一種鹿x/y精子分離冷凍精液及其生產方法和應用的製作方法
2023-06-08 01:22:21 1
專利名稱：一種鹿x/y精子分離冷凍精液及其生產方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種哺乳動物X/Y精子分離技術，特別涉及一種鹿X/Y精子 分離冷凍精液及其生產方法和應用。
背景技術：
以家畜為主的冷凍精液、人工受精和體外受精技術廣泛應用於生產繁育和 生殖生物學研究。在正常情況下，鹿的子代繁育公母各佔50%，但是在生產實 際中，為了提高鹿的養殖效應，對於特定品系需要更多繁育母鹿(育種和擴群) 或公鹿(商品鹿茸生產)，於是就需要通過分離精子來控制鹿的子代性別。此 外，分離後的精子在授精前通常需要冷凍保存，而各個物種的不同，其對於pH 值、冷凍緩衝液及冷凍處理方法的要求也不同，這對冷凍條件及其緩衝液提出 了較高的要求。CN1232231C公開了一種家畜X/Y精子分離的方法，該方法需要使用磷 酸緩衝溶液洗滌精液，通過流式細胞分離機分離，其速度為3000個/秒。然而， 使用該方法分離鹿的X/Y精子時，其分離速度、分離準確率、緩衝液使用、冷 凍保存後的精子活力等方面仍有較大提高空間。CN101112392A公開了一種底劑量家畜精液及其生產方法，該方法通過使 用冷凍平衡液A(Tris-A)和添加了甘油的冷凍平衡液B(Tris-B)來處理多種家畜 精液，通過多種動物精液生理特性研究，發現特定異種動物精子間的受精促進 效果。該方法需要添加異種家畜的精液，使用該方法單獨處理鹿的精子時，所 得到的鹿精子的數量和活力均不能達到理想產業化應用的水平。發明內容本發明的目的是提供鹿X/Y精子分離冷凍精液及其生產及方法和應用，可 以將鹿X/Y精子分離，並實現產業化生產和應用，從而控制鹿的子代性別。 本發明提供了一種鹿X/Y精子分離冷凍精液，包括冷凍平衡液A、冷凍平衡液B和鹿X或Y精子分離冷凍精液，其含量如下冷凍平衡液ATris-A 50%冷凍平衡液B含20M甘油冷凍保護劑的Tris-B50。/。，其中 鹿X或Y精子分離冷凍精液濃度為200-400萬精子/0.25mL。 上述冷凍平衡液A， pH6.8，由以下組分組成Tris三羥甲基氨基甲烷 檸檬酸291.7 mM95.1 mM70.2 mM20%由以下組分組成291.7 mM95.1 mM70.2 mM卵黃 20% 甘油 20% 超純水。本發明還提供了上述的鹿X/Y精子分離冷凍精液的生產方法，包括下述超純水；並且，所述冷凍平衡液B， pH6.8, Tris三羥甲基氨基甲垸步驟:1) 從健康的公鹿採集新鮮精液2-5mL (總精子數25-50億個)，由於鹿的 鮮精非常容易失去活力，因此需用TALP液保護。為抑制精液中細菌增殖用 TALP液等倍稀釋並添加適量抗生素(慶大黴素Gentamicin:0.8mg/mL，林可一 奇黴素Linco-spectin:0.3mg/mL)，在18-20X:條件下保溫，供X/Y精子分離使 用。每份新鮮精液在該條件下可使用6-8小時；2) 使用精子密度一活力儀檢測新鮮精液的濃度和活力，只有活力在80% 以上的樣品可用於分離處理。根據精液濃度折合體積取4億精子離心去除精漿， 添加10 u g/mL Hochest 33342在24。C溫水浴中染色30分鐘；3) 鹿X/Y精子分離的DNA差異設定為2.8-3.0。