的一個寡核苷酸分子能雜交到一個並不是來源於wzx基因或與wzx有相似功能的基因及wzy基因或與wzy有相似功能的基因和糖基轉移酶基因包括orf2、orf3、orf5、orf6基因的序列上。此外，當兩個寡核苷酸都能雜交上時，它們可能雜交於同一基因也可能雜交到不同基因上。也即，當交叉反應出現問題時，可選擇寡核苷酸混合物檢測混合的基因以提供檢測的特異性。
本發明者相信本發明不必限於以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應用於檢測所有表達O-抗原和鑑定O-抗原的細菌。由於O-抗原合成和其他多糖抗原(如細菌胞外抗原)合成之間的相似性，本發明的方法和分子也應用於這些其他的多糖抗原。
本發明首次公開了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的全長序列，而且可從這個未被克隆的全長基因簇的序列中產生重組分子，通過插入表達可產生表達大腸桿菌O41的O-抗原，並成為有用的疫苗。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件。
實施例1基因組的提取。
在5mL的LB培養基中37℃過夜培養大腸桿菌O41，離心收集細胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然後加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之後加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提兩次，取上清液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘餘的酚。上清液用2倍體積乙醇沉澱DNA，用玻璃絲卷出DNA並用70％乙醇洗DNA，最後將DNA重懸於30ul TE中。基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
實施例2通過PCR擴增大腸桿菌O41中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O41的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇。首先根據經常發現於O-抗原基因簇上遊的galF基因設計上遊引物(5』-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3』)，再根據O-抗原基因簇下遊的gnd基因設計下遊引物(5』-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3』)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴增O-抗原基因簇，PCR反應程序如下在94℃預變性2分鐘；然後94℃變性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進行30個循環；最後，在68℃繼續延伸7分鐘，得到PCR產物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性。合併6管long PCR產物，並用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產物。
實施例3構建O-抗原基因簇文庫。
首先是連接產物的獲得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構建O-抗原基因簇文庫。反應體系是300ng PCR純化產物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應在室溫中進行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而後加入2ul 0.1M EDTA終止反應。合併4管同樣的反應體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次後，用2.5倍體積的無水乙醇沉澱DNA，並用70％乙醇洗沉澱，最後重懸於18ul水中。隨後在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃反應30分鐘，將酶切產物補成平端，75℃終止反應後，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應的緩衝液並將體系擴大為80ul，70℃反應20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提後與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體於16℃連接24小時，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最後用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉澱連接混合物，再用70％乙醇洗沉澱，乾燥後溶於30ul水中得到連接產物。
其次是感受態細胞的製備參照Bio-Rad公司提供的方法製備感受態細胞大腸桿菌DH5α。取一環大腸桿菌DH5α單菌落於5ml的LB培養基中，180rpm培養10小時後，取2ml培養物轉接到200ml的LB培養基中，37℃250rpm劇烈振蕩培養到OD600 0.5左右，然後冰浴冷卻20分鐘，於4℃4000rpm離心15分鐘。傾盡上清液，用冷的冰預冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，於4℃4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，於4℃4000rpm離心15分鐘。用冷的冰預冷的10％的甘油懸浮細胞，4℃6000rpm離心10分鐘，棄上清液，最後沉澱用1ml冰預冷的10％的甘油懸浮細胞，即為感受態細胞。將製得的感受態細胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最後是電轉化感受態細胞取2-3ul連接產物與50ul感受態大腸桿菌DH5α混合後，轉到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒-6.0毫秒。電擊後立即在杯中加入1ml的SOC培養基使菌復甦。然後立即將菌塗在含有氨苄青黴素、X-Gal和IPTG的LB固體培養基上37℃倒置過夜培養，次日得到藍白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨苄青黴素的LB固體培養基上培養，同時從每個克隆中提取質粒並用EcpRI酶切鑑定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群構成了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇文庫。
實施例4對文庫中的克隆測序。
