Adamts5基因第一號外顯子多態性的製作方法
2023-06-08 00:03:01
專利名稱：Adamts5基因第一號外顯子多態性的製作方法
技術領域：
本發明涉及ADAMTS5基因第一號外顯子的單核苷酸多態性。本發明還涉及分析ADAMTS5基因第一號外顯子的等位基因突變的方法。
背景技術：
ADAMTS蛋白家族是一類金屬蛋白酶，都能在蛋白質水解過程中起作用。其主要成員有ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7等等。(J Biol Chem 1999 Sep 3；274(36)25555-63)。
在本申請之前，還沒有ADAMTS5基因第一號外顯子多態性的相關報導。
發明內容
本發明的目的就是提供ADAMTS5基因第一號外顯子的多態性及其檢測方法。
在本發明的第一方面，提供了一種檢測人ADAMTS5基因第一號外顯子的單核苷酸多態性的方法，它包括步驟(a)確定在人ADAMTS5基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第341位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。
在一優選例中，所述的單核苷酸多態性是在第341位存在C。
在本發明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第341位為C。
在本發明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為15-50bp，且特異性地雜交並擴增出含人ADAMTS5基因第一號外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第341位單核苷酸多態性的擴增產物。
在本發明的第四方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長度為15-50bp，且特異性地雜交並檢測含人ADAMTS5基因第一號外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第341位單核苷酸多態性。
一種試劑盒包括(1)特異性擴增人ADAMTS5基因第一號外顯子的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的ADAMTS5基因第一號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第341位單核苷酸多態性。
另一種診斷試劑盒包括本發明上述的引物和/或本發明上述的寡核苷酸探針。
具體實施例方式
本發明人通過廣泛而深入的研究，已經發現了ADAMTS5基因第一號外顯子所編碼的蛋白序列中第44位Ser(S)-Arg(R)多態(即mRNA上341位A-C多態性)，在此基礎上完成了本發明。
根據對正常人ADAMTS5基因測序結果，發現了該SNP。經分析發現，該SNP導致第44位胺基酸由Ser(S)-Arg(R)。由於這是不同性質胺基酸的置換，因此，會導致ADAMTS5基因第一號外顯子所編碼的蛋白活性發生改變。
ADAMTS5基因第一號外顯子的cDNA序列列於SEQ ID NO1，其中開放閱讀框為第212-520位，其所編碼的胺基酸序列列於SEQ ID NO2。ADAMTS5基因第一號外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本領域的技術人員知道，有大量的分析技術可用於檢測ADAMTS5基因第一號外顯子中所述位點是否存在單核苷酸多態性。這些技術包括(但並不限於)DNA測序、雜交測序；酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點雜交、寡核苷酸陣列(DNA晶片)、Mini-sequencing、Taqman技術、分子信標等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
另一方面，本發明的檢測方法被用於評估個體患ADAMTS5基因第一號外顯子相關疾病的易感性。
用於本發明的測試樣品沒有特別限制，對於檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對於檢測ADAMTS5基因第一號外顯子活性而言，可以任何含有ADAMTS5基因第一號外顯子的樣品，如血液等。
用於本發明方法或檢測試劑盒的引物和探針，根據ADAMTS5基因第一號外顯子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因組序列進行設計，並可用常規的合成技術進行合成即可。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1基因的抽提和測序用常規酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul後，用於常規PCR擴增。引物是有義引物5』-cattttccca agcaacaaag a-3』(SEQ ID NO3)反義引物5』-ctccaggtcc aagaggaacc-3』(SEQ ID NO4)擴增出的520bp的產物，純化後進行DNA測序。
實施例2SNP的獲得對ADAMTS5基因進行直接測序。將測定的各樣本序列進行比較，從而得出序列的差異，獲得SNP。
實施例3檢測試劑盒製備一檢測ADAMTS5基因相關疾病易感性的檢測試劑盒，其中，含有下列可擴增出341位SNP的引物對有義引物5』-cattttccca agcaacaaag a-3』(SEQ ID NO3)反義引物5』-ctccaggtcc aagaggaacc-3』(SEQ ID NO4)對擴增產物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，可輕易地檢測出341位的A-C型SNP。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
SEQUENCE LISTING110上海人類基因組研究中心120ADAMTS5基因第一號外顯子多態性1300301151604170PatentIn version 3.12101211520212DNA213Homo sapiens220
221CDS222(212)..(520)223