％，根據鹿XY精子DNA 含量差別設定流式細胞分離機參數(第一相區初取精子噴流總數的70%/第二 相區原精液死精率15X-X/Y單性精子分離取率40X)，通過流式細胞分離機 分離X和Y精子，使X/Y精子分離速度控制在4000-5000個/秒，X或Y精子分離純度達到85-95%;4) 根據分離精子累計顯示，取分離的X或Y精子2億，下機後以2000 轉/5分鐘進行離心處理，用冷凍平衡液A稀釋到最終設計濃度的2倍，在4-5 "C條件下放置60分鐘；5) 冷凍平衡液A平衡後，添加等量的含20%甘油冷凍保護劑的冷凍平衡 液B，在4"C冰箱平衡60分鐘；6) 把分離X或Y精液在4"C條件下裝入冷凍管，製成鹿X/Y精子分離冷 凍精液。7) 因為冷凍保護液的效果不同，進一步將步驟6)製得的鹿X/Y精子分 離冷凍精液裝入0.25mL冷凍管，置入-90。C的氮蒸汽中處理60分鐘，然後把 精液管投入液化氮中保存。上述鹿X/Y精子分離冷凍精液用於常規人工授精或手術人工授精方法，每 只受體一次可輸入200-400萬分離精子，按照生產需要定向繁育公犢或母犢； 或者，通過鹿X/Y精子分離冷凍精液生產性控胚胎，再進行胚胎移植加快優良 個體的繁育速度。本發明應用鹿X、 Y精子DNA含量的差異，通過流式細胞方式分離X和 Y精子，然後製成性別控制冷凍精液，以人工授精方式根據生產需要來控制鹿 產犢的性別。本發明的方法通過添加TALP液來保護鹿的鮮精，有效的保護了 其精子活力。其X/Y精子的分離速度可達4000-5000個/秒，分離效率高，使 用本發明的產品人工授精的受胎率能夠達到產業化應用的水平，其產犢的性別 控制準確率可達88%以上。本發明的產品和方法能夠適用於產業化生產和養 殖，從而大幅度提高鹿的養殖效應。
具體實施方式
下面將結合具體實施方案對本發明的方法做更詳細的說明。本領域技術人 員應當理解，下述實施例均用於對本發明所要求保護的範圍進行實例性的描 述，以此概括本發明的各參數的相對範圍，因而不能將之理解為對本發明的一 種具體限制。實施例1鹿Y冷凍精液的製作和人工授精控制產犢性別1) 從一隻健康的馬鹿(鑽石1號)麻醉後，以電刺激法採集4mL、總精 子數為40億的新鮮精液，經檢測，該精子活力為83%。由於鹿的鮮精非常容 易失去活力，因此需用TALP液保護。使用TALP液等倍稀釋並添加抗生素(慶 大黴素Gentamicin:0.8mg/mL，禾木可一奇黴素Linco-spectin:0.3mg/mL)後在 18-2(TC條件下保溫。使用精子密度一活力儀檢測新鮮精液的濃度和活力，經 檢測，該精液的活力為85%，運回實驗室供X/Y精子分離使用6小時。2) 根據精液濃度折合體積取4X2億精子(供2臺精子分離機使用)離心 去除精漿，添加lOu g/mLHochest33342在24。C溫水浴中染色30分鐘。3) 鹿X/Y精子分離的DNA差異設定為2.8-3.0% ，根據鹿X、 Y精子DNA 含量差別設定精子流式細胞分離機(美國XY公司的SX-MoFlo流式細胞分離機) 參數(第一相區初取精子噴流總數的70%/第二相區原精液死精率15%=X/Y 單性精子分離取率40%)，通過流式細胞分離機分離X和Y精子，使X/Y精 子分離速度控制在4000-5000個/秒，Y精子分離純度達到85-95 % 。4) 根據分離精子累計顯示，取分離的Y精子2億，下機後以2000轉/5 分鐘進行離心處理，用顯微鏡一電腦精子記數法檢測分離精子濃度，用Tris-A(冷凍平衡液A)稀釋到最終設計濃度的2倍，在4-5X:條件下放置60分鐘； 其中，Tris-A (冷凍平衡液A) pH6.8，由以下組分組成Tris三羥甲基氨基甲垸 291.7 mM檸檬酸 95.1 mM果糖 70.2 mM卵黃 20% 超純水。