一種氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-07 16:30:51 2

專利名稱：一種氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明是涉及一種氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料及其製備方法，屬於納米材料生物應用領域。
背景技術：
石墨烯是碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀晶格結構的一種炭質新材料，其厚度只有0. 335nm,是構建其他維數炭質材料(如零維富勒烯、一維碳納米管、三維石墨)的基本單元。石墨烯自2004年被發現以來，已迅速成為材料科學和凝聚態物理領域最為活躍的研究前沿，而其在生物醫學領域的研究是近兩年才開始的，目前相關工作報導還比較少。
在生物醫學領域應用較多的石墨烯衍生物主要是功能化的氧化石墨烯。氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，通常由石墨粉經化學氧化、超聲分散而製得。由於其表面含有大量的含氧活性基團，如羥基、羧基、羰基、環氧基等親水性基團，因而具有良好的水溶液穩定性和生物相容性。同時，由於石墨烯具有單原子層結構，其比表面積很大，且兩個基面都可以吸附藥物，因此非常適合用作藥物載體。

發明內容
本發明旨在提供一種氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料及其製備方法，通過在氧化石墨烯上修飾透明質酸，一方面增強該材料在生物體內的生物相容性，另一方面有利於靶向體內惡性腫瘤細胞。為實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下—種氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料，在單層氧化石墨烯表面上共價連接己二酸醯肼，利用己二酸醯肼上的氨基進一步偶聯靶向分子透明質酸，所述單層氧化石墨烯的厚度為0. 5-2nm,所述氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料的平均尺寸為50_300nm。上述材料的製備方法包括以下步驟(I)按照氧化石墨烯EDC:NHS的質量比為0. 8-1. 2:5:15向氧化石墨烯的水溶液中分別加入EDC和NHS，然後調節溶液的pH至5. 5-5. 8 ；(2)按照氧化石墨烯己二酸醯肼(ADH)質量比為1:10-12向上述溶液中加入己二酸醯肼，常溫下攪拌20-24h，洗滌並乾燥；(3)按照透明質酸EDC:NHS的質量比為1.5-2.5:5:15向透明質酸溶液中分別加A EDC和NHS,然後調節溶液的pH至5. 5-5. 8 ；(4)加入I. 5-3倍質量的步驟(2)所得乾燥物質，常溫下攪拌20-24h，洗滌並乾燥。步驟(I)中的氧化石墨烯的水溶液的濃度為l_2mg/mL。步驟(3)中的透明質酸溶液的濃度為l_2mg/mL。所述石墨氧化烯的製備方法包括以下步驟
(I)將天然石墨粉與氯化鈉按照1:25-1:30的質量比混合研磨20-30min，用水溶解，過濾並乾燥；(2)將步驟(I)所得石墨粉按照0. 06-0. lg/mL的固液比加入濃硫酸(96%_98%)中，同時加入與石墨粉質量比為0. 25-0. 5 1的硝酸鈉置於6-10° C下攪拌30-40min，加入與石墨粉質量比為I. 5-2 1的高錳酸鉀，在10-15°C下繼續攪拌8-10h，然後繼續在35-40°C攪拌 30-40min，在 65-80°C攪拌 45_50min，在 98_105°C攪拌 30_40min ；(3)加入反應液2-3倍體積去離子水，攪拌30-40min，然後加入反應液2_3倍體積質量濃度2. 5-3%的過氧化氫溶液，攪拌30-40min，停止反應，將反應液超聲振動2_2. 5h，本步驟反應維持溫度均在98-105°C ；(4)用5%鹽酸溶液洗滌離心反應液3-5次，再用去離子水離心洗滌使上層清液為中性，乾燥。
