一種測定乳製品中乳鐵蛋白的方法

2023-06-08 01:02:01 1

專利名稱：：一種測定乳製品中乳鐵蛋白的方法
技術領域：
：本發明涉及一種測定乳製品中乳鐵蛋白的方法。
背景技術：
：乳鐵蛋白(LF)又稱"乳轉鐵蛋白"，它最早是由Sorensen等人於1939年從動物乳汁中發現一種紅色糖蛋白，它廣泛存在於乳汁、唾液、淚液等外分泌或血漿中性粒細胞中。乳鐵蛋白具有多種生物學功能，它能夠參與鐵的運轉，對腸中鐵離子具有增溶作用，並且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調節免疫系統等功能。乳鐵蛋白作為一種新興功能性食品配料，針對其提取純化工藝和應用研究在不斷的增多，它主要在初乳、嬰幼兒配方奶粉及專用免疫奶粉等產品中。目前測定乳製品中乳鐵蛋白含量的方法有很多，如酶聯免疫法、凝膠色譜法和紫外分光光度法等幾種方法。酶聯免疫吸附觀!l定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,簡稱ELISA)是在免疫酶技術(immunoenzymatictechniques)上發展起來的一種新型免疫測定技術。ELISA是將抗原、抗體特異性反應和酶的高效催化作用有機地結合起來的一種新穎、快速、實用的免疫學分析技術。ELISA是以待測抗原(或抗體)與酶標抗體(或抗原)的特異結合反應為基礎，通過酶活力測定來確定抗原(或抗體)含量的。一般ELISA過程包括抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體，再加相應酶標記抗體，生成抗原——待測抗體——酶標記抗體的複合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。藉助分光光度計的光吸收計算抗體的量。待測抗體的量與有色產物成正比。同理也可包被抗體，測定抗原含量。採用ELISA測定乳鐵蛋白含量具有靈敏度高、最小檢測限低、樣品無需純化等特點，因此該法應用範圍最廣，適用於包括初乳和專用乳粉等一系列產品中的乳鐵蛋白含量的測定，但該法受環境和操作人員的影響較大，同一個樣品在兩次包被過程後測定的結果差異較大，因此，為了保證實驗的準確性，每測定一個樣品都需要對標準曲線上所有的點進行一次重複實驗後再確定待測樣品的量，這大大的增加了實驗工作量。並且實驗所用試劑盒大多來源於進口，費用昂貴，也不適於長期大量檢測乳鐵蛋白含量。紫外分光光度法是利用乳鐵蛋白在475nm處具有特徵紫外吸收而測定的，該法具有快速簡便的特點，但此法受體系內其他物質在475nm處的幹擾明顯，其準確性稍差，因而也不適合乳鐵蛋白的準確定量。凝膠色譜法是一種HPLC方法，它具有測定準確快速、操作簡便等特點，適用於初步分離效果的監控，但對純度較低的乳鐵蛋白檢測時，由於凝膠色譜分離是利用了凝膠的多孔性，根據溶劑分子的大小進行分離的，當乳鐵蛋白與其他雜蛋白分子大小相近時，在凝膠色譜上保留時間接近，很難達到基線分離，所以，凝膠色譜法僅適用於高純度的樣品測定。因而，探尋一種成本低廉、檢測快速、準確、適用於複雜體系乳製品中乳鐵蛋白含量的檢測方法是研究的首要問題。
發明內容本發明所要解決的技術問題是克服了現有測定乳製品中乳鐵蛋白含量方法的成本高、準確性較差或樣品乳鐵蛋白含量低測定不準確等的缺陷，提供了一種準確度高，簡便快速地測定乳製品中乳鐵蛋白的方法。本發明測定乳製品中乳鐵蛋白的方法包括如下步驟將乳製品按照本領域常規方法預提純富集乳鐵蛋白，再通過陽離子交換色譜柱進行高效液相色譜(HPLC)測定含量。1、預提純富集乳製品中的乳鐵蛋白本發明中，所述的乳製品是指本領域常用的乳製品，如初乳、嬰幼兒奶粉、含有乳鐵蛋白的乳粉、還原乳或含乳飲料等。對乳製品中的乳鐵蛋白進行預提純富集可按本領域常規方法進行。本發明特別優選如下方法①離心脫脂將乳製品溶解於水中得復原乳，離心脫脂；②去除酪蛋白將脫脂乳按本領域常規方法，較佳地用0.2mol/L0.5mol/L鹽酸溶液調節pH值；pH值較佳的為4.44.8，更佳的為4.6，離心去除酪蛋白，獲得乳清溶液；(D鹽析優選硫酸銨分級沉澱法，具體步驟優選如下將乳清溶液攪拌過程中緩慢加入硫酸銨，使溶液中硫酸銨濃度較佳的為30%50%，更佳的為40%;較佳的靜置時間為l3h，更佳的靜置時間為3h;離心並取其上清液；將上清液攪拌過程中再緩慢加入硫酸銨，使溶液中硫酸銨濃度較佳的為70%~90%，更佳的為80%;較佳的靜置時間為l3h，更佳的靜置時間為3h;離心取其沉澱部分即得到預純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質量百分比。其中，所述的離心條件中較佳的離心速度為30005000r/min，離心時間1530min，更佳的離心速度為5000r/min，離心時間為30min。2、陽離子交換色譜柱進行高效液相色譜(HPLC)測定本發明中，所述的通過陽離子交換色譜柱HPLC法的分離檢測乳鐵蛋白的基本原理是由於乳鐵蛋白的等電點為7.8-8.0之間，當調整環境溶液的pH小於7.8時，乳鐵蛋白與其他部分蛋白所帶電荷極性不同。