5) Tris-A平衡後，添加等量的含20%甘油冷凍保護劑的Tris-B (冷凍平 衡液B)，在4"C冰箱平衡60分鐘；其中，Tris-B (冷凍平衡液B)， pH6.8，由以下組分組成Tris三羥甲基氨基甲烷 291.7 mM檸檬酸 95.1 mM果糖 70.2 mM卵黃 20%甘油 20%超純水。6) 分離Y精液在4"C條件下裝入0.25mL冷凍管，製成含200萬精子的鹿 性控冷凍精液；該樣品供2臺分離機使用6小時，製作鹿Y精子分離冷凍精液 68支。7) 因冷凍保護液的效果不同，將裝入0.25mL冷凍管的分離精液置入-90 "C的氮蒸汽中處理60分鐘；然後把冷凍管投入液化氮中保存。該鹿Y精子分離冷凍精液以手術人工授精方法(每隻受體一次可使用200 萬精子)，授精處理母鹿68隻，受胎38隻，產犢35隻(流產3隻)，其中公 犢32隻，性控準確率為92%。實施例2鹿X冷凍精液的製作和人工授精控制產犢性別1) 從一隻健康的馬鹿(鑽石3號)麻醉後，以電刺激法採集3mL、總精 子數為24億的新鮮精液，經檢測，精子活力為80%。由於鹿的鮮精非常容易 失去活力，因此需用TALP液保護。用TALP液等倍稀釋並添加抗生素(慶大 黴素Gentamicin:0.8mg/mL，才木可一奇黴素Linco-spectin:0.3mg/mL)後在18 — 2(TC條件下保溫。使用精子密度一活力儀檢測新鮮精液的濃度和活力，經檢測， 該精液的活力為85% ，運回實驗室供X/Y精子分離使用4小時。2) 根據精液濃度折合體積取4X2億精子(供2臺精子分離機使用)離心 去除精漿，添加10 " g/mLHochest33342在24"溫水浴中染色30分鐘。3) 鹿X/Y精子分離的DNA差異設定為2.8-3.0%，根據鹿XY精子DNA 含量差別設定精子流式細胞分離機(美國XY公司的SX-MoFlo流式細胞分離機) 參數(第一相區初取精子噴流總數的70%/第二相區原精液死精率15。％=X/Y 單性精子分離取率40%)，通過流式細胞分離機分離X和Y精子，使X/Y精 子分離速度控制在4000-5000個/秒，X精子分離純度達到85-95% 。4) 根據分離精子累計顯示，取分離的X精子按2億，下機後以2000轉/5 分鐘進行離心處理，用顯微鏡一電腦精子記數法檢測分離精子濃度，用Tris-A(冷凍平衡液A)稀釋到最終設計濃度的2倍，在4-5。C條件下放置60分鐘； 其中，Tris-A (冷凍平衡液A) pH6.8，由以下組分組成Tris三羥甲基氨基甲烷 291.7 mM
擰檬酸 95.1 mM
果糖 70.2 mM
卵黃 20% 超純水。
5) Tris-A平衡後，添加等量的含12-20%甘油冷凍保護劑的Tris-B (冷凍 平衡液B)，在4。C冰箱平衡60分鐘；其中，Tris-B (冷凍平衡液B)， pH6.8，
由以下組分組成
Tris三羥甲基氨基甲烷 291.7 mM
檸檬酸 95.1 mM
果糖 70.2 mM
卵黃 20%
甘油 20% 超純水。
6) 分離X精液在4"C條件下裝入0.25mL冷凍管，製成含400萬精子的 鹿性控冷凍精液；該樣品供2臺分離機使用3小時，製作鹿X精子分離冷凍精 液28支。
7) 因冷凍保護液的效果不同，將裝入0.25mL冷凍管的分離精液置入-90 。C的氮蒸汽中處理60分鐘，然後把冷凍管投入液化氮中保存。
該鹿X精子分離冷凍精液以手術人工授精方法(每隻受體一次可使用400 萬精子)，授精處理母鹿28隻，受胎18隻，產犢17隻(流產1隻)，其中母 犢15隻，性控準確率為88%。
此外，也可以通過鹿X/Y分離冷凍精液生產性控胚胎，再進行胚胎移植加 快優良個體的繁育速度。
