乳類蛋白質水解的方法
2023-06-08 00:02:36 1
專利名稱：乳類蛋白質水解的方法
技術領域：
本發明涉及包含水解的乳酪蛋白(milk casein)和優選非水解的乳清蛋白的組合物，尤其涉及用於水解產物生產的新方法，其中水解產物包含水解的酪蛋白和優選非水解的乳清蛋白。因此，上述水解產物可以用於飲料製作，例如運動飲料和軟飲料、營養品、幼兒營養品或者多種食品或發酵產品。
背景技術：
牛奶的蛋白質成分是與健康有關的。促進健康的特性不僅在於該蛋白質成分的營養方面，而且也在於多種健康促進因子的存在。
乳類蛋白質(milk protein)由大約80％的酪蛋白組成。其餘的蛋白質由各種乳清蛋白構成。酪蛋白成分是幼小動物生長所需要的胺基酸、鈣和磷酸鹽的主要來源。乳清蛋白成分也是胺基酸的來源之一，此外，其含有若干種生物活性的和被認為是促進健康的蛋白質，例如免疫球蛋白、葉酸結合蛋白質、乳鐵傳遞蛋白、乳過氧化物酶和溶菌酶。眾所周知，在酪蛋白和乳清蛋白成分的代謝中，也形成一定量的新的生物活性肽。該新形成的生物活性肽的實例包括酪嗎啡(casomorphin)、酪激肽(casokinin)、免疫球蛋白、免疫肽、酪蛋白磷酸肽(caseinephosphopeptides)、lactiphins和乳鐵蛋白(lactoferricin)。因此，在奶中組合物形式的酪蛋白和乳清蛋白的應用提供了顯著的營養的和健康的益處。
更近期地工業製備的乳類蛋白質水解產物也被發現含有新形成的生物活性肽以及值得注意的ACE抑制劑以對抗高血壓。
乳類的白色外觀是由脂肪小球和酪蛋白微粒引起的光的散射導致的。脫脂乳，也就是全部脂肪已經被從中除去的乳類，由於這些酪蛋白微粒也呈白色。
乳類的乳清蛋白成分，也就是脂肪和酪蛋白成分都除去之後的乳類，是帶有淡黃色但是澄清的蛋白質溶液，它富含多種蛋白質、肽、乳糖、礦物質和維生素。所有這些組分即使在酸性條件下也完全可溶。儘管如此，作為在噴霧乾燥時部分變性的結果，乳清蛋白的溶解可以產生混濁的溶液。不完全的酶的水解作用可以改進這些略微變性的噴霧乾燥的乳清蛋白的溶解特性。更徹底的乳清蛋白的酶水解進一步改進了其可溶性，但也導致在苦味和游離胺基酸存在水平方面的適度增加。更徹底的乳清蛋白的酶水解的通常目的是實現變態反應原的減少和提高腸道吸收。特別是減少變態反應原方面在商業上是重要的。例如在北歐不同國家中，在兩歲內的嬰兒的總人口中的大約3％已經被診斷為牛奶不耐受。β乳球蛋白和酪蛋白一起屬於牛奶中的主要變態反應原。成人很少顯示出牛奶變態反應，針對這個人群的特製產品必須被製成是易於吸收的，提供好的味道，並且顯示出良好的貨架穩定性，尤其在酸性條件下。因此，存在著對於目的在於臨床、飲食和體育以及幼兒營養品方面應用的有關乳清水解產物徹底酶切消化的相當多的文獻是不令人奇怪的。
與乳清相反，酪蛋白富含疏水胺基酸，以致其水解產物是出了名的苦，而且往往有腐臭的和肉湯樣的不好的味道(off-taste)。由於其極度的苦味，酶水解的酪蛋白僅僅獲得了有限的用途。此外，其疏水胺基酸的高含量使得酪蛋白衍生的肽難以溶解，尤其在酸性條件下。
在文獻中敘述的不完全的酪蛋白水解產物的製備方法通常包括用幾種蛋白內切酶(endoprotease)進行的多步驟水解，接著用一種或多種蛋白外切酶(exoprotease)溫育。多種蛋白內切酶的組合物通常被用於獲得為儘可能減小變態反應和提高可溶性所需要的高水解度(高DH)。接下來的使用蛋白外切酶的溫育釋放氨基或羧基末端的胺基酸殘基，以將苦味減至最少。但是，游離胺基酸的釋放意味著產量的降低和減少的營養價值。因為高水平的游離胺基酸也可以導致肉湯樣的不好的味道和最終水解產物的升高的滲透值，所以，通常的作法是附加加工步驟以去除游離胺基酸以及引起苦味的強疏水性的肽。
歐洲專利申請EP 0 610 411敘述了具有低分子量肽和15～35％數量級的DH值的、良好的器官感覺質量的完全可溶的酪蛋白水解產物。
專利申請WO 96/131744敘述了乳類蛋白質水解產物生產的方法，其特徵在於水解反應，所述水解反應涉及任何來自芽孢桿菌的中性或鹼性蛋白酶和麴黴的酶複合物的組合，其中該酶複合物包含內肽酶和外肽酶，該方法的特徵還在於35％-55％的水解度。