本發明所述的氧化石墨烯/透明質酸納米材料的製備原理是先在單層氧化石墨烯(NGO)上面共價連接己二酸醯肼(ADH)，然後把透明質酸(HA)和己二酸醯肼(ADH)偶聯在一起，通過間接的方法修飾到單層氧化石墨烯的表面。與現有技術相比，本發明的有益效果在於氧化石墨烯為單層結構，厚度在
0.5-2nm,尺寸在50_300nm,更加有利於生物應用；製得的氧化石墨烯/透明質酸納米材料中，透明質酸共價修飾到氧化石墨烯表面，具有一定的靶向性；並且，修飾後的氧化石墨烯具有良好的生物相容性，有利於材料的生物應用，所得功能化納米材料有望用作藥物傳輸載體。


圖I為實施例I所製備的氧化石墨烯的透射電鏡(TEM)2為實施例I所製備的氧化石墨烯的原子力顯微鏡(AFM)圖。圖3為實施例I所製備的氧化石墨烯的XRD譜圖。圖4為實施例2製備的氧化石墨烯/己二酸醯肼和氧化石墨烯/透明質酸的紫外吸收圖譜。圖5為實施例2製備的氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明質酸的Raman譜圖。圖6為實施例3製備的氧化石墨烯/透明質酸在不同阿黴素濃度下的載藥百分比。圖7為實施例3所製備的氧化石墨烯/透明質酸在不同pH值下的藥物釋放情況。圖8為實施例4製備的氧化石墨烯/透明質酸在不同喜樹鹼濃度下的載藥百分比。圖9為實施例4所製備的氧化石墨烯/透明質酸在不同pH值下的藥物釋放情況。圖10 (a)和(b)分別為氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明質酸對HeLa細胞的MTT毒性實驗數據。圖11 (a)和(b)分別為氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明質酸對MCF-7細胞的MTT毒性實驗數據。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步詳細、完整地說明實施例I(I)將2克天然 石墨粉，60克氯化鈉，兩者混合在一起充分的研磨，研磨30min之後，用水溶解並抽濾；(2)將上述濾紙上抽濾的物質乾燥之後放入裝有23mL濃硫酸的100毫升圓底燒瓶中，同時加入0. 5克硝酸鈉置於6°C的冰水浴中磁力攪拌，攪拌30min之後，緩慢加入3. 0克高錳酸鉀，在10°C水浴中繼續攪拌8h ；(3)維持上述反應(2)在35°C攪拌30min，在65°C攪拌45min，在98°C攪拌30min ；(4)經過步驟(3)之後，加入46mL去離子水，繼續攪拌30min，然後加入200mL質量濃度3%的H2O2水溶液；攪拌30min之後使反應停止；然後將反應液在超聲機中超聲2h ；(5)用5%鹽酸溶液離心洗滌反應液5次，再用去離子水離心洗滌使上層清液為中性，將樣品真空乾燥24h，得到單層氧化石墨烯。透射電鏡(TEM)圖見圖I ;由TEM圖可見氧化石墨烯均勻分散在水溶液體系中，平均尺寸為180nm。原子力顯微鏡(AFM)圖見圖2，由AFM圖可見其中的一個氧化石墨烯納米粒子的厚度為0. 98nm，尺寸為265nm，符合我們製備的納米級別，有利於生物應用。X射線粉末衍射(XRD)圖譜見圖3，由XRD圖可見在11. 4°和42°分別出現了氧化石墨烯的特徵吸收峰，對應於001和100晶面。實施例2(I)取50mg實施例I製得的乾燥的氧化石墨烯，按照lmg/mL的濃度分散在水溶液中；按照氧化石墨烯EDC:NHS質量比為1:5:15的比例分別加入EDC和NHS ；(2)加入 lmg/mL 的 NaOH 調節溶液的 pH=5. 76 ；(3)加入520mg的己二酸醯肼(ADH)，在常溫條件下攪拌24h ；(4)用去離子水離心洗滌數次，冷凍乾燥24h，得氧化石墨烯/己二酸醯肼(GO-ADH)；(5)稱取15mg透明質酸，溶解在15mL去離子水中；(6)按照透明質酸EDC:NHS質量比為2:5:15的比例分別加入EDC、NHS ；(7)用 lmg/mL 的 NaOH 調節溶液的 pH=5. 6 ；(8)加入30mg步驟(4)中冷凍乾燥的樣品，在常溫條件下攪拌24h ；(9)用去離子水離心洗滌數次，冷凍乾燥24h，得氧化石墨烯/透明質酸(GO-HA)。所製備的氧化石墨烯/透明質酸(GO-HA)和氧化石墨烯/己二酸醯肼(GO-ADH)的紫外吸收見圖4，由圖可見通過Fmoc-Cl法分別對氧化石墨烯/己二酸醯肼和氧化石墨烯/透明質酸的氨基密度進行定量檢測，使用300nm處紫外的不同吸收值，根據Fmoc-Cl標準工作曲線分別計算相應的氨基密度為5. 86X 10_5mOl/g、3. 4X 10_5mOl/g ；氧化石墨烯(GO)和氧化石墨烯/透明質酸(GO-HA)的拉曼光譜見圖5，由圖可見氧化石墨烯在1350CHT1和1580CHT1分別出現D峰和G峰，並且兩個峰值的比值越小，說明材料排列越有序，並且在2679CHT1出現2D，說明是單層氧化石墨烯；當氧化石墨烯修飾透明質酸之後，材料的厚度以及表面結構發生了變化，導致2D峰消失，進而彌補了 GO的表面缺陷，使得D峰/G峰比值減小。