4001cattttccca agcaacaaag aaaagttcgc acgctggcac cgcagcccgg acaggctggc 60gctgctgccg ggcccccctc cctccgacac ttgactcaat cctgcaagca agtgtgtgtg 120tgtccccatc ccccgccccg ttaacttcat agcaaataac aaatacccat aaagtcccag 180tcgcgcagcc cctccccgcg ggcagcgcac t atg ctg ctc ggg tgg gcg tcc232Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser1 5ctg ctg ctg tgc gcg ttc cgc ctg ccc ctg gcc gcg gtc ggc ccc gcc 280Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro Leu Ala Ala Val Gly Pro Ala10 15 20gcg aca cct gcc cag gat aaa gcc ggg cag cct ccg act gct gca gca 328Ala Thr Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly Gln Pro Pro Thr Ala Ala Ala25 30 35gcc gcc cag ccc agc cgg cgg cag ggg gag gag gtg cag gag cga gcc 376Ala Ala Gln Pro Ser Arg Arg Gln Gly Glu Glu Val Gln Glu Arg Ala40 45 50 55gag cct ccc ggc cac ccg cac ccc ctg gcg cag cgg cgc agg agc aag 424Glu Pro Pro Gly His Pro His Pro Leu Ala Gln Arg Arg Arg Ser Lys60 65 70ggg ctg gtg cag aac arc gac caa ctc tac tcc ggc ggc ggc aag gtg 472
Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val75 80 85ggc tac ctc gtc tac gcg ggc ggc cgg agg ttc ctc ttg gac ctg gag 520Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly Arg Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu90 95 1002102211103212PRT213Homo sapiens4002Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro1 5 10 15Leu Ala Ala Val Gly Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly20 25 30Gln Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Ser Arg Arg Gln Gly35 40 45Glu Glu Val Gln Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly His Pro His Pro Leu50 55 60Ala Gln Arg Arg Arg Ser Lys Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln Leu65 70 75 80Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly Arg85 90 95Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu100210321121212DNA213人工序列220
221misc_feature
223引物4003cattttccca agcaacaaag a 21210421120212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4004ctccaggtcc aagaggaacc 20
權利要求
1.一種檢測人ADAMTS5基因第一號外顯子的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，它包括步驟(a)確定在人ADAMTS5基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第341位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的單核苷酸多態性是在第341位存在C。
3.一種分離核酸，其特徵在於，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第341位為C。
4.一種等位基因特異性的核酸引物，其特徵在於，其長度為15-50bp，且特異性地雜交並擴增出含人ADAMTS5基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第341位單核苷酸多態性的擴增產物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特徵在於，其長度為15-50bp，且特異性地雜交並檢測含人ADAMTS5基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第341位單核苷酸多態性。
6.一種診斷試劑盒，其特徵在於，它包括(1)特異性擴增人ADAMTS5基因第一號外顯子的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的ADAMTS5基因第一號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第341位單核苷酸多態性。
7.一種診斷試劑盒，其特徵在於，它包括權利要求4所述的引物和/或權利要求5所述的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發明涉及ADAMTS5基因第一號外顯子的單核苷酸多態性(SNP)。本發明提供了分析ADAMTS5基因第一號外顯子的SNP或其活性的方法。本發明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人ADAMTS5基因第一號外顯子的第341位的A－＞C多態性。該SNP導致編碼蛋白第44位發生Ser(S)－＞Arg(R)改變，從而改變了蛋白活性。
文檔編號C12N15/11GK1519349SQ0311504
公開日2004年8月11日 申請日期2003年1月22日 優先權日2003年1月22日
發明者黃薇, 施錦繡, 奚慧峰, 金力, 薇 黃 申請人:上海人類基因組研究中心