歐洲專利申請EP 384 303敘述了用氨肽酶生產顯示出低苦味和低DH值的蛋白質水解產物的方法。
歐洲專利申請EP 223 560敘述了通過順序酶解的方法來生產乳類蛋白質的方法。
歐洲專利申請EP 0 631 731敘述了包含乳清蛋白和酪蛋白的蛋白質混合物的不完全水解產物，其中水解產物具有4～10％的水解度，並且採用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的組合物來獲得低苦味水解產物。
美國專利US 4,600,588敘述了由已經用其它(a.o.)酸性真菌蛋白酶處理過的、酸沉澱的酪蛋白組成的乳類蛋白質水解產物。
日本專利申請JP 11243866敘述了應用於飲料和食品的酪蛋白水解產物，它是無味道並無氣味的，具有17～30％的水解度。
發明概述本發明提供了包含乾重比為9∶1～1∶1的水解酪蛋白蛋白質和乳清蛋白的蛋白質組合物。優選的是乳清蛋白為未水解的。在水解的酪蛋白蛋白質和乳清蛋白在10℃以40g蛋白質(乾重)/升的量在水中溶解或存在時，蛋白質組合物在pH值為4的情況下是澄清的液體。
在蛋白質組合物包含少於40g蛋白質(乾重)/升的情況下，當濃縮為40g蛋白質(乾重)/升的液體時，該組合物在10℃仍是澄清的液體。
本發明還提供了包含酪蛋白蛋白質和乳清蛋白的組合物的生產方法，其中至少酪蛋白成分是水解的。
本發明還提供了包含本發明組合物的產品，例如；飲料，如運動飲料或軟飲料或健康飲料；或者營養食品，如面向老年人或減肥人群的產品，或者嬰兒食品，如足月的或後繼的產品(term or follow-onproduct)。此外，它可以是發酵的產品，或者可以將其加到多種個人護理產品中。
發明詳述根據本發明的產品優選地包含以牛奶中存在比例存在的乳清蛋白和酪蛋白。為利用存在的生物活性肽和蛋白質，乳清蛋白的酶水解優選地應為最少。酪蛋白的酶水解應足夠充分以保證在酸性條件下蛋白質的澄清產品中的高產量。因此，通過有效量的酶以有效的時間，將酪蛋白蛋白質水解，以產生幾乎完全水解的蛋白質。幾乎完全水解的意思是指僅幾個百分數的酪蛋白酸鹽不完全可溶，並且可以在最終的水解產物中引起一些混濁。相似地，乳清部分會含有某些殘餘不溶的物質，例如微量的酪蛋白。為從酪蛋白水解產物和乳清的混合物中去除這類不可溶的物質，低速離心(2000～5000g)，或者簡單的沉降再加上傾析法提供了工業上可接受的工藝步驟，來獲得澄清的產品。應當知道，常規的牛奶不可以採用低速離心或者沉降/傾析步驟來澄清。在水解的酪蛋白蛋白質與乳清蛋白混合之後，優選地，在進行低速離心之後，當以40g蛋白質(乾重)/升的量在水中溶解或存在時，在pH值為4的情況下，所得的產物產生出澄清的液體。通常，水解作用在pH值3.5～9，溫度40～80℃下進行。優選的蛋白質水解產物具有與牛奶中存在的相同的乳清與酪蛋白的比例，並且在酸性條件下是澄清的。優選的水解產物具有改進的中性或柔和味道和良好的貨架穩定性。
如果在10℃、pH值為4，以480納米並使用1cm的玻璃比色槽，檢測其光學吸收度是1.00以下，則液體組合物是「澄清的」，如果是針對已經在20,000g持續20分鐘離心之後獲得的在10℃、pH值為4的相同組合物的上清液進行檢測，則優選為0.50以下。
本發明提供了乳類蛋白質水解產物的混合物，優選為酪蛋白水解產物和乳清的混合物，其酪蛋白對乳清的乾重比為9∶1～1∶1，優選為牛奶中存在的比例。此外，本發明提供了上述混合物和其衍生的營養飲料的生產方法。蛋白質水解產物也可以用於嬰兒配方、營養食品、營養藥(nutraceutical)、冰激凌、調味品、發酵產品、酸乳酪以及個人護理產品。通常，與牛奶比較，根據本發明的組合物有力地減少了變態反應原。通常，根據本發明的組合物具有柔和或中性的味道和在酸性條件下改善的可溶性和透明度，並且可以作為基礎應用於其它飲料，例如運動飲料或軟飲料或健康飲料或者發酵產品。術語「柔和味道」指的是苦味水平類似於或低於15mg/升的溶解在蒸餾水中的激肽硫酸鹽在14℃品嘗的水平。
