丹參est-ssr分子標記的製備方法、特異引物及其應用的製作方法

2023-06-07 19:19:46

專利名稱：：丹參est-ssr分子標記的製備方法、特異引物及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及中藥材的生物技術、分子遺傳學研究
技術領域：
，尤其是丹參EST-SSR分子標記的製備方法、特異引物及其應用。
背景技術：
：丹參是著名的活血化瘀藥，《中華人民共和國藥典》收載的唇形科鼠尾草屬植物5Wf/s肌7〃orr力/^3是其唯一的基源植物，以乾燥的根及根莖入藥，具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩的功效，用於治療心絞痛、冠心病等症，是我國傳統醫藥學中應用最早而且最廣泛的藥物之一。近年來，對丹參的化學成分、藥理作用等研究日趨深入，但對其群體遺傳多樣性、種質分類鑑定、個體基因組構成等方面的相關研究報導相對較少。特別是在丹參研究中能夠應用的分子標記技術十分有限，僅有少數應用RAPD(郭寶林，林生，馮毓秀，趙楊景.2002.丹參主要居群的遺傳關係及藥材道地性的初步研究.中草藥，33(12):1113-1116.)、ITS(汪紅，王強.2005.丹參及鼠尾草屬植物的rDNAITS序列分析.中草藥，36(9):1381-1385.)、AFLP(王冰，張勇，陳成彬，李秀蘭，陳瑞陽，陳力.2007.中國不同地理居群丹參遺傳多樣性分析.中國中藥雜誌，32(19):1988-1991.)及ISSR(徐紅,王燕燕，魏丹紅，王崢濤.2007.不同產地丹參藥材的ISSR分析與鑑別.中藥新藥與臨床藥理，18(6):454-457.)通用引物進行多樣性研究的報導，尚未開發出能夠應用於丹參種質鑑定、遺傳圖譜構建、功能基因定位等研究的簡便、高效、穩定且具有種屬特異性的分子標記體系。簡單重複序列(simplesequencerepeat,SSR),是指DM分子中1-6個核普酸的串聯重複，廣泛分布於真核生物基因組的編碼區和非編碼區(MorganteM，HanafeyM,PowellW.2002.Microsatel1itesarepreferentiallyassociatedwithnonrepetitiveDNAinplantgenomes.NatureGenetics,30(2):194-200)。由於SSR具有隨機分布、多態性豐富、共顯性遺傳、重現性好、特異性強等特點，被廣泛用於遺傳作圖、功能基因定位、遺傳多樣性研究及DNA指紋圖譜構建等諸多方面，具有公認的優越性和應用前景。但傳統SSR標記的開發通常需經過文庫構建，包括SSR克隆的篩選、測序、引物設計和PCR擴增與分析等步驟，要投入大量的人力物力，開發成本很高。從表達序列標籤(expressedsequencetag,EST)中開發的SSR標記(EST-SSR)是近年發展起來的新型分子標記，與基因組SSR相比，它反映了基因組的編碼區域，可以直接獲得基因表達的信息，為功能基因提供"絕對"的標記，這有可能對決定重要表型性狀的等位基因進行直接鑑定；省去了SSR引物開發過程中的克隆和測序步驟，充分利用了現有測序數據，降低了開發成本；在不同物種間通用性好，具有4交高的轉移性(KantetyRV,LaRotaM,MatthewsDE,SorrellsME.2002.Dataminingforsimplesequencerepeatsinexpressedsequencetagsfrombarley,maize,rice,sorghumandwheat.PlantMolecularBiology,48(5-6):501-510.)。自2000年起,已相繼在水稻、小麥、馬鈴薯、柑橘、甜瓜、萵苣、鷹嘴豆等多種植物中開展了EST-SSR標記開發，並廣泛用於遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、功能基因定位、比較作圖等研究中。截止2009年1月16曰，在GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/)中釋放有鼠尾草屬植物EST共11748條，其中包括10288條丹參EST,但目前還沒有利用這些EST開發SSR標記的報導。
