一種豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA及其應用的製作方法
2023-06-07 22:56:41 2
專利名稱：一種豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及寄生蟲學和生物技術領域，具體涉及一種豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達 的miRNA及其應用。
背景技術：
豬蛔蟲(Ascaris suum)是豬體內最常見的寄生蟲之一。豬蛔蟲病流行廣泛，是危 害廣、造成嚴重經濟損失、呈全球性分布的一大類寄生蟲，對養殖業危害尤為嚴重。雖然豬 蛔蟲感染通常並不致命，但由此導致的飼養豬營養不良及幼齡豬發育不良給農業和畜牧業 造成巨大經濟損失。而長期過度的使用抗蠕蟲藥物已造成呈全球性分布的寄生蟲抗藥性問 題以及動物產品及環境中的藥物殘留問題。因此，加快對豬蛔蟲的研究、尋找有效防治豬蛔 蟲的新途徑已經迫在眉睫。miRNA是一類內源性的非編碼小RNA，廣泛存在於真核生物中，具有發育階段的特 異性、時序性或者組織特異性的表達特點，其功能主要為從轉錄後調控的水平調節個體生 長及發育相關基因表達。研究業已表明，寄生線蟲存在獨特的miRNA轉錄後調控機制，它們 可以通過miRNA實現對宿主和自身基因表達模式的精確調控，從而提高感染和自身增殖的 機率並逃避免疫監視。通過選擇性地抑制或阻斷某一特定發育期線蟲的發育，從而減少或 阻斷寄生線蟲的傳播很可能是防治線蟲感染的新思路、新途徑。豬蛔蟲物種特異性miRNA 有可能成為豬蛔蟲免疫預防或化學防治的新的「關鍵」分子，為核酸疫苗製備提供基礎。
發明內容
本發明的目的在於根據現有的抗蠕蟲藥物造成的寄生蟲抗藥性問題，以及動物產 品和環境中的藥物殘留問題，提供一種豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA。本發明另一目的在於提供上述豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達miRNA的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現一種豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA，其核苷酸序列如下(1)如 SEQ ID NO :1 140 所示；(2)與SEQ ID NO :1 140中的任何一條序列互補的序列。其中，所述互補的序列為DNA或RNA。作為一種優選方案，所述互補的序列為經過修飾的DNA或RNA，如硫代修飾或甲氧
基修飾。本發明所提供的豬蛔蟲雄性特異性miRNA均克隆自豬蛔蟲成蟲，成熟的miRNA序 列長度為18-25nt。對豬蛔蟲雌蟲和雄蟲miRNA進行深度測序，獲得成蟲的miRNA表達譜， 通過比對發現，SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 140所示的miRNA只在雄性成蟲中表達，而在雌性 成蟲中不表達；對隨機選擇的5種miRNA(SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 90、SEQ ID N0:104及SEQ IDNO 139)進行的螢光定量PCR分析亦表明，本發明所述的miRNA只在 雄蟲中表達，表明本發明所述的miRNA具有性別差異的特性。因此，在豬蛔蟲體內過量表達SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 140 分子或採用 miRNA 反向互補序列抑制 SEQ ID NO :1-SEQ ID NO 140的表達將影響雄性豬蛔蟲生理功能及與性別發育或性別分化相關的功能。此外，鑑 於豬蛔蟲和人蛔蟲的物種相似性，本發明所提供的豬蛔蟲雄性特異性miRNA及其反向互補 序列亦可應用於影響人蛔蟲生理功能及與性別發育或性別分化相關的功能。因此，本發明 豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA可用於製備蛔蟲疫苗，特別是豬蛔蟲疫苗或人蛔蟲疫
田ο與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA可以選擇性的抑制或阻斷某一特定 發育期線蟲的發育，從而減少或阻斷寄生蟲，尤其是蛔蟲的傳播。本發明miRNA製備成為蛔 蟲疫苗時，作為核酸疫苗，避免了傳統抗蠕蟲藥物造成的全球性分布的寄生蟲抗藥性問題， 也不會導致動物產品或環境中藥物的殘留。
具體實施例方式實施例ImiRNA的獲得1.總 RNA 抽提1)豬蛔蟲雄蟲和雌蟲成蟲整體稱重，分別用液氮研磨組織至粉末，加入lOOmg/mL 加入Trizol (Invitrogen)溶液，吹打混勻，使組織充分裂解，靜置5min ；2)取裂解液Iml加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸， 室溫靜置15min ；3)41下，10，00(^離心151^11，可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一個新的 RNase free EP 管；4)沉澱RNA 加入0. 5ml異丙醇，輕柔地充分混勻，室溫靜置IOmin ；5) 4°C下，10，OOOg離心lOmin，收集RNA沉澱，去上清；6)用75%乙醇洗滌兩次，超淨颱風幹；7)加入15 60 μ 1 DEPC水溶解沉澱。2.總RNA純度和完整性檢測1)純度檢測取1 μ 1 RNA樣品50倍稀釋，在BioPhotometer plus核酸蛋白測定 儀上測定OD值，0D260/0D280的比值大於1. 8。2)總RNA完整性檢測取RNA樣品1 μ 1，1 %瓊脂糖凝膠電泳80VX 20min，用凝膠 成像系統觀察總RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶完整。