從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的100個克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進行測序，使序列達到80％的覆蓋率。剩餘20％的序列再通過反向測序及將有些序列測通得到，最後獲得O-抗原基因簇的所有序列。
實施例5核苷酸序列的拼接及分析。
用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學實驗室出版的Staden package軟體包的Pregap4和Gap4軟體拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質量主要由兩個方面來保證1)對大腸桿菌O41的基因組作6個Long PCR反應，然後混合這些產物以產生文庫。2)對每個鹼基，保證3個以上高質量的覆蓋率。在得到大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸序列後，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發現基因，找到12個開放的閱讀框，用blast系列軟體與GenBank中的基因比較以發現這些開放的閱讀框的功能並確定它們是什麼基因，再用英國sanger中心的Artemis軟體完成基因注釋，用Clustral W軟體做DNA和蛋白質序列間的精確比對，最後得到大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的結構，如表3所示。
通過檢索和比較，發現orf1與Yersinia enterocolitica的O-抗原轉運酶Wzx在426個胺基酸的序列中有32％的相同性，56％的相似性。並且通過Eisenberg等人的算法發現orf1有10個潛在的穿膜區，Wzx蛋白的氨基端有一個大約40個胺基酸的保守基序，所以可以確定orf1是wzx基因，命名為wzx。Orf2與Geobacter sulfurreducens PCA的的糖基轉移酶在274個胺基酸中有28％的相同性，52％的相似性，推測orf2也是一個糖基轉移酶，將orf2暫命名為orf2。Orf3與Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482的糖基轉移酶在416個胺基酸中有33％的相同性，54％的相似性，在genbank中尋找保守的功能域，發現orf3與糖基轉移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue為1.4×e-27，推測orf3也是一個糖基轉移酶，暫命名為orf3。Orf4與Drosophila simulans的O-抗原聚合酶在215個胺基酸的序列中有26％的相同性，47％的相似性。並且通過Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.et al(1984).Analysis of membrane and surface protein seque-nces withthe hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]發現orf4有9個潛在的穿膜區，它與許多Wzy蛋白有相似的二級結構，有一個大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特徵，所以確定orf4是wzy基因，命名為wzy。Orf5與Bacteroides fragilis的糖基轉移酶在218個胺基酸中有31％的相同性，53％的相似性，在genbank中尋找保守的功能域，發現orf5與糖基轉移酶家族2的保守的功能域PF00535的Evalue為2.1×e-27，推測orf5也是一個糖基轉移酶，暫命名為orf5。通過與GenBank中的基因比較沒有找到與Orf6相似的序列，所以不能確定Orf6的功能，暫命名為Orf6。orf7與Yersiniaenterocolitica的Gmd在271個胺基酸中有84％的相同性，93％的相似性，Gmd是一個GDP-mannose-4，6-dehydratase，高度的相同性表明orf7也是gmd基因，命名為gmd。Orf8與Yersinia pseudotuberculosis的GDP-L-fucosesynthetase在320個胺基酸中有76％的相同性，85％的相似性。GDP-L-fucosesynthetase由rmlC基因編碼，較高的相同性表明葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶由fcl基因編碼，高度的相同性表明orf8也是fcl基因，命名為fcl。Orf9與Salmonella typhimurium的GDP-mannose mannosyl hydrolase在148個胺基酸中有53％的相同性，68％的相似性。GDP-mannose mannosyl hydrolase由gmm基因編碼，較高的相同性表明orf9也是gmm基因，命名為gmm。Orf10與Escherichia coli的GDP-mannose pyrophosphorylase在468個胺基酸中有81％的相同性，91％的相似性。GDP-mannose pyrophosphorylase由manC基因編碼，較高的相同性表明orf10也是manC基因，命名為manC。Orf11內有一個終止密碼子，推測它已經失去了功能，暫命名為orf11。Orf12與Shigella boydii的phosphomannomutase在473個胺基酸中有90％的相同性，94％的相似性。phosphomannomutase由manB基因編碼，較高的相同性表明orf12也是manB基因，命名為manB。
實施例6特異基因的篩選針對大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設計引物，這些基因在核苷酸序列中的位置見表1。
在表1中列出了大腸桿菌O41的O抗原基因簇的轉運酶基因、聚合酶基因及它們的相應的功能和大小。在每個基因內，我們各設計了兩對引物，每對引物分布在相應基因內的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每對引物用表中所列的相應的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進行PCR，得到了相應的PCR產物，其大小也列於表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在於所有的大腸桿菌的基因組中且高度保守的一個基因，所以我們根據mdh基因設計了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然後從166種血清型的大腸桿菌中提取基因組，方法如前所述。用這對引物從166種血清型的大腸桿菌的基因組中PCR以鑑定大腸桿菌並檢測其基因組的質量。
表2是用於篩選特異基因的166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測的方便，我們將它們每12-19個菌分為一組，總共13組。它們的來源都列於表中。