此時，乳鐵蛋白帶負電，而其他一些乳清蛋白，如a-乳清(白)蛋白、(3-乳球蛋白、免疫球蛋白等帶正電。在利用陽離子交換色譜柱分離，當待測樣品通過色譜柱時，乳鐵蛋白等帶負電的蛋白與柱填料上的陽離子位點結合，其他帶正電的物質被流動相首先洗脫出來，隨著流動相鹽濃度的不斷提高，乳鐵蛋白和其它部分帶負電的蛋白才被一一洗脫出來，進而測量乳鐵蛋白的含量。本發明中，所述的高效液相色譜法的進樣及進樣前預處理可按照本領域7常規方法進行，其優選步驟如下①將預提純富集的乳鐵蛋白樣品溶於的磷酸鹽緩衝溶液中，pH值較佳的為6.8~7.2，更佳的為7.0，得到進樣溶液；②去除雜質為了去除進樣溶液和流動相中的顆粒雜質，避免色譜柱阻塞，將進樣溶液和流動相溶液分別用濾膜過濾。進樣液量小，較佳地選用針式過濾器進行過濾；流動相量大，較佳地選用水相濾膜過濾；兩者所用濾膜孔徑均為《0.45jim，更佳的為0.2pm;③進樣，進樣體積根據柱長短來確定，較佳地，8mmx75mm的柱子進樣體積為1020pL，更佳的為10pL。本發明中，所述的陽離子交換色譜柱可選自本領域常規的陽離子交換色譜柱，可以是強陽離子交換色譜柱，也可以是弱陽離子交換色譜柱，較佳的是弱陽離子交換色譜柱。這主要是因為強陽離子交換色譜柱的結合位點與乳鐵蛋白的結合能力更強，在洗脫的過程中需要很高的離子強度才能把乳鐵蛋白洗脫出來，但是較高的離子強度對液相色譜儀器的損害較大，不利於儀器的日常維護，因此進一步優選使用弱陽離子交換色譜柱對樣品進行分析檢測。所述的陽離子交換色譜柱優選磺丙基(如ShodexIECSP-825)、磺酸基(如ProteomixSCX-NP)或羧甲基(如shodexIECCM-825)等陽離子交換色譜柱，最佳的選擇羧甲基弱陽離子交換色譜柱。所述的陽離子交換色譜柱規格較佳的選用》8.0x7.5mm的常規型號的色譜分析柱。本發明中，高效液相色譜的流動相溶液按照本領域常規方法，根據所用的陽離子交換色譜柱的交換基團而選擇。如，對本發明優選的磺丙基、磺酸基或羧甲基陽離子交換色譜柱，較佳的選用含有氯化鈉或氯化鉀的磷酸鹽緩衝溶液作為流動相。磷酸鹽緩衝溶液的pH值較佳的為6.8~7.2，更佳的為7.0。在高效液相色譜梯度洗脫程序中，通過調節泵的輸入梯度，使流動相氯化鈉或氯化鉀鹽濃度的不斷增加，從而分離乳鐵蛋白，具體過程如下流動相中，隨著氯化鈉或氯化鉀的濃度的不斷增加，不與色譜柱陽離子基團結合的正電蛋白或結合力較弱的蛋白被率先洗脫出來，洗脫液中鹽濃度的不斷提高，當洗脫液中氯化鈉或氯化鉀的濃度達到0.9mol/Llmol/L時，乳鐵蛋白開始洗脫出來，當鹽濃度達到l.l~1.2mol/L時乳鐵蛋白基本被洗脫完全，此時繼續提高濃度直至1.41.5mol/L並持續一段時間，使其他結合力更強的雜質被完全洗脫出來，從而有利於色譜柱的反覆使用。本發明一優選實例中，高效液相色譜法的梯度洗脫程序如下-tableseeoriginaldocumentpage9上述優選條件中，所述的磷酸鹽緩衝溶液中的共軛酸鹼較佳的為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀；所述的磷酸鹽緩衝溶液的濃度較佳的為0.01~0.05mol/L，更佳為0.02mol/L;所述的濃度是指緩衝溶液中共軛酸鹼的總濃度。本發明中，高效液相色譜法測定的其他色譜條件為本領域常規條件。優選條件為流動相流速較佳的為0.21.0mL/min，更佳的為0.5mL/min;檢測波長較佳的為260~300nm，更佳的為280nm;柱溫較佳的為2530°C，更佳的為30。C。本發明中，乳鐵蛋白的含量可通過本領域常用的定量分析方法確定的，較佳地選用外標法或內標法計算峰面積，從而確定乳鐵蛋白的含量。本發明中所述的硫酸銨、磷酸鹽、氯化鈉和氯化鉀的純度可用本領域常規使用純度，較佳的選用分析純。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在於1.本發明將乳製品的常規預處理方法與陽離子交換色譜柱兩者之間有機的結合，解決了複雜乳製品體系中乳鐵蛋白的快速富集和準確定量分析的問題，該法與目前常用的酶聯免疫法相比，具有檢測費用低、準確程度高、受環境變化影響小等優點，有利於乳鐵蛋白在乳製品中的應用，且該法也為其他功能性乳成分的快速定量分析提供了一定的理論依據。2.採用陽離子交換色譜柱對樣品進行分離分析乳鐵蛋白含量，與常規使用的凝膠色譜柱相比，除了依靠樣品之間分子大小的差異和分子間作用力的不同來進行分離外，離子交換色譜還依靠樣品在不同pH條件下所帶電荷的多少來實現樣品間的分離，使樣品之間能夠很好的實現基線分離，從而達到準確定量分析的目的。3.本發明優選的預分離富集方法中，利用調節pH和硫酸銨分級沉澱來富集乳製品中的乳鐵蛋白，與常規使用的蛋白純化工藝超濾和柱層析相比，具有處理量小、快速、簡單易行的特點。圖l為乳鐵蛋白標準品的HPLC曲線圖。圖2為實施例1試驗1中初乳的乳鐵蛋白檢測的HPLC曲線圖。圖3為HPLC法測定乳鐵蛋白質量濃度的標準曲線圖。具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下述實施例中，緩衝溶液的濃度是指緩衝溶液中共軛酸鹼的總濃度。