一種提高畢赤酵母重組表達透明質酸酶的方法

2023-06-08 01:21:41

一種提高畢赤酵母重組表達透明質酸酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高畢赤酵母重組表達透明質酸酶的方法，屬於生物工程【技術領域】。本發明通過在重組透明質酸酶基因前段融合一段信號肽序列，解決了原重組菌株產量較低的問題，實現了重組透明質酸酶在畢赤酵母中產量的顯著提高。本發明中工程菌的成功構建，為進一步降低水蛭透明質酸酶的生產成本和擴大應用範圍奠定了一定的基礎，適合於工業化生產。
【專利說明】一種提高畢赤酵母重組表達透明質酸酶的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種提高畢赤酵母重組表達透明質酸酶的方法，尤其是一種在透明質 酸酶N端融合信號肽信號肽提高了透明質酸酶的表達產量的方法，屬於生物工程技術領 域。

【背景技術】
[0002] 透明質酸酶（Hyaluronidase，HAase)主要專一'丨生水解透明質酸，廣泛存在於真核 和原核生物中，在動物機體內參與許多重要的生物學過程，於1928年被Duran Reynals首 次發現並稱為"擴散因子"，1940年被Chain和Duthie正式命名為透明質酸酶。根據透明 質酸酶作用的底物特異性和催化機制，水蛭透明質酸酶屬於透明質酸3-糖基水解酶家族 (EC3. 2. 1. 36)，通過水解HA的β -1、3-糖苷鍵，生產以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛 酸為主的產物。水蛭來源的透明質酸酶對底物的專一性強，與其它來源的透明質酸酶相比， 它對硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素不具有活性，並且不具有轉糖苷活性，活 性不受肝素影響。因此，水蛭透明質酸酶用於臨床藥用更具醫療價值意義。
[0003] 本發明採用畢赤酵母重組生產透明質酸酶具有無法比擬的優勢，通過改變信號 肽，實現透明質酸酶的高效表達，進一步推動透明質酸酶在醫療和科研上的廣泛應用。本發 明通過人為在N端融合一段分泌信號肽顯著提高了透明質酸酶的表達產量，在N端融合的 信號肽對後加工成熟分泌都有重要影響。而這些因素也顯著影響著外源蛋白在宿主菌中的 正確摺疊、後加工修飾和順利分泌。
[0004] 本發明構建的新型重組工程菌顯著提高了重組透明質酸酶的產量，將有利於進一 步降低工業化生產水蛭透明質酸酶的成本，更有利於水蛭透明質酸酶的醫療藥用和科研範 圍的擴大。