在第2組中含有大腸桿菌O41的基因組DNA作為陽性對照。第13組中是不含有大腸桿菌O41的基因組DNA，作為陰性對照。以每組菌做模板，用表1中的每對引物按如下條件做PCR在95℃預變性2分鐘後，95℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(參照表1)，退火時間是50秒，72℃延伸2分鐘，這樣進行30個循環。最後在72℃繼續延伸10分鐘，反應體系是25ul。反應完畢後，取10ulPCR產物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增出的片段。
對於wzx、wzy基因，每個基因都有兩對引物被檢測，每對引物除了在第3組中做PCR後得到了預期大小的正確的一條帶外，在其他組中都沒有擴增到任何大小正確的帶。所以wzx、wzy基因對大腸桿菌O41及其O-抗原都是高度特異的。
最後，通過PCR從大腸桿菌O41中篩選到對大腸桿菌O41的O-抗原高度特異的基因wzx、wzy基因。而這些基因內的任何一段10-20nt的寡核苷酸對大腸桿菌O41的O-抗原是特異的，尤其是上述每個基因中的引物即寡核苷酸對經PCR檢測後證實對大腸桿菌O41是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用於快速準確地檢測人體和環境中的大腸桿菌O41，並能鑑定它們的O-抗原。
實施例7引物靈敏度的檢測。
購買市場上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用。將10μl大腸桿菌O41的凍存菌液接種到有20ml LB培養基的三角瓶中，於37℃，200轉/分，培養12小時至飽和，取少量培養好的菌液作106和107倍的稀釋，其餘的菌液放於4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液塗布LB瓊脂平板，37度，培養12h，對所塗平板計數，計算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養基，經6層紗布過濾，過濾液於37℃，200轉/分，培養12h。從培養好的菌液中取3ml菌液於6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉澱並混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液於12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板。用4對寡核苷酸對，SEQ IDNO1中的1805至1822鹼基的核苷酸和2393至2410鹼基的核苷酸，SEQ IDNO1中的1510至1527鹼基的核苷酸和2106至2123鹼基的核苷酸，SEQ IDNO1中的5012至5029鹼基的核苷酸和5406至5389鹼基的核苷酸，SEQ IDNO1中的5272至5289鹼基的核苷酸和5645至5662鹼基的核苷酸進行PCR反應，PCR反應體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個循環。反應結束後，取10μl反應產物電泳，若有與預期大小相符的擴增帶，則結果為陽性，若沒有，則結果為陰性。參入了5×103，5×102，5×101，和5個活菌的每份豬肉餡均在4對引物的PCR反應中得到陽性結果。參入0個活菌的豬肉餡在4對引物的PCR反應中得到陰性結果。說明使用上述方法時，這4對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O41的檢測靈敏度均為0.25個菌/g。
通過對O抗原基因簇的克隆和在減毒的疫苗菌株中的表達，可以組建重組疫苗。O抗原為最主要的革蘭氏陰性菌的表面抗原，可以引起強烈的免疫反應，是製造重組疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret實驗室成功的將志賀氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙門氏菌Tyziai疫苗菌中表達，動物實驗證明可以引起兔子的免疫反應(Molecular Microbiology1993，7239-252)。中國軍事醫學科學院的小組也在從事與Viret實驗室類似的工作。王磊實驗室在1999年成功的將大腸桿菌O111的O抗原基因簇在沙門氏菌疫苗STM-1中表達，並證明組建成的菌株可以引起小鼠的血液和體液反應(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本發明O41的O抗原特異基因序列可以應用於組建重組疫苗。
根據本發明的對大腸桿菌O41型的O-抗原特異的核苷酸序列(SEQ ID NO1所示)，構造特異核酸探針，將其固定到晶片的載體上製成生物晶片，將要檢測的樣品適當處理後，與生物晶片進行雜交反應，然後利用生物晶片信號分析設備就可以得到樣品中相應的細菌情況。這種大腸桿菌O抗原鑑定的DNA晶片將可以直接用於臨床和其它檢驗場所(如食品加工和生產行業，畜牧獸醫行業海關檢疫等的微生物檢驗)。這種晶片只需要擴大產量，在完全相同的條件下就可以產業化。
表3是大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的結構表，在表中列出了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的結構，共由12個基因組成，每個基因用方框表示，並在方框內寫入基因的名稱。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，它們不屬於O-抗原基因簇，我們只是用它們的一段序列設計引物來擴增O-抗原基因簇的全長序列。
表4是大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準確位置，在每個開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。在細菌中開放閱讀框的起始密碼子有兩個ATG和GTG。
SEQ ID NO1序列(SEQUENCE LISTING)110天津生物晶片有限責任公司120對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸130對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸1601170PatentIn version 3.1210121115377212DNA213Escherichia coli4001attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc atgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgatacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaaatgcg cgttaagcgc120cagctgctgg cggaagtaca atctatttgc ccacctggtg tgaccattat gaacgtgcgt180cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttgtgcg ccagacctgc cattggcgac240aacccatttg tagtggtgct accagacgtt gttatcgacg acgccagcgc tgacccgctg300cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcgt ttcaacgaaa cgggccgcag ccaggttctg360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgag tactccgtca tccagacgaa agaaccgcta420gatcgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag480accctggatt cagacattat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgcaga tatttggccg540gaacttgaac gcactcagcc aggtgcatgg ggacgtattc agctgactga tgccattgcc600gaactggcga aaaaacagtc tgttgatgcc atgctgatga caggtgacag ctatgactgc660ggtaaaaaaa tgggttatat gcaggcattt gtgaagtatg gactacgcaa cctgaaagaa720ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg780atgtaacggt tgataaggaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt840tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt960agcgtttgaa tttttcgggt ttagcgcgag taggtaacgc tcgtaacatc gtagacatgc 1020
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gcagctacct aatcgacatt accaaagaca tcttcactaa aaaagatgaa gacggtaact 14760acctggttga tgtgattctg gatgaagcgg ctaacaaagg taccggtaaa tggaccagcc 14820agagcgcgct ggatctcggt gaaccgctgt cgctgattac cgagtctgtg tttgctcgtt 14880atatctcttc tctgaaagag cagcgcgttg ccgcgtctaa agttctctct ggcccgaaag 14940cacagccagc aggcgacaag actgaattca tcgaaaaagt tcgtcgtgcg ctgtatctgg 15000gcaaaatcgt ttcttacgct cagggcttct ctcagctgcg tgctgcgtct gaagagtaca 15060actgggatct gaattacggc gaaatcgcga agattttccg tgctggttgc atcatccgtg 15120cgcagttcct gcagaaaatc actgatgcat atgccgaaaa tccgcagatc gctaacctgc 15180tgctggctcc gtactttaaa caaatcgccg gtgactacca gcaggcgctg cgcgatgtcg 15240tcgcttatgc agtacagaac ggtatcccgg ttccgacctt cgccgctgcg gttgcctatt 15300acgacagcta ccgtgctgca gtactgcctg cgaacttgat ccaggcacag cgcgactatg 15360acgattgtag ctgcaga 15377表1大腸桿菌041的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR數據產生正PCR的基 基因的 正向引物位置反向引物位置PCR產物確大小退火溫功能因 鹼基位置 長度 電泳帶度的組數(℃)wzx O-抗原1114-2433 1805-1822 2393-2410 605bp 0 60轉運酶1510-1527 2106-2123 613bp 0 58wzy O-抗原4649-5845 5012-5029 5406-5389 377bp 0 58聚合酶5272-5289 5645-5662 390bp 0 60表2 166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源組號 該組中含有的菌株 來源1、野生型大腸桿菌O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，IMVSaO19ab，O20，O21，O22，O23，O242、野生型大腸桿菌O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，IMVSaO36，O37，O38，O40，O41，O42，O433、野生型大腸桿菌O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，IMVSaO57，O58，O60，O61，O62，O534、野生型大腸桿菌O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，IMVSaO79，O80，O81，O82，O83，O68
5、野生型大腸桿菌O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，IMVSaO101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，6、野生型大腸桿菌O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSaO115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O1177、野生型大腸桿菌O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O41，O137， IMVSaO138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O1408、野生型大腸桿菌O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153 b9、野生型大腸桿菌O168，O169，O170，O171，O172，O173， c痢疾志賀氏菌 D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13 d10、鮑氏志賀氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， dB16，B17，B1811、福氏志賀氏菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v4)，F5(v7)，F6， dDS，DR12、野生型大腸桿菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，IMVSaO124，O167，O162，O121，O127，O149，O11913、野生型大腸桿菌 去除大腸桿菌O41的第2組菌為了檢測的方便，每12-19個菌分為一組，總共12組，第13組作為陰性對照a.Institude of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australiab.