本發明應用鹿X、 Y精子DNA含量的差異，通過流式細胞方式分離X和 Y精子，然後製成性別控制冷凍精液，以人工授精方式根據生產需要來控制鹿 產犢的性別。本發明的方法分離效率高，所得到的產品其產犢的性別控制準確率 可達88%以上。本發明的產品和方法能夠適用於產業化生產和養殖，從而大幅 度提高鹿的養殖效應。
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權利要求
1.一種鹿X/Y精子分離冷凍精液，包括冷凍平衡液A、冷凍平衡液B和鹿X或Y精子分離冷凍精液，其含量如下冷凍平衡液A Tris-A 50％冷凍平衡液B 含20％甘油冷凍保護劑的Tris-B 50％，其中鹿X或Y精子分離冷凍精液濃度為200-400萬精子/0.25mL。
3.1) 採集公鹿新鮮精液2-5mL (總精子數25-50億個)，用TALP液等倍稀 釋並添加抗生素，在18-20。C條件下保溫；2) 檢測新鮮精液的濃度和活力，只有活力在80%以上的樣品可用於分離 處理，根據精液濃度折合體積取4億精子離心去除精漿，添加10嗎/mLHochest 33342在24'C溫水浴中染色30分鐘；3) 鹿X/Y精子分離的DNA差異設定為2.8-3.0% ，根據鹿X、 Y精子DNA 含量差別設定流式細胞分離機參數，通過流式細胞分離機分離X和Y精子， 使X/Y精子分離速度控制在4000-5000個/秒；4) 取分離的X或Y精子2億，下機後以2000轉/5分鐘進行離心處理， 用冷凍平衡液A稀釋到最終設計濃度的2倍，在4-5t:條件下放置60分鐘；5) 冷凍平衡液A平衡後，添加等量的含20%甘油冷凍保護劑的冷凍平衡 液B，在4'C冰箱平衡60分鐘；6) 把分離X或Y精液在4t:條件下裝入冷凍管，製成鹿X/Y精子分離冷 凍精液。
4. 根據權利要求3的所述的生產方法，其特徵在於所述抗生素為慶大黴素 0.8mg/mL，林可一奇黴素0.3mg/mL。
5. 根據權利要求3的所述的生產方法，其特徵在於所述精子分離機參數為 第一相區初取精子噴流總數的70%/第二相區原精液死精率15%=)(/￥單性 精子分離取率40%。
6. 根據權利要求3的所述的生產方法，進一步包括如下步驟將步驟6)製得 的鹿X/Y精子分離冷凍精液裝入0.25mL冷凍管，置入-9(TC的氮蒸汽中處 理60分鐘，然後把精液管投入液化氮中保存。
7. 根據權利要求2的所述的鹿X/Y精子分離冷凍精液用於人工授精或生產性 控胚胎再進行胚胎移植。
8. 根據權利要求6所述的鹿X/Y精子分離冷凍精液用於人工授精或生產性控 胚胎再進行胚胎移植，其特徵在於所述鹿X/Y分離冷凍精液人工授精劑 量為200-400萬精子/只或次。
全文摘要
本發明涉及一種鹿X/Y精子分離冷凍精液及其生產方法和應用。本發明提供了一種鹿X/Y精子分離冷凍精液，包括冷凍平衡液A，含12％甘油冷凍保護劑冷凍平衡液B和鹿X或Y精子分離冷凍精液。本發明使用TALP液保護鹿的鮮精，並且應用鹿X、Y精子DNA含量的差異，通過流式細胞方式分離X和Y精子，然後製成性別控制冷凍精液，其冷凍保存條件為-90℃處理60分鐘。本發明得到的冷凍精液用於以人工授精方式或胚胎移植方式控制鹿產犢的性別，分離效率高，性別控制準確率可達88％以上，適用於產業化生產和養殖，從而大幅度提高鹿的養殖效應。
文檔編號A01N1/02GK101322489SQ20081013535
公開日2008年12月17日 申請日期2008年8月1日 優先權日2008年8月1日
發明者劉樹江, 偉 孫, 李喜和, 王建國, 胡樹香, 董雲祥, 錢松晉 申請人:內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司