3. small RNA序列的獲得和篩選用15% PAGE 膠回收 20-30nt 的 small RNA，加上 5'和 3'接頭(購自 Illumina 公司)後實施RT-PCR (反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司)。產物經6% TBE PAGE膠純 化後進行Solexa測序。然後屏蔽掉可能為接頭序列的部分、測序質量差的序列(例如測序 信號很低等)及長度小於18nt的序列獲得cleanreads。4. miRNA 的鑑定M BLAST 禾呈· (NCBI,www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast) M clean reads 與 GenBank 禾口 Rfam database(version 9.0) (http://www. Sanger, ac. uk/software/Rfam/mirna)進 行比對分析，去除非編碼RNA序列，包括rRNA，tRNA, snRNA, snoRNA，和other ncRNA ；通過RepeatMasker (http //www. repeatmasker. org)去除轉座子等重複序列；然後搜索 Sanger miRBase (version 13. 0)資料庫，尋找序列相似性miRNA。搜索條件為錯配數小於2，獲得與 已知資料庫miRNA具有序列相似性的miRNA。將雄蟲表達的miRNA與雌蟲進行比較，屏蔽掉 雄蟲中與雌蟲相同的序列，獲得雄性成蟲特有的miRNA。共獲得140條豬蛔蟲雄性特異性miRNA。實施例2螢光定量PCR分析對隨機選擇的5 種 miRNA，包括 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :25、SEQ IDNO :90、SEQ ID NO: 104及SEQ ID NO 139進行實時螢光定量PCR分析。反應體系如下cDNA(l 20)5. 0 μ 1上遊引物0·5μ1下遊引物0·5μ12x SYBR Green PCR Master Mix 10 μ 1H204· 0 μ 1總體積20 μ 1反應條件如下
95 °C 5min,
95 °C 15s,
Z \
『 40 cycles、
65 0C 30s - 72°C 32s 讀板；融解曲線分析溫度60°C -95°C。每個樣重複3次。定量PCR 用的 SYBR Green PCR Master Mix 購自 Τ0Υ0Β0 公司定量 PCR 儀ABI PRISM 7500Sequence Detection System內參片段為β-actin。對隨機選擇的5 種 miRNA (SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :90、SEQ ID N0:104及SEQ ID NO 139)進行的螢光定量PCR分析表明，本發明所述的miRNA只在雄蟲 中表達，表明本發明所述的miRNA具有性別差異的特性。因此，在豬蛔蟲體內過量表達SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 140 分子或採用 miRNA 反向互補序列抑制 SEQ ID NO =I-SEQ ID NO: 140的表達將影響雄蟲豬蛔蟲生理功能及與性別發育或性別分化相關的功能。此外，鑑於豬 蛔蟲和人蛔蟲的物種相似性，本發明所提供的豬蛔蟲雄性特異性miRNA及其反向互補序列 亦可應用於影響人蛔蟲生理功能及與性別發育或性別分化相關的功能。此外，為了提高反向互補序列的作用和細胞內的穩定性，上述豬蛔蟲雄性特異性 miRNA的反向互補序列可以是DNA或RNA，還可以對反向互補序列進行硫代、甲氧基等修飾。
權利要求
一種豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA，其核苷酸序列為SEQ IDNO1～84所示的miRNA序列或與其互補的序列。
2.根據權利要求1所述的豬蛔蟲雄性特異性表達的miRNA，其特徵在於所述互補的序 列為DNA或RNA。
3.根據權利要求2所述的豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA，其特徵在於所述互補 的序列為經過修飾的DNA或RNA。
4.根據權利要求3所述的豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA，其特徵在於所述修飾 為硫代修飾或甲氧基修飾。
5.權利要求1 4中任意一條權利要求所述豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA在制 備蛔蟲疫苗中的應用。
6.根據權利要求5所述豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA的應用，其特徵在於所述 豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA用於製備豬蛔蟲疫苗或人蛔蟲疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA及其應用。本發明豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA的序列選自SEQ ID NO1～140或與其互補的DNA或RNA序列。本發明豬蛔蟲雄性成蟲特異性表達的miRNA只在豬蛔蟲雄性成蟲中表達，具有性別差異的特性，可用於影響雄性豬蛔蟲生理功能或與性別發育、分化相關的功能，還可用於影響人蛔蟲生理功能或性別發育、分化相關的功能，用於製備蛔蟲疫苗，為防治蛔蟲病提供了新的途徑。
文檔編號A61P33/10GK101935658SQ201010250380
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月10日 優先權日2010年8月10日
發明者劉春豔, 宋慧群, 徐民俊, 朱興全, 林瑞慶, 袁子國, 賀現輝, 顏超 申請人:華南農業大學