【發明內容】

[0005] 針對重組畢赤酵母發酵生產透明質酸酶的表達量較低的問題，本發明提供一種提 高透明質酸酶在畢赤酵母中重組表達的方法，獲得了透明質酸酶產量提高的重組畢赤酵母 菌株。
[0006] 所述方法，是在水蛭透明質酸酶N端融合信號肽nsB，然後將融合基因片段連接表 達載體在畢赤酵母中進行表達；編碼所述nsB信號肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 在本發明的一種實施方式中，所述透明質酸酶基因的上遊首先融合有6Xhis_tag 序列，然後再與信號肽nsB融合。
[0008] 在本發明的一種實施方式中，編碼所述水蛭透明質酸酶的基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0009] 在本發明的另一種實施方式中，是以畢赤酵母（Pichia pastoris)GS115為宿主， 在透明質酸酶基因的上遊融合6Xhis-tag序列、nsB信號肽，連接表達載體pPIC9K，轉化 P.pastoris GS115 進行表達。
[0010] 在本發明的另一種實施方式中，PCR合成融合了 6Xhis_tag序列和信號 肽nsB的透明質酸酶基因，是以SEQ ID N0.2所示序列為模版，在上遊引物引入信號 肽nsB和6Xhis-tag的一段序列，下遊引物引入Not I酶切位點，PCR獲得基因片段 nsB-His-tag-HaseA3887,連接表達 pPIC9K，構建的重組質粒 nsB-HaseA3887HF-pPIC9K/ NT-his經Sail線性化後電轉入P.pastoris GS115中並確認nsB-HaseA3887基因重組 P.pastoris GS115 成功。
[0011] 本發明的第二個目的在於提供一種產透明質酸酶能力提高的重組畢赤酵母，是以 畢赤酵母為宿主重組表達了 N端融合了 nsB信號肽的透明質酸酶。
[0012] 在本發明的一種實施方式中，所述重組畢赤酵母是以P. pastoris GS115為宿主， 在透明質酸酶基因 HaseA3887的上遊先後融合了 6Xhis-tag序列和nsB信號肽，然後連接 表達載體PPIC9K，轉化P. pastoris GSl 15,篩選得到。編碼所述nsB信號肽的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 1所示。編碼所述透明質酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 本發明的第三個目的在於提供一種應用所述重組畢赤酵母發酵產透明質酸酶的 方法，是以BSM培養基為發酵培養基，培養至0D_為70-80,指數流加含12mL/LPTMl的甘 油，培養菌體〇D_至220-240,再流加含12mL/LPTMl的甲醇誘導培養，控制培養基中甲醇的 濃度為17. 5-18g/L，誘導培養90-96h。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，採用的發酵條件為：將種子培養液按10%的接種量 接種到含800mLBSM培養基3L發酵罐中，溫度為30°C、轉速為200rpm，pH為5. 5，培養至OD6tltl 為80,開始按指數流加方式補料培養，向罐內流加含12mL/LPTMl的甘油，流加速率F按如下 公式：
[0015] F = μ (VX) 0exp ( μ t)/Yx/S (Sf-S)
[0016] 式中，X和S分別為細胞和底物濃度（g/L)，μ為比生長速率OT1)，V為發酵液體積 (L)，S F為補加底物的濃度（g/L)，YX/S為細胞對底物的得率係數（g/g)，（VX)tl為培養體系的 初始細胞量（g)，t 為流加時間（h)。式中，μ = 0· 1761Γ1，Sf-S = 0· 435g/L，Sf = 0· 500g/ L，S = 0. 2g/L。補料結束後，繼續培養OD6c?至220,開始流加含12mL/L PTMl的甲醇進行誘 導培養，甲醇的濃度控制在18g/L，誘導培養96h。
[0017] 採用本發明方案中在上遊融合一段信號肽序列菌株，在發酵液酶比活上要比 α-factor信號肽分泌的酶比活力提高了 22%，發酵液酶活由842000U/mL提高到1026630U/ mL。利用本發明獲得透明質酸酶產量提高的方法，具有直接的目的性透明質可以直接從分 子生物學水平上進一步挖掘重組菌株產透明質酸酶的潛能，在工業上具潛在的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1所示為含不同信號肽菌株產透明質酸酶發酵液酶比活；1 :原重組菌株a-f actor-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his搖瓶發酵誘導96h產透明質酸酶的粗酶液比 活；2 :重組菌株nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his搖瓶發酵誘導96h產透明質酸 酶的粗酶液比活；3 :重組菌株 SCS3-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-his 搖 瓶發酵誘導96h產透明質酸酶的粗酶液比活；4 :重組菌株YTPl-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-his搖瓶發酵誘導96h產透明質酸酶的粗酶液比活；5 :重組菌株 HKRl-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GSl 15/NT-his 搖瓶發酵誘導 96h 產透明質酸酶的 粗酶液比活。
[0019] 圖2所示為透明質酸酶發酵液酶比活；1 :原重組菌株a-factor_HaseA3887HF -pPIC9K-GS115/NT-his上罐發酵誘導90h產透明質酸酶的粗酶液比活；2 :本發明重組 nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his菌株上罐發酵誘導90h產透明質酸酶的粗酶液比 活。
[0020] 圖3所示為重組透明質酸酶的蛋白SDS-PAGE電泳結果；M :蛋白marker ;1 :原重組 菌株 a-factor-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his 菌株誘導 90h 發酵液上清；2 :表示為 本發明重組nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-GS115/NT-his菌株誘導90h發酵液上清。