為進一步提高本發明產品的健康益處，可以將蛋白質組合物與維生素濃縮物、水果或水果成分組合，以提高最終產品維生素和纖維含量，甚至與水解產物成分組合，以提高生物活性肽的水平。此外，可以將本發明的產品用多種微生物培養物來發酵，從而改善味道、提高健康益處或提高最終產品的粘度。理想地，發酵是在40～50℃溫度下與脯氨酸特異性蛋白內切酶的溫育同時進行。如果所用的引子培養物導致高粘度，那麼最好在低速離心步驟之後進行發酵。在用適合的引子培養物或多種引子培養物的組合物接種之後，將全部混合物發酵直到達到規定的酸性pH值為止，然後冷卻至10～20℃。可以將這樣生產的發酵基質與水或汁液勻漿或稀釋，冷卻至4℃，然後裝入到規定的零售容器中，即用或不用巴氏消毒法或滅菌步驟。為在有著非醫學需要的消費者中獲得廣大消費者的接受，最重要的是較高的可口性以及一定的物理化學特性，如在酸性條件下的可溶性。澄清和非白色的外觀是重要的優點，以及沒有氣味和香味，例如通常與乳產品相關的雙乙醯的氣味。為此，本發明提供了一種方法，以生產一種在酸性條件下澄清的液體，它有著與牛奶相比更低的變態反應原，並且具有促進健康的特性和奶的營養效果，它可以應用於食品用途中，如飲料，包括碳酸飲料、發酵產品和食物產品。
根據本發明的水解產物生產方法可以通過使用脫脂奶、脫脂奶粉、乳類蛋白質濃縮物、優選比例的乳清蛋白與酪蛋白混合物或者分離的乳清蛋白成分和分離的酪蛋白成分(它們後來被混合以獲得優選比例的混合物)作為起始材料來進行，或者它們可以在(部分)成分水解後混合或者可以在水解時混合。
乳清蛋白可以來源於從製作乾酪中獲得的液態乳清，優選為甜乳清，例如，用從混雜的酪蛋白中進一步純化的動物或微生物粗製凝乳酶使酪蛋白凝結所得到的，例如通過酸化作用接著離心。優選採用濃縮的非噴霧乾燥的乳清產品。可選地，可以使用商業上可得到的乳清蛋白粉，例如BiPRO(Davisco Foods International)、PROXIME 660或HIPROTAL 875或DOMOVICTUS 535(BDI，荷蘭)或者更優選其非噴霧乾燥的等價物。可選地，所用的乳清已經被非蛋白水解酶處理，例如乳糖酶，以把存在的乳糖轉變為葡萄糖和半乳糖。可選地，乳清物質可以是脫礦質的。
本發明優選地設想了乳清蛋白成分的沒有或僅有很有限的水解。另外，本發明設想了其中乳清成分和酪蛋白成分均被水解的水解產物，這種水解如同在例如脫脂奶或脫脂奶粉水解時將發生的。脫脂奶是將脂去除的奶，因此，優選地含有少於1g/升的脂肪，更優選的少於0.8g/升。在根據本發明採用脫脂奶或脫脂奶粉作為起始材料的產品中，分子量在1500道爾頓以下的肽成分一般佔本發明的組合物中存在的蛋白質的85wt％以上，而分子量在5000道爾頓以下的肽成分一般佔本發明的組合物中存在的蛋白質的95wt％以上。因此，根據本發明的產品與起始蛋白質比較，將優選地顯示出顯著地減少了的變態反應原。本發明還設想了具有較低滲透值的水解產物，比如，可以在納米過濾、離子交換或電透析後獲得。
酪蛋白成分的透明度和酸可溶性可以通過酶水解酪蛋白微團成較小的肽而獲得。酪蛋白的來源可以是酶凝乾酪素、酸性酪蛋白，或者鈉、鈣或鉀的酪蛋白酸鹽。對於本發明的方法，將蛋白質稀釋或重構成一種溶液，該溶液含有每升10～150克蛋白質(1～15％w/w)，優選為每升20～60克蛋白質。
為獲得部分水解產物，首先將蛋白質用蛋白內切酶處理，所述酶具有4-10的最佳pH值，並且優選在成簇的疏水胺基酸殘基的羧基末端側切開蛋白質。優選地，該蛋白內切酶不含蛋白外切酶。
具有上述特徵的優選的蛋白內切酶是枯草桿菌蛋白酶(EC3.4.24.4或如由DSM Food Specialities，Seclin，France提供的Pescalase或由NOVO，Bagsvaerd，Denmark提供的Alcalase)、嗜熱芽孢菌蛋白酶(EC3.4.24.4或由Daiwa Kasei，Osaka，Japan提供的Thermoase)、中性金屬蛋白酶(EC3.4.24.28或由DSM FoodSpecialities，Seclin，France提供的Brewers Protease 2000或由NOVO提供的Neutrase)或胰凝乳蛋白酶(EC3.4.21.1)。另一種優選的蛋白內切酶是脯氨酸特異性的蛋白內切酶。