實施例13的高效液相色譜法條件色譜柱IECCM—825羧甲基弱陽離子交換色譜柱(8mmx75mm，Shodex公司，日本)；流動相A溶液pH7.0的0.02mol/L的磷酸鹽緩衝溶液；B溶液pH7.0的含1.5mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸鹽緩衝溶液；流速0.5mL/min;檢測波長280nm;進樣體積20pL;柱溫30°C。工作曲線的繪製(外標法測定物質含量)準確稱取乳鐵蛋白標準品(江南大學測試中心提供，圖1)製成的乳鐵蛋白溶液濃度分別為0.054.0mg/mL;用高效液相色譜測定溶液在280nm處的吸收峰繪製標準曲線如下Y=494439X+25044(R2=0.9991，圖3)。實施例l初乳粉中乳鐵蛋白的含量測定準確稱取5g初乳粉(由戴緯林國際貿易公司提供)樣品，使其完全溶解於200rnL水中，然後以5000r/min速度離心30min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.2mol/L稀鹽酸將初乳溶液調節至pH值為4.6，去除初乳中的酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向攪拌的乳清溶液中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨濃度為40%，靜置3h，離心取其上清液部分；然後再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為80%，靜置3h，離心取其沉澱部分即得到預純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH7.0的0.02mol/L磷酸鹽緩衝溶液溶解於10mL容量瓶中，調整pH值至7.0，再用0.45jtim纖維素濾膜針式過濾器至樣品瓶內，搖勻後供高效液相色譜測定。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表l:表l採用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表序號時間/min流速/mL/minA泵/%B泵/%150.510002100.540603250.540604500.520805600.520806700.501007800.51000通過上述分析方法對同一份初乳粉樣品進行5次分析，試驗1的HPLC測定如圖2所示，每次分析都能夠將乳鐵蛋白與其他雜蛋白的基線分離，對照標準曲線，結果如下表2:tableseeoriginaldocumentpage12上表2結果計算得到的相對標準偏差RSD=2.70%。由上式可以看出，相對偏差為2.70%，表明其重現性良好。實施例2嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白的含量測定準確稱取2030g嬰幼兒奶粉(市售，光明乳業股份有限公司生產)樣品，使其完全溶解於200mL水中，然後以5000r/min速度離心30min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.2mol/L稀鹽酸將乳粉溶液調節至pH值為4.6，離心去除奶粉中的酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向乳清溶液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為40%，靜置3h，離心取其上清液部分；然後再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為80%，靜置3h，離心取其沉澱部分即得到預純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH7.0的0.02mol/L磷酸鹽緩衝溶液溶解於10mL容量瓶中，調整pH值至7.0，再用0.45pm纖維素膜針式過濾器過濾至樣品瓶內，搖勻後供高效液相色譜測定。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表3:表3採用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表序號時間/min流速/mL/minA泵/%B泵/%10.510002100.54060250.540604500.52080600.520806700.501007800.51000通過上述分析方法對同一嬰幼兒奶粉樣品進行5次分析，每次分析都能夠很好的實現乳鐵蛋白與其他雜蛋白的基線分離，對照標準曲線，結果如下表4:表4同一份嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白含:量的測定序號峰面積保留時間/min樣品含量mg.g"128610838.2530.528229451338.3460.545330489638.4230.566429154638.7580.573529708439.0440.539上表4結果計算所得的相對標準偏差RSD=3.41%。