鴨圓環病毒和鴨肝炎病毒二重pcr檢測試劑盒的製作方法
2023-06-07 18:15:56 1
專利名稱：鴨圓環病毒和鴨肝炎病毒二重pcr檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種鴨圓環病毒和鴨肝炎病毒二重PCR檢測試劑盒。
背景技術：
鴨圓環病毒(DuckCircovirus, DuCV)和鴨肝炎病毒(DHV)均常見於鴨，鴨圓環病毒(DuCV)可造成鴨生長遲緩、羽毛凌亂、體重減輕等症狀，可感染禽類的免疫系統，引起免疫抑制。鴨肝炎病毒(DHV)引起的鴨病毒性肝炎是一種可使病鴨高度致死的迅速傳播的病毒性疾病，病程短且死亡快，死亡率可高達100%。這兩種疾病流行廣泛，傳播迅速，發病率和死亡率高，易混合感染，目前對世界範圍水禽危害較為嚴重，給養鴨業帶來巨大的經濟損失。鴨圓環病毒破壞病鴨的免疫系統，造成免疫抑制，鴨肝炎病毒流行廣泛且高度致死，病鴨極易同時感染這兩種病毒，一旦同時發生感染則會造成極大的損失。目前對DuCV和DHV 的鑑別診斷主要依靠傳統的病原分離鑑定與血清學試驗，但這些方法存在診斷時間長，特異性差，敏感性低，而且操作繁瑣等的缺點，不利於快速診斷這兩種疾病。PCR技術由於具有敏感性高、特異性好、快速、簡便等特點，已經走進臨床診斷實驗室並廣泛應用於各種禽病病原體的檢測，包括用於DuCV和DHV的檢測。二重PCR是一種特殊的PCR形式，其突出特點是，一次PCR反應，能同時檢測並鑑別出兩種病原體，在臨床上具有很高的應用價值。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒的引物組。本發明提供的引物組，由引物I、引物2、引物3和引物4組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物組中，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為 2 2 (I. 5-2) (I. 5-2)；上述引物組中，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比具體為 2:2:1.8 1.8。本發明的另一個目的是提供一種檢測鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒的PCR試劑。本發明提供的PCR試劑，由上述的引物組、PCR緩衝液和水組成；所述引物組中的引物I在所述PCR試劑中的終濃度具體為2 μ mol/L ；所述引物組中的引物2在所述PCR試劑中的終濃度具體為2 μ mol/L ；所述引物組中的引物3在所述PCR試劑中的終濃度具體為I. 5-2 μ mol/L ；所述引物組中的引物4在所述PCR試劑中的終濃度具體為I. 5-2 μ mol/L ；所述引物組中的引物3在所述PCR試劑中的終濃度進一步具體為I. 8 μ mol/L ；所述引物組中的引物4在所述PCR試劑中的終濃度進一步具體為I. 8 μ mol/L。
本發明的第三個目的是提供一種檢測鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒的PCR試劑盒。本發明提供的PCR試劑盒，包括上述的引物組或上述PCR試劑。上述的引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在製備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒產品中的應用也是本發明保護的範圍。上述檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒為用上述的引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒對所述待測樣品進行二重PCR擴增。上述應用中，所述二重PCR擴增的退火溫度為50°C -55°C，所述二重PCR擴增的退火溫度具體為55で。本發明的第四個目的是提供一種檢測鴨圓環病毒的引物對A。本發明提供的引物對A，由上述的引物組中的所述引物I和所述引物2組成；本發明的第五個目的是提供ー種檢測鴨肝炎病毒的引物對B。本發明提供的引物對B，由上述的引物組中的所述引物3和所述引物4組成。上述的引物對A在製備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨圓環病毒產品中的應用也是本發明保護的範圍；上述的引物對B在製備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨肝炎病毒產品中的應用也是本發明保護的範圍。本發明的實驗證明，本發明建立一次PCR反應就能同時檢測和鑑別DuCV、DHV兩種病原體的二重PCR技木，具有良好特異性，而且本試驗在引物設計上利用擴增片段長度的不同直接判定擴增結果，使得該方法在結果判定時更簡便、直觀和實用。利用二重PCR—次可以擴增多個目的基因特點，一次PCR反應就可以檢測多種病原體，這在臨床應用中，對檢測不同病原體感染，具有十分重要實用價值和實踐意義。
圖I為二重PCR的特異性試驗圖2為二重PCR的敏感性試驗圖3為二重PCR檢測待測樣本圖4為鴨肝炎病毒其他PCR驗證圖5為鴨圓環病毒其他PCR驗證