脯氨酸特異性的蛋白內切酶意味著在脯氨酸的氨基末端或者羧基末端側可以優先被切開。能夠在脯氨酸的氨基末端側切開的蛋白內切酶是已知的(Nature，Vol391，15 January 15，第301～304頁，1998)。可以優先在脯氨酸的羧基末端側切開的蛋白內切酶也是已知的(EC3.4.21.26)。後一種脯氨酸特異性蛋白內切酶優選地是從食品級過量產生的重組菌株，如麴黴屬(Aspergillus)獲得的。該種酶的適合的產生菌實例已經在共同未決專利歐洲申請號PCT/EP01/14480中敘述過。因為該脯氨酸特異性蛋白內切酶僅可以水解涉及脯氨酸殘基的肽鍵，所以該酶可以方便地與一種優選的蛋白內切酶組合，以水解組合的乳清蛋白與酪蛋白或者其分離的成分。使用脯氨酸特異性的蛋白內切酶的重要優點是，它能夠裂解在酪蛋白和乳清蛋白二者中的主要變應原表位。例如，酪蛋白是富含脯氨酸殘基的，因而常常可以被脯氨酸特異性蛋白內切酶切開。β-乳球蛋白的三個主要的變應原表位(片段41-60、102-124和149-162；Clinical and Experimental Allergy，1999，Vol 29，第1055-1063頁)全都含有中心脯氨酸殘基，以致用蛋白內切酶溫育，很可能減少被相關的人IgE的識別，藉此將最終產品變應原減至最少。根據本發明方法的優選實施方案是，將酪蛋白成分或者乳清成分和酪蛋白成分二者都經過至少包含脯氨酸特異性蛋白內切酶的水解反應來處理。
根據本發明方法的另一個優選實施方案是，乳清成分、酪蛋白成分或如全奶中存在的蛋白質成分的酶水解反應是通過僅僅使用蛋白內切酶來水解的，即不使用任何蛋白外切酶。
取決於脯氨酸特異性蛋白內切酶的最佳pH值，水解反應可以與其它蛋白內切酶共同進行或者分別進行。水解反應可以在恆定的pH值或不受控制的pH值的條件下進行。優選地，水解反應分兩步進行，首先，將蛋白質在中性或鹼性條件下與蛋白內切酶一起溫育，該蛋白質內切酶優先在成簇的疏水胺基酸殘基羧基末端側切開蛋白質。在該水解反應過程中，其pH值下降至酸性值(即pH值7以下)，僅在這時第二種蛋白內切酶被加入，優選為脯氨酸特異性的蛋白內切酶，更優選為從麴黴中獲得的脯氨酸特異性的蛋白內切酶。
達到所述需水解度所需要酶的數量是依據所使用的酶決定的。但是，其酶的劑量和溫育條件被最優化，以使大部分酪蛋白蛋白質成分在一般6～20小時的溫育周期之後在反應的液相中溶解。所謂大部分的意思是指，在pH值為4,2000g持續10分鐘的離心後，少於20％，優選的少於10％，更優選的少於5％的在酪蛋白成分中存在的蛋白質可以被沉澱出。
用蛋白內切酶溫育所造成的水解產物的額外的去除苦味可以說是有益的。優選地，通過用沒有內切蛋白水解活性的蛋白外切酶製劑同時或順序溫育，來進行額外的去除苦味。在與蛋白內切酶順序溫育時，用鹽酸調節pH值可能是必要的；通常不要求蛋白內切酶失活。去除苦味也可以用顯示優先去除氨基末端疏水胺基酸殘基的適合的氨肽酶在中性或弱酸性條件下進行，例如Accellerzyme(DSM FoodSpecialities；Delft，荷蘭)或Corrolase LAP(Rhm，Darmstadt，德國)或由Stoll等人(BBA 438(1976)212-220)敘述的從嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermofilus)分離的APII。另一方面，去除苦味可以在弱酸性條件用顯示去除羧基末端疏水胺基酸殘基的偏好的適合的羧肽酶來進行，例如由麴黴(Dal Degan等人，Appl.Environ Microbial，58(7)2144-2152)產生的CPDI(PepG)。可選地，兩種類型的蛋白外切酶的組合物可以在弱酸性條件下應用。對於蛋白內切酶以及蛋白外切酶，優選的溫育溫度為40℃或高於40℃，更優選為50～80℃。