由上式可以看出，相對偏差為3.41%，表明其重現性良好。實施例3乳飲料中乳鐵蛋白的含量測定取乳飲料樣品(光明乳業有限公司技術中心自製)500ml，以5000r/min速度離心30min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.2mol/L稀鹽酸將乳飲料調節至pH值為4.6，離心去除酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向乳清溶液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為40%，靜置3h，離心取其上清液部分；然後再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為80%，靜置3h，離心取其沉澱部分即得到預純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH7.0的0.02mol/L磷酸鹽緩衝溶液溶解於10mL容量瓶中，調整pH值至7.0，再用0.45pm纖維素針式過濾器過濾至樣品瓶內，搖勻後供高效液相色譜測定。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表5:表5採用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表tableseeoriginaldocumentpage14通過上述分析方法對同一種乳飲料樣品進行5次分析，每次分析都能夠很好的實現乳鐵蛋白與其他雜蛋白的基線分離，對照標準曲線，結果如下表6:tableseeoriginaldocumentpage14上表6結果計算所得的相對標準偏差RSD=3.10%。由上式可以看出，相對偏差為3.10%，表明其重現性良好。實施例4對嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白的含量測定準確稱取2030g嬰幼兒奶粉(市售，光明乳業股份有限公司生產)樣品，使其完全溶解於200mL水中，然後以3000r/min速度離心30min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.5mol/L稀鹽酸將初乳溶液調節至pH值為4.4，去除初乳中的酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向攪拌的乳清溶液中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨濃度為50%，靜置lh，離心取其上清液部分；然後再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為90%，靜置lh，離心取其沉澱部分即得預純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH7.2的0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液溶解於10mL容量瓶中，調整pH值至7.2，再用0.45pm纖維素濾膜針式過濾器至樣品瓶內，搖勻後供高效液相色譜測定。高效液相色譜法條件色譜柱IECSP-825磺丙基弱陽離子交換色譜柱(8mmx75mm，Shodex公司，日本)；流動相A溶液:pH7.2的0.01mol/L的磷酸鹽緩衝溶液；B溶液pH7.2的含1.5mol/LKCl的0.01mol/L磷酸鹽緩衝溶液；流速0.2mL/min;檢測波長260nm;進樣體積10pL;柱溫25。C。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表h表l採用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表tableseeoriginaldocumentpage15蛋白的基線分離，結果樣品含量為0.535mg，g'1。實施例5初乳粉中乳鐵蛋白的含量測定準確稱取5g初乳粉(由戴緯林國際貿易公司提供)樣品，使其完全溶解於200mL水中，然後以5000r/min速度離心15min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.5mol/L稀鹽酸將初乳溶液調節至pH值為4.8，去除初乳中的酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向攪拌的乳清溶液中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨濃度為30%，靜置3h，離心取其上清液部分；然後再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為70%，靜置3h，離心取其沉澱部分即得預純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH6.8的0.05mol/L磷酸鹽緩衝溶液溶解於10mL容量瓶中，調整pH值至6.8，再用0.45pm纖維素濾膜針式過濾器至樣品瓶內，搖勻後供高效液相色譜測定。