實施例3(I)配製不同濃度的D0X，溶劑是DMS0，濃度分別是40、60、100、200、300、1000、1500、2000 u g mL 1 ；
(2)分別稱取5mg的G0-HA加入IOmL上述溶液中；(3)放置到搖床中200轉/min，37°C條件下轉動20h ；(4)然後分別再用3mL的水洗滌3次，最後用DMSO定容到25mL ；(5)對8個不同濃度的上層清夜測量紫外吸光度，分別計算出載藥量，結果如圖6所示。由圖可見，當阿黴素的濃度大於等於IOOOil g mL-1的時候，氧化石墨烯的載藥量達到飽和狀態，約為300mg/g ；圖7為本實施例中的氧化石墨烯/透明質酸在不同pH值下的藥物釋放情況，在測試之前，溶液用PBS稀釋了 12. 5倍。(a):和氧化石墨烯/透明質酸相互作用前後阿黴素(DOX)的紫外可見光譜；(b) 37° C時，載有DOX的氧化石墨烯/透明質酸在不同pH(7. 4，6.3,5. 2)條件下DOX釋放圖。由圖可見，裝載藥物的雜化材料的藥物釋放是pH響應的，能達到可控和緩釋的作用。在pH為7. 4和6. 3時，DOX能比較穩定的附著在氧化石墨烯表面，經過72小時之後，於相應的pH值的PBS緩衝溶液中，僅分別有3. 8%和4. 3%的藥物釋放。然而在pH為5. 2時，25小時之後就有22. 5%的DOX釋放出來，這種pH依賴的藥物釋放性質在藥物運輸應用上是非常重要和有用的。這些結果也表明該藥物傳輸系統在正常的生理條件下具有微小量的藥物釋放，其在抵達和進入癌細胞之前對正常組織的副作用很小，這對於GO-HA在實際生物應用中具有重要意義。實施例4
(I)配製不同濃度的CPT，溶劑是DMS0，濃度分是5、10、20、40、60、90、
120 Ug* mir1 ； (2)分別稱取5mg的G0-HA加入IOmL上述溶液中；(3)放置到搖床中200轉/min，37°C條件下轉動20h ；(4)然後分別再用3mL的水洗滌3次，最後用DMSO定容到25mL ；(5)對7個不同濃度的上層清液測量紫外吸光度，分別計算出載藥量，結果如圖8所示。由圖可見，當喜樹鹼的濃度大於等於80 Ug ^mL-1的時候，喜樹鹼的載藥率達到最大，約為15% ；圖9為本實施例所製備的氧化石墨烯/透明質酸在不同pH值下的藥物釋放情況，在測試之前，溶液用DMF稀釋了 12. 5倍。(a):和氧化石墨烯/透明質酸相互作用前後喜樹鹼(CPT)的紫外可見光譜；(b) 37° C時，載有CPT的氧化石墨烯/透明質酸在不同PH(6. 3,5. 2)條件下DOX釋放圖。由圖可見，喜樹鹼作為一種疏水性藥物，其釋放速率明顯小於阿黴素。這對於其在實際生物應用中將具有十分重要的意義，因為載藥材料在到達和進入癌細胞之前對正常的組織器官具有極小的副作用。一旦擔載藥物的材料被癌細胞攝取，疏水的藥物分子就會在細胞內的疏水部位被釋放出來而殺死腫瘤細胞。圖10為氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明質酸的MTT實驗數據，(a)和(b)為氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明質酸在HeLa細胞孵育一段時間的毒性研究結果；由圖可見，當氧化石墨烯/透明質酸和HeLa細胞共同孵育24小時後，細胞的存活率在材料的濃度高達200ug. mL-1時仍然超過80%。並且，在相同的樣品濃度下，12和24小時孵育時間所得的HeLa細胞存活率沒有出現很大差異。這些數據表明，氧化石墨烯/透明質酸在一個較寬的濃度範圍內沒有毒性。圖11 (a)和(b)為氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明質酸在MCF-7細胞孵育一段時間的毒性研究結果。由圖可見，當氧化石墨烯/透明質酸和MCF-7細胞共同孵育24小時後，細胞的存活率在材料的濃度高達200 Ug ^mL-1時仍然超過80%。這些數據顯示，材料可以安全的應用於生物領域。以上所述為本發明的較佳實施例而已，但本發明不應該局限於該實施例所公開的內容。所以凡是不脫離本發明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發明保護的範