不考慮水解的條件，優選地，將最終水解產物經過附加的酶失活步驟處理。酶失活步驟可以是包括加熱到至少85℃的溫度持續至少10分鐘的加熱處理。如果採用更高的溫度或更極端的pH值，較短的時間是可行的。上述加熱處理優選在酸性pH值進行，優選為3～7。為了從最終產品中去除任何不可溶的物質，優選可以以工業規模進行的傾析法或低速離心，例如在2000～4000g。可選地，可以對水解產物採用超濾器、微濾器、硅藻土、玻璃纖維過濾器或使用交叉流過濾進行過濾。可以通過染色凝膠測試確認完全的酶失活。可選地，可以對過濾過的最終水解產物使用活性炭或使用納米過濾、離子交換或電透析進行處理，以去除剩餘的鹽。可以將過濾過的水解產物進行巴氏消毒或滅菌，如果需要，採用乾燥技術進一步濃縮，例如蒸發作用、納米過濾、噴霧乾燥、流化床乾燥或者其組合。優選地，獲得的產品為顆粒形式。
酪蛋白和乳清蛋白的比例基本為牛奶中存在的比例是有利的。乳清蛋白優選為未水解的蛋白質。
僅僅使用蛋白內切酶，即不使用蛋白外切酶，來水解酪蛋白或乳清蛋白或這兩種成分的組合物是有利的。
最終蛋白質混合物優選地包含10～50％乳清蛋白和90～50％酪蛋白。蛋白質混合物更優選地包含20～40％乳清蛋白和80～60％酪蛋白。酪蛋白和乳清蛋白的百分比均在乾重的基礎上表示。
在本發明優選的實施方案中，用優選的蛋白內切酶將酪蛋白酸鹽水解，之後經使用脯氨酸特異性的蛋白內切酶溫育處理。這樣或優選地在離心之後，將酪蛋白水解產物進行濃縮並乾燥。可以將該乾燥的產品在未水解的乳清中再溶解，以獲得希望的蛋白質濃度和蛋白質比例，然後，如果需要，進行離心或過濾，和巴氏消毒或滅菌，從而得到根據本發明的產品。或者，將濃縮的酪蛋白水解產物與濃縮的未水解的乳清蛋白混合，以達到希望的蛋白質濃度和蛋白質比例，然後可選擇地進行離心或過濾，並且可選擇地進行巴氏消毒或滅菌，從而得到根據本發明的產品。
顯然，可以將產品經過附加的酶處理，例如乳糖酶，或者用不同類型的引子培養物發酵，或者與所有類型的組分混合，例如水果濃縮物、香精、著色劑、醇、二氧化碳、增稠劑、酸化劑、抗氧化劑、香草或香草提取物、增進健康的化合物，如維生素或維生素原或生物活性肽或碳水化合物或胺基酸，以配製成符合市場需要的產品。
在最終的應用中，pH值一般高於3，優選為高於3.5；總蛋白質濃度少於5％w/w，優選為少於3.5％w/w；當在480nm的波長檢測時，該溶液(包含40g/l蛋白質)的光學吸收度小於1.000，當針對在20,000g持續20分鐘離心之後獲得的溶液上清液，在10℃、pH值為4，使用1cm玻璃比色槽進行測量時，優選為小於0.50。
實施例1採用脯氨酸特異性的蛋白內切酶進行的酪蛋白的水解在每升含有60g酪蛋白酸鈉(Miprodan 30，由MD Foods，Viby，Denmark提供)的溶液/懸浮液中，用每kg酪蛋白酸鈉粉1g嗜熱芽孢菌蛋白酶的量在pH值6.7和75℃穩定pH值條件下溫育3小時，產生幾乎沒有沉澱的澄清的溶液。將pH值調節到5.0後，將酶在95℃持續45分鐘失活。將液體冷卻，品嘗到很苦的味道。將pH值調節到6.0，將3個單位由黑色麴黴(A.niger)產生的脯氨酸特異性的蛋白內切酶加入到25ml該酪蛋白酸鹽水解產物中。由黑色麴黴產生的脯氨酸特異性的蛋白內切酶的1個活性單位被定義為，在pH值5和37℃下從N-苄氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-對硝基醯苯胺(z-Gly-Pro-pNA)(Bachem，瑞士)中每分鐘釋放1μmol對硝基醯苯胺(pNA)所需要的酶的量。通過在410nm的光學吸收檢測pNA的釋放。在50℃溫育過夜後，再將pH值調節到5.0，並且進行另一個酶失活步驟(在90℃下30分鐘)。冷卻到室溫之後，酪蛋白酸鹽水解產物被完全溶解並且變澄清。
品嘗證明沒有任何苦味。
使用與P4000泵(Thermoquest，Breda，荷蘭)偶聯的離子捕獲質譜儀(Thermoquest，Breda，荷蘭)的HPLC被用來描述用酶溫育產生的酪蛋白肽的分子量分布。形成的肽用PEPMAP C18 300A(MIC-15-03-C18-PM，LC Packings，Amsterdam，荷蘭)柱分離，洗脫梯度為在Milli Q水中0.1％甲酸(Millipore，Bedford，MA，美國；溶液A)和在乙腈中0.1％甲酸(溶液B)。該梯度從100％的溶液A開始，在45分鐘溶液B提高到70％，並且保持後一比例達5分鐘。所用注射體積為50μl，流速為50μl/分鐘，柱溫保持在30℃。注射樣品的蛋白質濃度為大約50μg/ml。根據獲得的數據，絕大多數酪蛋白肽分子量在300～1200D。