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.O172和O173來自於Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其餘來自於IMVSd.中國預防醫學科學院流行病學研究所表3是大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的結構表 galFwzxorf2 orf3wzy orf5 orf6 gmdfcl gmmmanC orf11manBgnd1kb＿＿＿表4是大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中的基因的位置表ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ATGCGTCCAA GAACGCGGTC 60GAAAACCACT TCGATACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAAATGCG CGTTAAGCGC120CAGCTGCTGG CGGAAGTACA ATCTATTTGC CCACCTGGTG TGACCATTAT GAACGTGCGT180CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGCG CCAGACCTGC CATTGGCGAC240AACCCATTTG TAGTGGTGCT ACCAGACGTT GTTATCGACG ACGCCAGCGC TGACCCGCTG300CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGT TTCAACGAAA CGGGCCGCAG CCAGGTTCTG360GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAG TACTCCGTCA TCCAGACGAA AGAACCGCTA420GATCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG480ACCCTGGATT CAGACATTAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCAGA TATTTGGCCG540GAACTTGAAC GCACTCAGCC AGGTGCATGG GGACGTATTC AGCTGACTGA TGCCATTGCC600GAACTGGCGA AAAAACAGTC TGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTATGACTGC660GGTAAAAAAA TGGGTTATAT GCAGGCATTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTGAAAGAA720GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG780ATGTAACGGT TGATAAGGAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT840TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG900GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT960AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TAGGTAACGC TCGTAACATC GTAGACATGC1020ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TTAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGTGAAATAT TAATCAATAA1080orf1的起始GAAAAACAGA CGAATAATTT GGCCTGAAAT TTTATGCATA TTAAATTAAA TAAAAATATA 1140
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權利要求
1.一種對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長15377個鹼基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權利要求1所述的對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，其包括命名為wzx，orf2，orf3，wzy，orf5，orf6，gmd，fcl，gmm，manC，orf11，manB的12個基因組成，都位於galF基因和gnd基因之間。
3.按照權利要求2所述的對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，所述基因中具有高度特異性的基因包括轉運酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。其中所述的轉運酶基因是SEQ ID NO1中的1114至2433鹼基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的4649至5845鹼基的核苷酸；所述的orf2基因是SEQ ID NO1中的2433至3362鹼基的核苷酸；orf3基因是SEQ ID NO1中的3374至4630鹼基的核苷酸；orf5基因是SEQ ID NO1中的5842至6591鹼基的核苷酸；orf6基因是SEQ ID NO1中的6588至7445鹼基的核苷酸。