【具體實施方式】
[0021] 透明質酸酶活力單位定義：在pH5. 5和38°C下，每小時從透明質酸中釋放1 μ g葡 萄糖還原當量的還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。
[0022] DNS還原糖測定方法：水蛭透明質酸酶水解HA，通過降解β -1、3-糖苷鍵，產生帶 有還原端羥基的還原糖產物。通過DNS還原糖法測定水解HA產生的相對於葡萄糖還原當 量的還原糖產物的產生量，來計算酶比活力。
[0023] 實施例1含信號肽透明質酸酶基因（nSB-HaseA3887)表達載體的構建
[0024] 1、信號肽 nsB
[0025] 通過PCR，在核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的水蛭透明質酸酶上遊融合 6 XHis-tag標籤，得到透明質酸酶基因 HaseA3887,根據信號肽nsB基因序列與透明質酸酶 HaseA3887全長基因序列設計融合引物，分為三段融合，逐步將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示的信號肽nsB添加到HaseA3887基因序列的N端。設計引物如下：
[0026] nsBl ：
[0027] ACTTGCGTTGCAGCCACTCCTTTGGTGAAGCGTCACCACCACCACCACCACATGAAAGAnsB2 ：
[0028] TACTCTCTCTGACCGGTGTGGCTGGTGTGCTTGCGACTTGCGTTGCAGCCACTCCTTTGnsB3 ：
[0029] CGCGGATCCAAACGATGAAGCTACTCTCTCTGACCGGTGTGGCT
[0030] nsBl，nsB2, nsB3作為上遊引物，在上遊nsB3引物中含有限制性酶切位點BamHI， BYA3887R ：
[0031] TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC作為下遊引物含有限制性酶切位點 NotI。使用上述引物擴增融合信號肽nsB的HaseA3887基因，對擴增獲得的含信號肽nsB 的透明質酸酶片段進行BamHI和NotI雙酶切，連接至具有相對應切口的表達載體上（載體 PPIC9K經BamH I，Not I雙酶切），轉化至E. coil JM109中，在確保閱讀框正確的前提下鑑 定出重組表達質粒nsB-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his，經DNA測序比對，重組序列正確。重 組質粒經Sail線性化後電轉入表達宿主P. pastoris GS115中，重組克隆子經PCR驗證正 確。
[0032] 2、信號肽 α-factor、YTP1、HKR1、SCS3
[0033] 在透明質酸酶基因 HaseA3887上遊分別融合核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5所示的信號肽YTP1、HKR1、SCS3後，構建重組表達載體。
[0034] (1) α-factor
[0035] α-factor為載體pPIC9K自帶的信號肽。將Hase A3887插入到載體pPIC9K， HaseA3887擴增引物如下：
[0036] BYA3887HF:CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC ；
[0037] BYA3887R:TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC。
[0038] 上下遊引物分別引入限制性內切酶位點，上遊酶切位點為EcoR I，下遊為Not I， 對擴增獲得的透明質酸酶片段進行EcoR I和Not I雙酶切，連接至經EcoR I、Not I雙酶 切的PPIC9K上，轉化至E. coil JM109中，在確保閱讀框正確的前提下鑑定出重組表達質粒 a-factor-HaseA3887HF-pPIC9K/NT_his，經DNA測序比對，重組序列正確。重組質粒經Sal I線性化後電轉入表達宿主P.pastoris GSl 15中，重組克隆子經PCR驗證正確。
[0039] (2)信號肽YTPl、HKRl、SCS3基因直接擴增，
[0040] 信號肽YTP1、HKR1、SCS3擴增引物如下：
[0041] YTPl (F) ：CGCGGATCCAAACGATGACAGCAGCTAATAAGAA
[0042] YTPl (R) ：CCGGAATTCAGATTTCGACCCAGCCTGCACAATT
[0043] HKRl(F) ：CGCGGATCCAAACGATGGTCTCATTGAAAATAAA
[0044] HKRl(R) ：CCGGAATTCTTGCGTTGTCGTCGTCACACTAATA
[0045] SCS3 (F) ：CGCGGATCCAAACGATGTCTAGCAAATGGTTTAA
[0046] SCS3(R) ：CCGGAATTCCCCTTTCTTTACCAACATAGC
[0047] 在上下遊引物分別引入限制性內切酶位點，上遊引物中酶切位點為BamHI，下遊引 物中酶切位點為EcoRI。分別使用以上幾對引物擴增信號肽YTP1、HKR1、SCS3基因，對擴增 獲得的信號肽片段進行BamHI和EcoR I雙酶切，通過BamHI和EcoR I酶切位點連接至表達 載體 a-factor-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his，取代信號肽 α-factor，轉化至 E. coil JM109 中，在確保閱讀框正確的前提下鑑定出重組表達質粒YTPl-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his、 HKRl-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his、SCS3-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his，經 DNA 測序比對， 重組序列正確。重組質粒經Sail線性化後電轉入表達宿主P.pastoris GS115中，重組克 隆子經 PCR 驗證正確。分別得到 nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastoris GS115/NT-his、 YTPl-HaseA3887HF-pPIC9K-P.pastorisGS115/NT-his、HKRl-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-his、SCS3-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-his 這 4 株信 號肽不同的重組菌株。
[0048] 實施例2搖瓶發酵
[0049] 以重組 a-factor-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-his、 nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GSl 15/NT-his, YTPl-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-his、HKIU-HaseA3887HF-pPIC9K-P· pastoris GS115/NT-his、 SCS3-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-his 進行發酵。單克隆接種於分別接 種於IOmL YH)培養基（酵母提取物10g/L，蛋白腖20g/L，葡萄糖20g/L)，30°C、200rpm 培養24h。按10 %的接種量轉接於50ml的誘導表達培養基BMGY(酵母提取物10g/L， 蛋白腖20g/L，3g/L K2HP04，11.8g/L KH2P04，10XYNB100ml/L(13.4g/L)，500X 生物素 lmL(4X l(T4g/L)，甘油IOmL)，25°C 200rpm培養至OD6tltl值為4之間，離心收集菌體，更換至 50ml誘導表達培養基BMMY(酵母提取物 10g/L，蛋白腖20g/L，3g/L K2HPO4,11. 8g/L KH2PO4, 100XYNB100mL/L(13. 4g/L)，500X 生物素 lmL(4Xl(T4g/L)，甲醇 5mL)。25°C 200rpm 培養， 每24h向培養基中添加100%甲醇至終濃度為I. 0%進行誘導表達，誘導表達96h。
[0050] 結果如圖 1 所示，nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-his 菌株發酵 液酶比活最高，而其他均比α-factor信號肽酶比活要低。
[0051] 實施例 3 重組菌 nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-his 在 3L 發酵 罐上的誘導表達
[0052] 重組 nsB-HaseA3887HF-pPIC9K-P. pastoris GS115/NT-hiss 克隆子進行發酵培 養表達。單克隆接種於分別接種於50mL YH)培養基（酵母提取物10g/L，蛋白腖20g/L， 葡萄糖20g/L)，3(TC、200rpm培養24h。按10%的接種量接於含800mL BSM培養基（85% 磷酸 26. 7mL/L，CaSO4 · H2OO. 93g/L，K2S0418. 2g/L，MgSO4 · 7Η2014· 9g/L，K0H4. 13g/L，甘油 40. 0g/L，PTMl 4. 35mL/L)的3L發酵罐，發酵條件為：溫度為30°C、200rpm，pH為5· 5培養 至OD6tltl為80,開始補料培養，按指數流加方式向罐內流加含12mL/LPTMl (CuSO4 5H20 6g/L， KI0. 09g/L, MnSO4H2O 3g/L, H3BO3 0. 02g/L, MoNa2O4 2H20 0.2g/L, CoCl2 0. 5g/L, ZnCl2 20g/ UFeSO4 7H20 65g/L，Biotin0.2g/L，H2S04 5.0mL/L)的甘油，補料體積（mL)如下表 I :
[0053] 表 I
[0054]