實施例2通過混合徹底水解的酪蛋白酸鹽和未水解的甜乳清來獲得澄清無苦味的類乳飲料。
向濃度60g/L的200ml酪蛋白酸鈉溶液(Miprodan 30，由MDFoods，Viby，丹麥提供)中，加入300mg Thermoase(由Daiwa Kasei，Osaka，Japan生產的，具有14000PU/mg活性的從Bacillusthermoproteolyticus Rokko中得到的熱穩定金屬蛋白內切酶)。在pH值6.7和75℃溫育的過程中，立即有酪蛋白(caseinaceous)的絮狀凝結和沉澱發生。在恆定pH值的條件下，進一步溫育3小時，結果形成幾乎沒有沉澱的澄清的溶液。將溶液的pH值調節到5.0，通過在95℃持續加熱45分鐘將Thermoase失活。冷卻後，品嘗溶液並發現有很重的苦味。將pH值調節到6.0之後，將3個單位由黑色麴黴產生的脯氨酸特異性的蛋白內切酶(在pH值5和37℃下使用z-Gly-Pro-pNA測定)加入到25ml水解產物中。在50℃溫育20小時後，通過在90℃下加熱溶液30分鐘來進行另一個酶失活循環。冷卻到室溫並調節pH值到4.0之後，發現該酪蛋白酸鹽水解產物被完全溶解並且變澄清，即，在480納米下使用1cm玻璃比色槽通過分光光度測定，顯示出相對水為0.24的光學吸收度。經品嘗證明沒有任何苦味或不好的味道。
將該兩倍濃縮地酪蛋白溶液與相同量的新鮮的兩倍濃度的甜乳清混合，最終生產出澄清的無苦味的類乳飲料，其中所述乳清通過酸化到pH值4.0接著低速離心而已經不合混雜的酪蛋白蛋白質。
實施例3通過甜乳清的水解獲得的水解乳清蛋白的澄清無苦味的溶液。
通過溶液酸化到pH值4.0，使甜乳清不含酪蛋白(caseinaceous)蛋白質。離心後，傾倒出澄清的上清液。將乳清成分調節到pH 6.8。向200ml該溶液中，加入200mg Thermoase(由Daiwa Kasei，Osaka，Japan生產的，具有14000PU/mg活性的從Bacillusthermoproteolyticus Rokko中得到的熱穩定金屬蛋白內切酶)。在pH值6.7和75℃溫育的過程中，有蛋白質的輕微的絮狀凝結和沉澱發生。在恆定pH值的條件下，進一步溫育3小時，結果形成澄清的溶液，但還含有一些沉澱物。將溶液的pH值調節到5.0，通過在95℃加熱持續45分鐘將Thermoase失活。冷卻下來後，品嘗溶液並發現有輕微的苦味。將pH值調節到6.0後，將3個單位由黑色麴黴產生的脯氨酸特異性的蛋白內切酶(在pH值5和37℃下使用z-Gly-Pro-pNA測定)加入到25ml水解產物中。在50℃溫育20小時後，通過在90℃下加熱溶液30分鐘來進行另一個酶失活循環。冷卻到室溫並調節pH值到4.0之後，發現乳清蛋白水解產物被完全溶解並且變澄清，即在480納米下使用1cm玻璃比色槽通過分光光度測定，顯示出相對水為0.35的光學吸收度。經品嘗證明沒有任何苦味或不好的味道。
實施例4在不使用蛋白外切酶的情況下，通過脫脂奶的水解獲得澄清無苦味的基於乳類蛋白質的溶液向200ml市場上可獲得的脫脂奶中，加入300mg Thermoase(由Daiwa Kasei，Osaka，Japan生產的，具有14000PU/mg活性的從Bacillus thermoproteolyticus Rokko中得到的熱穩定金屬蛋白內切酶)。在pH值6.7和75℃溫育的過程中，立即有蛋白質絮狀凝結和沉澱發生。在恆定pH值的條件下，進一步溫育3小時，結果形成幾乎沒有沉澱的澄清的溶液。將溶液的pH值調節到5，通過在95℃持續加熱45分鐘將Thermoase失活。冷卻下來後，品嘗溶液並發現有很重的苦味。再次調節pH值到6.0後，將3個單位由黑色麴黴產生的脯氨酸特異性的蛋白內切酶(在pH值5和37℃下使用z-Gly-Pro-pNA測定)加入到25毫升水解產物中。在50℃溫育20小時後，通過在90℃下加熱溶液30分鐘來進行另一個酶失活循環。冷卻到室溫並調節pH值到4.0之後，發現酪蛋白酸鹽水解產物被完全溶解並且變澄清，即在480納米下使用1cm玻璃比色槽通過分光光度測定，顯示出相對水為小於0.900的光學吸收度。經品嘗證明沒有任何苦味或不好的味道。
