利可君非對映異構體的結構確認和測定方法
2023-06-07 20:43:06 1
專利名稱：利可君非對映異構體的結構確認和測定方法
技術領域：
；本發明涉及藥物製劑領域，公開了利可君非對映異構體的結構確認和測定方法。
背景技術：
利可君(曾用名利血生)化學名為2-(α-苯基-α-乙氧羰基-甲基)噻唑烷-4-羧酸，為升白細胞藥。結構式見
圖1，圖1為利可君結構。
分子式C14H17O4NS分子量295.36利可君用於預防和治療各種原因引起的白細胞、血小板減少症，臨床主要用於腫瘤放化療、內分泌失調治療藥物等引起的白細胞、血小板減少症的治療。因利可君有三個手性碳，故有多個四個非對映異構體。而目前國家藥品標準分析方法是非水滴定法，此外也有研究使用直接和間接紫外分光光度法、一階導數分光光度法、間接原子吸收法、單掃描示波極譜法、流動注射化學發光法、流動注射分光光度等的報導，但這些方法都缺乏專屬性，不能真實的反映藥物內在質量，有可能影響藥物的治療效果，使臨床使用的推廣受到限制。
本發明提供了一種克服了現有利可君結構缺陷，對利可君非對映異構體進行了結構確認，並提供了測定方法。
發明目的本發明的目的首先是對利可君非對映異構體進行了結構確認，其次，本發明的另一目的是提供測定方法。
發明內容
本發明是在研究過程中發現國家藥品標準分析方法測定含量為99％以上的利可君樣品，配製成溶液後立即用HPLC法測定，色譜圖中有多個峰，溶液放置後，各色譜峰面積會發生變化(見圖2，圖2為利可君對照品色譜圖；見圖3，圖3為利可君溶液放置達平衡時液質聯用色譜圖)。為此，首先進行了溶液狀態下利可君及其有關物質的結構研究；為了研究在溶液狀態下上述多個峰產生的原因，本研究中綜合應用了HPLC-MS/MS、HPLC-DAD、HPLC/1H-NMR等研究方法，確證利可君在溶液中存在非對映異構體相互轉化的現象，並用量子化學計算結果闡述其轉變的理論依據。為建立利可君及其有關物質的HPLC法測定提供方法學依據。
1.儀器與試劑日本島津公司LC-10A VP型高效液相色譜系統，SPD-10A VP型紫外檢測器；浙江大學智能信息工程研究所N2000色譜工作站；美國Finnigan公司TSQ型Quantum Ultra AM型LC-MS/MS聯用儀，電噴霧離子源(ESI)以及Xcalibur 2.1數據系統。Agilent 1100 Series高效液相色譜儀，Agilent 1100 Series二極體矩陣檢測器，Chemstations.Varian公司的Inova-500LC-NMR聯用儀，其中高效液相色譜儀為Prostar-230。Gaussian03軟體用於量子化學計算。
2.HPLC-MS/MS用HPLC-MS/MS進行研究質量掃描範圍m/z 100-300，無論是剛配製好還是放置達平衡的溶液，後四個峰(圖3為利可君溶液放置達平衡時液質聯用色譜圖)的一級質譜的m/z均為295.76，均與利可君[M+H]+相應[見圖4，圖4為利可君(後四個峰)一級質譜圖]；它們的二級質譜碎片峰也完全相同[見圖5，圖5為利可君(後四個峰)二級質譜圖]，碎片離子豐度最大的m/z為131.80，用該碎片離子檢測所得色譜圖和用母離子峰檢測所得的色譜峰形狀和比例均完全相同[見圖6，圖6為利可君溶液放置達平衡後選擇碎片離子(m/z131.80)掃描色譜圖]。
3.HPLC-DAD應用HPLC-DAD，在210nm檢測波長下，色譜峰尖處的紫外光譜圖一致(見圖7，圖7為利可君色譜圖和光譜圖)。記錄了每個組分的峰上坡、峰頂和峰下坡3個不同部位在200-400nm波段的光譜疊合進行比較，四個峰的光譜圖相同，經DAD檢測，各峰的三維圖譜相似(見圖8，圖8為利可君的三維色譜圖)，峰的純度均很高。
4.HPLC-1H-NMR用HPLC-1H-NMR進行研究，由於溶劑峰抑制不完全，水峰包埋了2號碳上的氫。乙腈中有1％的丙腈，對6號碳上的氫有影響。圖9為對照品利可君1H-NMR譜，將它和HPLC-NMR分離出四個峰圖譜進行氫的個數和化學位移比較，發現圖譜基本一致。不同之處在於異構體3和4號手性碳上的氫的化學位移有變化，可以確認四個組分有相同的結構，只是空間構型有所不同，圖10為利可君四個組分峰(1-4)氫譜(HPLC-1H-NMR)的手性碳相連氫(3-H，4-H)譜放大圖譜。