【權利要求】
1. 一種提高透明質酸酶在畢赤酵母中重組表達的方法，是在水蛭透明質酸酶N端融合 信號肽nsB，然後將融合基因片段在畢赤酵母中進行表達。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述透明質酸酶基因的上遊首先融合有 6Xhis-tag序列，然後再與信號肽nsB融合。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，編碼所述nsB信號肽的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
4. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，編碼所述水蛭透明質酸酶的基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，是以P.pastoris GS115為宿主，在透 明質酸酶基因的上遊融合6Xhis-tag序列和信號肽nsB，連接表達載體pPIC9K，轉化 P.pastoris GS115 進行表達。
6. -種產透明質酸酶能力提高的重組畢赤酵母，其特徵在於，是以畢赤酵母為宿主重 組表達了 N端融合了 nsB信號肽的透明質酸酶。
7. 根據權利要求6所述的重組畢赤酵母，其特徵在於，以P.pastoris GS115為 宿主，在透明質酸酶基因的上遊融合6Xhis-tag序列和nsB信號肽，獲得基因片段 nsB-His-tag-HaseA3887,然後連接表達載體 pPIC9K，轉化 P.pastoris GS115,篩選得到。
8. 根據權利要求6或7所述的重組畢赤酵母，其特徵在於，編碼所述nsB信號肽的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 1所示；編碼所述水蛭透明質酸酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
9. 一種應用權利要求6所述重組畢赤酵母發酵產透明質酸酶的方法，是以BSM培養基 為發酵培養基，培養至〇D_為70-80,開始指數流加含12mL/LPTMl的甘油，繼續培養菌體 0D 6QQ至220-240,流加含12mL/LPTMl的甲醇，控制培養基中甲醇的濃度為17. 5?18g/L，誘 導培養90?96h。
10. 根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，採用的發酵條件為：將種子培養液按 10%的接種量接種到含8001111^31培養基31^發酵罐中，溫度為301：、轉速為200印111，？!1為 5. 5,培養至0D6(?為80,開始補料培養，按指數流加方式向罐內流加含12mL/LPTMl的甘油， 補料結束後，繼續培養0D 6(?至220,開始誘導培養，流加含12mL/LPTMl的甲醇，甲醇的濃度 控制在18g/L，誘導培養96h。
【文檔編號】C12N15/81GK104263707SQ201410526361
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月8日 優先權日:2014年10月8日
【發明者】陳堅, 堵國成, 康振, 張娜 申請人:江南大學