實施例5通過水解的酪蛋白酸鈉與多種未水解的乳清製劑混合，來獲得含有類乳組成的、酸性穩定的、澄清無苦味的液體將6％(wt)酪蛋白酸鈉溶液(90％蛋白質，從荷蘭DMVInternational獲得)的pH值調節到8.0，之後每克酪蛋白加入40微升Delvolase(Delvolase，每克560 000DU，從法國的DSM FoodSpecialities，Seclin獲得)。然後將混合物在不受控制或者恆定在8的pH值下，在60℃並穩定地攪拌150分鐘或者210分鐘的條件下溫育。溫育之後，通過用乳酸降低pH值到5.0，接著通過90℃下10分鐘的熱休克使水解反應停止。之後，將溫度降至50℃，將由黑色麴黴產生的脯氨酸特異性蛋白內切酶(參閱WO 02/45523)加入。每克酪蛋白加入含有8單位/毫升(即2單位/克酪蛋白酸鹽，如實施例1所述的方法測定)的酶溶液250微升，溫育240或者480或者960分鐘。最後施加附加的95℃10分鐘的熱休克，之後用蒸餾水將全部樣品稀釋到酪蛋白酸鹽濃度為3％，冷卻下來到14℃，然後提供給在乳產品定量品定苦味方面受過訓練的專門的品定小組。品嘗之後，小組的全體成員一致同意，從多種Delvolase溫育和用脯氨酸特異性的蛋白內切酶隨後溫育480或960分鐘得到的全部樣品均無苦味。僅用Delvolase溫育後獲得的樣品被認為是極苦，用Delvolase和用脯氨酸特異性的蛋白內切酶溫育240分鐘獲得的樣品被評定為輕微的苦。
用Delvolase溫育後，採用Nielsen，P.M.等人敘述(Journal ofFood Science，Vol 66，No 5，第642-646頁，2001)的OPA方法測試的水解度為大約12％；用脯氨酸特異性蛋白內切酶溫育之後，其DH值提高到16～20％。
為製備基本上與牛奶具有相同組成的產品，將採用上述方案生產的多種兩倍濃縮的(即6克/升)無苦味的酪蛋白水解產物與相等體積的兩倍濃縮的(即1.3克/升)未水解的乳清蛋白混合。首先，使用商業或非商業產品製備不同的乳清蛋白溶液。在多種被測試的乳清產品中，BiPRO(Davisco Foods International)、PROXIME 660或HIPROTAL875或DOMOVICTUS 535(BDI，荷蘭)全都產生出相對澄清和柔和味道的產品。新鮮乾酪乳清產生出具有濃鬱乳品香味的微黃色混濁的產品。在用這些不同乳清產品和不同酪蛋白水解產物生產的組合物中，特別是有著非巴氏消毒(非商業的)型的PROXIM 660的組合物，因為其吸引人的味道並且沒有濁度或沒有不好氣味，證實為特別令人感興趣。
儘管這樣製備的類乳混合物是相當澄清的，以2000g進行10分鐘離心或者簡單沉降幾小時接著用傾析法產生了完全澄清的產品。離心過的產品一般導致當在480納米並在1cm的玻璃比色槽中測定時，光學吸收度相對於水低於0.90。最重要的是，後者的工藝步驟引起的蛋白質損失一般少於溶解部分的10％。這樣製備的澄清溶液即使在酸化到pH值低到4.0和2.8的情況下依然保持澄清。
實施例6簡化水解方案以把脫脂奶轉變成澄清、柔和味道並且是酸穩定的最終產品。
將含有蛋白質39克/升、糖類51克/升、脂肪0.5克/升並且最終pH值為6.5的商業上可得到的脫脂奶(Friesche Vlag，荷蘭)在水浴槽中在60℃下使之平衡，之後每克酪蛋白(所用的脫脂奶含有30克酪蛋白/升)加入40微升Delvolase(參閱實施例5)。將混合物在穩定地攪拌而不調節pH值的情況下溫育。溫育150分鐘後，用乳酸使pH值降到5.0，並將溶液分為兩部分。將一部分加熱至90℃10分鐘，以滅活枯草桿菌蛋白酶，而將另一部分保持在60℃下持續額外的10分鐘。然後，將兩部分都轉移到50℃的水浴槽，使之平衡後將脯氨酸特異性的蛋白內切酶加入到兩個小瓶，已達到每克存在的酪蛋白250微升酶(即2單位；參閱實施例5)的濃度。在50℃下960分鐘的額外的溫育之後，兩部分都經過95℃下10分鐘的熱休克。然後使用如實施例5概述的方案對DH值進行測定。經Delvolase溫育後，DH值為20％。用脯氨酸特異性的蛋白內切酶溫育後，經熱休克以滅活Delvolase的樣品有著26％的DH值，而另一個樣品顯示出30％的DH值。由在實施例5中提到的相同的品定小組在14℃再次進行兩種最終溶液的品定。根據品定小組的結論，兩種溶液都同樣沒有苦味。