4.按照權利要求1或2所述的對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸，其特徵在於，其還包括源於所述的wzx基因或wzy基因中的寡核苷酸或糖基轉移酶基因；以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權利要求4所述的對大腸桿菌O41的O-抗原高度特異的核苷酸，其特徵在於，所述的源於wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的1805至1822鹼基的核苷酸和2393至2410鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1510至1527鹼基的核苷酸和2106至2123鹼基的核苷酸；所述的源於wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的5012至5029鹼基的核苷酸和5406至5389鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5272至5289鹼基的核苷酸和5645至5662鹼基的核苷酸。
6.權利要求1所述的對大腸桿菌O41型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達O-抗原的細菌、鑑定細菌的O-抗原和細菌的其它多糖抗原中的應用。
7.權利要求1所述的對大腸桿菌O41型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達而提供表達大腸桿菌O41型的O-抗原，以及製備細菌疫苗中的應用。
8.按照權利要求1所述的對大腸桿菌O41型的O-抗原特異的核苷酸的應用，其特徵在於，它作為引物用於PCR、作為探針用於雜交反應與螢光檢測、或者用於製造基因晶片或微陣列，供檢測細菌。
9.權利要求1所述的對大腸桿菌O41型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特徵在於，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養基中培養大腸桿菌O41型，離心收集細胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增大腸桿菌O41型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O41型的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合併該long PCR產物，並用DNA純化試劑盒純化PCR產物；(3)構建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產物應用鳥槍法構建O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實驗室常用的DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進行測序，序列達到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應用生物信息學軟體拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O41型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O41型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因設計引物；在每個基因內各設計了兩對引物，每對引物分布在相應基因內的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，確定wzx、wzy基因對大腸桿菌O41型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測培養大腸桿菌O41，細菌計數後分別將5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養基，取一些與樣品混合過的LB培養基過濾，將過濾液進行培養，從培養好的菌液中取數毫升處理後作為PCR模板用寡核苷酸進行PCR反應，檢測其對大腸桿菌O41的靈敏度。
10.權利要求9所述的對大腸桿菌O41的O-抗原特異的核苷酸的分離和鑑定方法，其特徵在於，包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養基中37℃過夜培養大腸桿菌O41，離心收集細胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然後加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之後加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘餘的酚，上清液用2倍體積乙醇沉澱DNA，用玻璃絲卷出DNA並用70％乙醇洗DNA，最後將DNA重懸於30ul TE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增大腸桿菌O41中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O41的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇；首先根據經常發現於O-抗原基因簇上遊的galF基因設計上遊引物(5』-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3』)，再根據O-抗原基因簇下遊的gnd基因設計下遊引物(5』-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3』)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法擴增O-抗原基因簇，PCR反應程序如下在94℃預變性2分鐘，然後94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進行30個循環；最後，在68℃繼續延伸7分鐘，得到PCR產物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性；合併6管long PCR產物，並用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產物；(3)構建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構建O-抗原基因簇文庫；反應體系是300ng PCR純化產物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應在室溫中進行；酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而後加入2ul 0.1M EDTA終止反應；合併4管同樣的反應體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(2 