5.非對映異構體上述三種聯用技術可以確認這四個峰為其非對映異構體產生。利可君分子中有三個手性碳，其中5號手性碳在合成中確定為R構型，還有3、4為兩個手性碳，共產生四個非對映異構體(3S，4R，5R；3R，4R，5R；3R，4S，5R；3S，4S，5R，見圖11，圖11為利可君的四個非對映異構體)。
6.量子化學計算(Quantum Calculation)為了研究利可君的四個非對映異構體轉化原因，我們用Gaussian03軟體對四種構型在氣相和乙腈溶劑中分別進行了計算。計算方法首先用hf/6-31g(d)(hf方法，使用6-31g(d)基組)進行幾何構型優化，然後在hf/6-31g(d)優化好的結構上進行mp2/6-31g(d)(mp2方法，使用6-31g(d)基組)單位計算，得到各自構型的能量如下(見表1)表1利可君四個非對映異構體基態能量及相對能量(以a.u.為單位)
通過上述量子化學計算表明利可君非對映異構體的穩定性順序為3R4S5R＞3S4S5R＞3R4R5R＞3S4R5R。在氣相中，3R4S5R能量最低，它在異構體中的穩定性最好。在固體狀態下，利可君應主要以3R4S5R形式存在，這就解釋了為什麼利可君在溶解初期是以一種異構體為主的原因。當利可君溶解在乙腈溶液中，四個非對映異構體的能量差明顯變小，故其在溶液中易於轉化。實驗表明用乙腈溶解利可君，待非對映體轉化平衡後，用N2將溶液吹乾，得固體樣品溶解後注入液相色譜，發現色譜圖和溶解初期相似，這就證明了轉化平衡過程中的存在，實驗結果與量子化學計算相符。根據非對映異構體能量高低和流出色譜峰面積大小之間關係，可以確定四個色譜峰依次為3S4S5R、3R4R5R、3R4S5R、3S4R5R，理論計算為四個非對映異構體確認及轉化提供了理論依據。
非對映異構體在溶液中是動態平衡，HPLC-NMR研究表明經過液相色譜分離得到的單一異構體，停留在微量探頭中，供核磁共振測定採樣，累加12小時後，發現在圖譜中是混合物的峰值，說明異構體在溶液中不停地轉化，直到平衡。
溶液初期色譜圖上只有五個峰，峰1為雜質，經面積歸一化分析雜質峰1佔3.4％，後四個峰為利可君分子四種不同構型，2、3、4、5分別佔3.0％、1.0％、92.0％、0.6％，在溶液中可相互轉化，可用四個峰面積之和來定量。
7.測定方法色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基矽烷健合矽膠為填充劑；以不同比例的水-乙腈-冰醋酸或水-乙腈為流動相；柱溫為30℃；檢測波長為210nm。
測定法 取利可君約10mg，精密稱定。置100ml量瓶中，加乙腈或磷酸鹽緩衝液(pH6.8)-乙腈適量，超聲處理使利可君溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取利可君對照品適量，精密稱定，加乙腈或磷酸鹽緩衝液(pH6.8)-乙腈適量，超聲處理使利可君溶解，用流動相稀釋製成每1ml中含100μg的溶液，同法測定。按外標法以峰面積(四個非對映異構體峰面積之和)計算，即得。
權利要求
1.其特徵是利可君(曾用名利血生)由四個非對映異構體組成。
2.權利要求1的利可君四個非對映異構體在溶液中不停地轉化，至達到動態平衡。
3.權利要求1和2的利可君四個非對映異構體在溶液中不停地轉化，達到動態平衡，其液相色譜峰的面積之和不變，故可用四個峰面積之和進行含量測定。
4.權利要求1和2、3的利可君測定的色譜條件與系統適用性試驗為用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以不同比例的水-乙腈-冰醋酸或水-乙腈為流動相；檢測波長為210nm。
全文摘要
本發明公開了一種利可君非對映異構體的結構確認和測定方法。本發明包括以下內容利可君(曾用名利血生)有四個非對映異構體，他們在溶液中不停地轉化，直到平衡，故可用四個峰面積之和來定量測定。利可君測定的色譜條件與系統適用性試驗為用十八烷基矽烷健合矽膠為填充劑；以不同比例的水－乙腈－冰醋酸或水－乙腈為流動相；柱溫為30℃；檢測波長為210nm。本發明提供了一種克服了現有利可君製劑質量檢測方法中含量測定方法的缺陷，而且便於操作、準確性和靈敏性、可靠性都高於原方法的一種技術先進的含量測定方法。
文檔編號C07D277/00GK1865251SQ20051002254
公開日2006年11月22日 申請日期2005年12月23日 優先權日2005年12月23日
發明者張宏業 申請人:張宏業