圍。權利要求
1.一種氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料，其特徵在於，在單層氧化石墨烯表面上共價連接己二酸醯肼，利用己二酸醯肼上的氨基進一步偶聯靶向分子透明質酸，所述單層氧化石墨烯的厚度為O. 5-2nm，所述氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料的平均尺寸為50-300nm。
2.權利要求I所述的氧化石墨烯/透明質酸納米材料的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)按照氧化石墨烯EDC:NHS的質量比為O.8-1. 2:5:15向氧化石墨烯的水溶液中分別加入EDC和NHS，然後調節溶液的pH至5. 5-5. 8 ； (2)按照氧化石墨烯己二酸醯肼質量比為1:10-12向上述溶液中加入己二酸醯肼，常溫下攪拌20-24h，洗滌並乾燥； (3)按照透明質酸EDC:NHS的質量比為I.5-2. 5:5:15向透明質酸溶液中分別加入EDC和NHS，然後調節溶液的pH至5. 5-5. 8 ； (4)加入I.5-3倍質量的步驟(2)所得乾燥物質，常溫下攪拌20-24h，洗滌並乾燥。
3.權利要求I所述的氧化石墨烯/透明質酸納米材料的製備方法，其特徵在於，步驟(O中的氧化石墨烯的水溶液的濃度為l_2mg/mL。
4.權利要求I所述的氧化石墨烯/透明質酸納米材料的製備方法，其特徵在於，步驟(3)中的透明質酸溶液的濃度為l_2mg/mL。
5.權利要求2、3或4所述的氧化石墨烯/透明質酸納米材料的製備方法，其特徵在於，所述石墨氧化烯的製備方法包括以下步驟 (1)將天然石墨粉與氯化鈉按照1:25-1:30的質量比混合研磨20-30min,用水溶解,過濾並乾燥； (2)將步驟(I)所得石墨粉按照O.06-0. l_g/mL的固液比加入濃硫酸中，同時加入與石墨粉質量比為O. 25-0. 5 1的硝酸鈉置於6-10° C下攪拌30_40min，加入與石墨粉質量比為I. 5-2 1的高錳酸鉀，在10-15°C下繼續攪拌8-10h，然後繼續在35-40°C攪拌30-40min，在 65-80°C攪拌 45-50min,在 98-105°C攪拌 30_40min ； (3)加入反應液2-3倍體積去離子水，攪拌30-40min，然後加入反應液2_3倍體積質量濃度2. 5-3%的過氧化氫溶液，攪拌30-40min，停止反應，將反應液超聲振動2_2. 5h，本步驟反應維持溫度均在98-105°C ； (4)用5%鹽酸溶液洗滌離心反應液3-5次，再用去離子水離心洗滌使上層清液為中性，乾燥。
6.權利要求I所述的氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料用於靶向藥物傳輸。
全文摘要
本發明公開了一種氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料，其特徵在於，在單層氧化石墨烯表面上共價連接己二酸醯肼，利用己二酸醯肼上的氨基進一步偶聯靶向分子透明質酸，所述單層氧化石墨烯的厚度為0.5-2nm，所述氧化石墨烯/透明質酸納米藥物載體材料的平均尺寸為50-300nm。本發明製得的氧化石墨烯/透明質酸納米材料中，透明質酸共價修飾到氧化石墨烯表面，具有良好的靶向性；並且，修飾後的氧化石墨烯具有良好的生物相容性，有利於材料的生物應用，所得功能化納米材料有望用作藥物傳輸載體。
文檔編號A61K47/04GK102727901SQ20121024054
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月12日 優先權日2012年7月12日
發明者吳惠霞, 曾波, 楊仕平, 王亞培 申請人:上海師範大學