5∶24∶1)溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次後，用2.5倍體積的無水乙醇沉澱DNA，並用70％乙醇洗沉澱，最後重懸於18ul水中；隨後在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃反應30分鐘，將酶切產物補成平端，75℃終止反應後，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應的緩衝液並將體系擴大為80ul，70℃反應20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液抽提和等體積乙醚抽提後與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體於16℃連接24小時，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶；最後用1/10體積的3MNaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉澱連接混合物，再用70％乙醇洗沉澱，乾燥後溶於30ul水中得到連接產物；用Bio-Rad公司的電轉化感受態細胞的製備方法製備感受態大腸桿菌DH5α細胞，取2-3ul連接產物與50ul感受態大腸桿菌DH5α混合後，轉到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊後立即在杯中加入1ml的SOC培養基使菌復甦，然後將菌塗在含有氨苄青黴素、X-Gal和IPTG的LB固體培養基上37℃過夜培養，次日得到藍白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨苄青黴素的LB固體培養基上培養，同時從每個克隆中提取質粒並用EcoRI酶切鑑定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構成了大腸桿菌O41的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的100個克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進行測序，使序列達到80％的覆蓋率，再通過將相聯繫的序列進行反向測序及測通得到剩餘20％的序列，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學實驗室出版的Staden package軟體包的Pregap4和Gap4軟體拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列，序列的質量主要由兩個方面來保證1)對大腸桿菌O41的基因組作6個Long PCR反應，然後混合這些產物以產生文庫。2)對每個鹼基，保證3個以上高質量的覆蓋率；在得到大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸序列後，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發現基因，找到12個開放的閱讀框，用blast系列軟體與GenBank中的基因比較以發現這些開放的閱讀框的功能並確定它們是什麼基因，再用英國sanger中心的Artemis軟體完成基因注釋，用Clustral W軟體做DNA和蛋白質序列間的精確比對，最後得到大腸桿菌O41的O-抗原基因簇的結構；(6)特異基因篩選針對大腸桿菌O41的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因設計引物；在每個基因內各設計兩對引物，每對引物分布在相應基因內不同地方以確保其特異性；用這些引物以166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌基因組為模板進行PCR，所有引物在大腸桿菌O41中得到陽性結果，在其他組中沒有擴增到任何大小正確的帶，也就是，在大多數組中沒有得到任何PCR產物帶，雖在少數組中得到PCR產物帶，但其大小不符合預期大小，所以wzx、wzy基因對大腸桿菌O41及其O-抗原都是高度特異的。(7)引物靈敏度的檢測將大腸桿菌O41的凍存菌液接種到有LB培養基的三角瓶中，30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時至飽和，取培養好的菌液稀釋，取稀釋菌液塗布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養數小時計數，計算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌，攪拌均勻，加入LB培養基，過濾，過濾液於30℃-40℃培養，180至250轉/分，培養數小時；從培養好的菌液中取數ml於6,000g離心數分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉澱並混勻，放入100℃沸水中煮數分鐘，裂解液於12,000g離心數分鐘，取上清做為PCR模板；用4對寡核苷酸對，SEQ ID NO1中的1805至1822鹼基的核苷酸和2393至2410鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1510至1527鹼基的核苷酸和2106至2123鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5012至5029鹼基的核苷酸和5406至5389鹼基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5272至5289鹼基的核苷酸和5645至5662鹼基的核苷酸進行PCR反應，PCR反應體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個循環；反應結束後，取10μl反應產物電泳，若有與預期大小相符的擴增帶，則結果為陽性，若沒有，則結果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個活菌的每份豬肉餡均在4對引物的PCR反應中得到陽性結果；參入0個活菌的豬肉餡在4對引物的PCR反應中得到陰性結果；說明使用上述方法時，這4對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O41的檢測靈敏度均為0.25個菌/g。
全文摘要
本發明提供一種對大腸桿菌O41(Escherichia coliO41)的O－抗原特異的核苷酸，它是大腸桿菌O41中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長15377個鹼基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；還包括源於大腸桿菌O41的O－抗原基因簇中的寡糖單位處理基因(包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本發明通過PCR證實寡核苷酸對大腸桿菌O41的O－抗原都有高度的特異性；本發明還公開了用本發明的寡核苷酸檢測和鑑定人體及環境中的大腸桿菌O41的方法。
文檔編號C12P19/34GK1563042SQ20041001902
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月19日 優先權日2004年4月19日
發明者王磊, 楊靜華, 馮露 申請人:天津生物晶片技術有限責任公司