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所用的病毒、試劑具體如下實驗菌株鴨圓環病毒(DuCV)記載在「廣西部分地區鴨圓環病毒感染情況調查」，中國畜牧獸醫，2010，37 (11) :156-158，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；鴨肝炎病毒為鴨I型肝炎病毒(DHV DAV2111株購自中國獸醫藥品監察所；對照菌(毒)株番鴨細小病毒(MDPV)記載在「廣西番鴨細小病毒的分離和鑑定」，廣西畜牧獸醫，2002，18 (6) :5-7，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；小鵝瘟病毒記載在「小鵝瘟病毒螢光定量PCR檢測方法的建立」，上海畜牧獸醫通訊，2008，160 (06) :30-31，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；新城疫病毒記載在「新城疫植物油乳劑苗的研究」，中國預防獸醫學報，2000，
(04):23-27，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；H9亞型禽流感病毒記載在「多重反轉錄聚合酶鏈反應快速檢測鑑別H9亞型禽流感病毒方法的建立」，中國人獸共患病學報，2006，(09) :858-860，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；試劑TIANamp Genomic DNA Kit 購自天根公司，AMV 反轉錄酶、Ribonuclease Inhibitor、dNTP購自TaKaRa公司。SPF雞胚購自北京梅裡亞公司。TRIzol LS Reagent購自Invitrogen公司。DU 800紫外分光光度計購自BECKMAN COULTER公司。實施例I、引物的設計和合成根據已發表鴨圓環病毒DuCV、鴨肝炎病毒DHV的基因文庫，應用DNA Star軟體， 設計針對DuCV和DHV基因序列的2對特異性引物，引物核酸序列見表I。引物由上海 Invitrogen公司合成。表I為DuCV和DHV弓丨物的核苷酸序列
權利要求
1.檢測鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒的引物組，由引物I、引物2、引物3和引物4組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根據權利要求I所述的引物組，其特徵在於所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為 2 2 (I. 5-2) (I. 5-2)；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比具體為2 2 1.8 1.8。
3.檢測鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒的PCR試劑，由權利要求I或2所述的引物組、PCR緩衝液和水組成；所述引物組中的引物I在所述PCR試劑中的終濃度具體為2iimol/L ；所述引物組中的引物2在所述PCR試劑中的終濃度具體為2iimol/L ；所述引物組中的引物3在所述PCR試劑中的終濃度具體為I. 5-2umol/L ；所述引物組中的引物4在所述PCR試劑中的終濃度具體為I. 5-2 u mol/L ；所述引物組中的引物3在所述PCR試劑中的終濃度進ー步具體為I. 8 ii mol/L ；所述引物組中的引物4在所述PCR試劑中的終濃度進ー步具體為I. 8 ii mol/L。
4.檢測鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒的PCR試劑盒，包括權利要求I或2所述的引物組或權利要求3所述PCR試劑。
5.權利要求I或2所述的引物組或權利要求3所述PCR試劑或權利要求4所述試劑盒在製備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒產品中的應用。
6.根據權利要求5所述應用，其特徵在於所述檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒為用權利要求I或2所述的引物組或權利要求3所述PCR試劑或權利要求4所述試劑盒對所述待測樣品進行二重PCR擴增。
7.根據權利要求5或6所述應用，其特徵在於所述二重PCR擴增的退火溫度為50°C _55°C，所述二重PCR擴增的退火溫度具體為 55。。。
8.—種檢測鴨圓環病毒的引物對A，由權利要求I或2所述的引物組中的所述引物I 和所述引物2組成；或ー種檢測鴨肝炎病毒的引物對B，由權利要求I或2所述的引物組中的所述引物3和所述引物4組成。
9.權利要求8所述的引物對A在製備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨圓環病毒產品中的應用；或權利要求8所述的引物對B在製備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨肝炎病毒產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種鴨圓環病毒和鴨肝炎病毒二重PCR檢測試劑盒。本發明提供了一種檢測鴨圓環病毒與鴨肝炎病毒的引物組，由引物1、引物2、引物3和引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本發明的實驗證明，本發明建立一次PCR反應就能同時檢測和鑑別DuCV、DHV兩種病原體的二重PCR技術，具有良好特異性，而且本試驗在引物設計上利用擴增片段長度的不同直接判定擴增結果，使得該方法在結果判定時更簡便、直觀和實用。
文檔編號C12Q1/68GK102605104SQ201210071889
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者劉加波, 龐耀珊, 範晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勳, 趙光遠, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所