此外，兩種製劑的低速離心，產出澄清溶液，其進一步酸化到pH值為4仍保持澄清。在Superdex Peptide HR 1030柱上用層析法進行肽尺寸分析。獲得的數據表明，在用Delvolase滅活製備的材料中，含有小於1500道爾頓的肽的成分相當於溶液中存在蛋白質的94wt％，而含有小於5000道爾頓的肽的成分相當於溶液中存在蛋白質的99wt％。在不進行Delvolase滅活而製備的材料中，含有小於1500道爾頓的肽的成分相當於87wt％，而含有小於5000道爾頓的肽的成分也相當於全部存在蛋白質的99wt％。
總之，在本實施例中顯示的結果證明，採用簡化的水解方案可以有效地將脫脂奶以及酪蛋白水解，使之成為無苦味、澄清的水解產物。同常規的脫脂奶比較起來，存在的很大比例的小肽提示了所得脫脂奶水解產物的極大地減少的變態反應原。
權利要求
1.一種包含以9∶1～1∶1乾重比例存在的水解的酪蛋白蛋白質和乳清蛋白的組合物，當在10℃以40g/l在水中溶解或存在時它在pH值4下是澄清的液體。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中乳清蛋白成分是未水解的。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其與水解前的蛋白質組合物相比具有減少的變態反應原性。
4.根據權利要求1至3中任意一項所述的組合物，其中具有低於5000道爾頓分子量的水解蛋白質的肽成分多於在水解蛋白質中存在的蛋白質的90％wt，優選的多於95％wt。
5.根據權利要求1至4中任意一項所述的組合物，其中具有低於1500道爾頓分子量的水解蛋白質的肽成分多於在水解蛋白質中存在的蛋白質的80％wt，優選的多於85％wt。
6.根據權利要求1至5中任意一項所述的組合物，其中將脫脂奶作為蛋白質來源應用。
7.根據權利要求1至6中任意一項所述的組合物，其中每1000g組合物含有總蛋白質乾重10～150。
8.根據權利要求1至6中任意一項所述的組合物，它含水少於10％w/w，優選的含水少於5％w/w。
9.包含根據前述的權利要求中任意一項所述的組合物的食品，優選為飲料。
10.根據權利要求9所述的飲料，它是運動飲料或軟飲料或健康飲料。
11.一種包含水解的酪蛋白蛋白質和乳清蛋白的組合物的生產方法，它包括水解至少酪蛋白蛋白質以形成一種組合物，其中酪蛋白和乳清蛋白成分以9∶1～1∶1乾重比例存在，並且當在10℃以40g/l在水中溶解或存在時，該組合物在pH值4下是澄清的液體。
12.根據權利要求11所述的方法，其中乳清成分和酪蛋白成分是被水解的。
13.根據權利要求11或12所述的方法，其中對酪蛋白和/或乳清成分採用蛋白內切酶，優選地採用脯氨酸特異性的蛋白內切酶水解。
14.根據權利要求11至13中任意一項所述的方法，進一步包括採用脯氨酸特異性的蛋白內切酶的水解，其中脯氨酸特異性的蛋白內切酶水解在用另外的蛋白內切酶處理之前、之後或同時進行。
14.根權利要求11至14中任意一項所述的方法，其中在蛋白內切酶水解的同時或之後，將蛋白外切酶加入。
15.根據權利要求1至8中任意一項所述的組合物在食物或飼料中的應用。
16.根據權利要求14所述的在食物或飼料中的應用，以在食物或飼料中獲得與未水解的蛋白質相比減少了的變態反應原性或提高的蛋白質生物活性。
全文摘要
本發明提供了一種組合物，它包含以9∶1～1∶1(乾重)比例存在的水解的乳酪蛋白和優選地未水解的乳清蛋白，當在10℃以40g/l在水中溶解或存在時，它在pH值4的情況下是澄清的液體。
文檔編號A23L1/30GK1527669SQ02814152
公開日2004年9月8日 申請日期2002年7月18日 優先權日2001年7月18日
發明者L·艾丹斯, A·L·德魯斯, L 艾丹斯, 德魯斯 申請人:Dsmip資產有限公司