高效液相色譜法條件色譜柱SCX-NP磺酸基弱陽離子交換色譜柱(8mmx75mm，Proteomix公司)；流動相A溶液pH6.8的0.05mol/L的磷酸鹽緩衝溶液；B溶液pH6.8的含1.5mol/LNaCl的0.05mol/L磷酸鹽緩衝溶液；流速1.0mL/min;檢測波長300nm;進樣體積20fxL;柱溫30°C。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表1:_表l採用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表序號時間/min流速/mL/minA泵/%B泵/%1100.510002200.540603300.540604600.527735800.527736900.5010071000.51000通過上述分析初乳粉樣品，將乳鐵蛋白與其他雜蛋白的基線分離，結果樣品含量為1.825mg'g'1。權利要求1、一種測定乳製品中乳鐵蛋白含量的方法，其特徵在於其步驟包括將乳製品按照現有方法預提純富集乳鐵蛋白，再通過陽離子交換色譜柱進行高效液相色譜測定含量。2、如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的陽離子交換色譜柱為弱陽離子交換色譜柱。3、如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的陽離子交換色譜柱為磺丙基、磺酸基或羧甲基陽離子交換色譜柱；所述的陽離子交換色譜柱規格為》8.0x7.5mm。4、如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的高效液相色譜法測定的流動相溶液為pH值為6.8~7.2的含有氯化鈉或氯化鉀的磷酸鹽緩衝溶液；所述的高效液相色譜法的梯度洗脫程序為-tableseeoriginaldocumentpage25、如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的高效液相色譜法的梯度洗脫程序為tableseeoriginaldocumentpage2tableseeoriginaldocumentpage36、如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的高效液相色譜法測定的色譜條件為流動相流速為0.2-1.0mL/min;檢測波長為260300nm;柱溫為25~30°C。7、如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的高效液相色譜法測定的進樣及預處理步驟為-①將預提純富集的乳鐵蛋白樣品溶於pH值為6.87.2的磷酸鹽緩衝溶液中，得進樣溶液；②去除雜質將進樣溶液用針式過濾器進行過濾，流動相溶液用水相濾膜過濾，濾膜孔徑為《0.45iam;(D進樣進樣體積為1020pL。8、如權利要求4或7所述的方法，其特徵在於所述的磷酸鹽緩衝溶液中的共軛酸鹼為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀；所述的磷酸鹽緩衝溶液的濃度為0.010.05mol/L，所述的濃度是指緩衝溶液中共軛酸鹼的總濃度。9、如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的現有方法預提純富集乳鐵蛋白的步驟如下-①離心脫脂將乳製品溶解於水中得復原乳，離心脫脂；②去除酪蛋白將脫脂乳用0.2mol/L0.5mol/L鹽酸溶液調節pH為4.44.8，離心去除酪蛋白，獲得乳清溶液；③鹽析硫酸銨分級沉澱法步驟如下將乳清溶液攪拌加入硫酸銨至硫酸銨濃度為30%50%，靜置l~3h;離心並取上清液；將上清液攪拌加入硫酸銨至硫酸銨濃度為70%90%，靜置l~3h;離心取沉澱即得預提純富集的乳鐵蛋白，百分比為質量百分比；上述步驟中所述的離心的條件為離心速度為3000~5000r/min，離心時間1530min。10、如權利要求1或9所述的方法，其特徵在於所述的乳製品為初乳、嬰幼兒奶粉、含有乳鐵蛋白的乳粉、還原乳或含乳飲料。全文摘要本發明公開了一種測定乳製品中乳鐵蛋白的方法。通過將乳製品的常規預處理方法與陽離子交換色譜柱兩者之間有機的結合，解決了複雜乳製品體系中乳鐵蛋白的快速富集和準確定量分析的問題，具有檢測費用低、準確程度高、受環境變化影響小等優點。文檔編號G01N30/96GK101672835SQ200810042678公開日2010年3月17日申請日期2008年9月9日優先權日2008年9月9日發明者璐任,孟令潔,雲張,鵬張,張鋒華,鋒杭,王蔭榆,郭本恆,龔廣予申請人:光明乳業股份有限公司