發明內容本發明的主要目的是提供一種丹參EST-SSR分子標記的製備方法，對GenBank中登錄的丹參EST序列進行整理，挖掘SSR位點信息，依據SSR位點側翼序列進行PCR引物設計，構建丹參種屬特異性EST-SSR標記體系，為丹參遺傳多樣性分析及種質鑑定等研究奠定基礎。本發明的另一個目的是提供一系列上述丹參EST-SSR分子標記製備方法中設計的特異引物。本發明的又一個目的是提供上述？1物的應用。為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下丹參EST-SSR分子標記的製備方法，包括下述主要步驟(1)丹參EST序列的獲得及預處理乂人GenBank(http//:www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)中下載丹參EST序歹l);採用VecScreen及RepeatMasker或其它類似軟體去除載體汙染和重複序列，以EST-trimmer或其它類^U欠4牛除去5'端或3'端的polyT或polyA,以Phrap或CAP3或ClastalX等類似軟體進行EST重疊群分析和聚類、去除冗餘EST序列，並去除長度小於lOObp(bp是指基因(鹼基對)序列長，lbp-l鹼基對)的EST序列,拼接後得到非冗餘Uni-EST序列。由於登錄於GenBank的丹參EST序列在進行cDNA文庫構建、序列測定、結果分析及序列登錄等環節均會存在一定的偏差，最終公布的EST序列信息存在測序載體汙染、polyA或polyT富集、序列冗餘等問題。對登錄的EST序列進行包括去除載體汙染和重複序列、去除末端polyT或polyA、去除冗餘EST序列及序列長度過短的EST序列等在內的預處理，是進行SSR位點正確檢索的首要程序，也是SSR位點檢索分析嚴謹性的必要保證，更是最終能否開發有效EST-SSR標記的關鍵之一。因此，本發明中預先對GenBank中登錄的丹參EST序列進行嚴格標準的預處理，最終獲得的非冗餘Uni-EST序列，可保證EST-SSR標記開發後續工作的有效進行。(2)丹參EST序列中SSR位點的篩選釆用SSR位點檢索專用軟體(如可任意選用SSRIT、SSRhunter、SSRPrimer、MISA等)，在上述步驟(1)得到的非冗餘Uni-EST序列中檢索SSR位點，檢索的限制條件包括不同重複基元的SSR其總重複序列長度》20bp;二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸至少重複次數分別為10次、7次、5次、4次、4次；中間被《5bp的間隔鹼基打斷的不完全重複SSR計為一個SSR位點；才企索得到一系列EST-SSR位點。本步驟中①由於掃描得到的單核苦酸重複基本為A/T重複，且主要位於EST序列末端，存在為EST序列殘存polyA或polyT的可能性，其可靠性有待進一步確認，因此，本發明未對單核苷酸重複SSR位點進行分析；②同樣，對"不同重複基元的SSR其總重複序列長度》20bp"的限定，也是為了通過嚴格限定SSR位點檢索條件，以增加檢索結果的可靠性及對引物開發的有效性。(3)丹參EST-SSR引物的設計與合成依據上述步驟(2)得到的EST-SSR側翼區域序列，應用軟體(如Primer3.0或PrimerPremier5.0等軟體)進行引物設計，引物設計主要參數包括GC含量40y。-60。/a,Tm(退火溫度)值45°C-65°C，引物長度18bp-23bp，預期擴增產物長度120bp-350bp;得到的引物序列經Blastn比對，根據結果重點對3'端鹼基及正反向引物間隔進行調整，使引物3'端鹼基與擴增位點相一致，得到一系列EST-SSR位點特異引物。51物設計完成後進行合成。在目前現有技術的研究中，在篩選到SSR位點後，依據其側翼序列進行引物設計的工作主要由計算機軟體實現，其優點是高效、快捷。但由於PCR引物對於3'端的嚴格要求、生物基因組序列多態性的存在以及丹參居群間高水平遺傳多樣性的表現，如果僅依據GenBank登錄的單一基因型的丹參EST序列進行引物設計，將會導致EST-SSR標記在丹參不同居群間的應用以及在鼠尾草屬近緣物種間的通用性分析中的擴增效率明顯降低。因此，本發明在以專業引物設計軟體進行EST-SSR引物初次篩選的基礎上，利用EST序列的保守性，進行Blastn比對分析，依據比對結果，重點對初篩的EST-SSR引物3'端鹼基及正反向引物間隔進行調整，使引物3'端鹼基與擴增位點相一致，以保證丹參EST-SSR標記的擴增有效性及通用性。(4)丹參EST-SSR引物的篩選採用上述步驟(3)合成的引物，以丹參或者其它鼠尾草屬近緣物種樣品的基因組DNA進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，根據擴增結果，篩選得到可有效擴增的丹參EST-SSR引物。對各種樣品的基因組DNA進行PCR擴增時，可採用下述擴增體系25jaL擴增體系中含有:lxPCRbuffer、MgCl21.5隱ol/L、dNTPs200jamol/L、正反向引物各O.5jumol/L、基因組模板DNA50ng以及TaqDNA聚合酶0.5U。以熱循環儀進行擴增，PCR擴增程序可為①94。C預變性3min;②94。C變性30s、65。C退火30s，每循環降rC,72。C延伸60s,IO個循環；③94。C變性30s、55。C退火30s、72。C延伸60s、23個循環；④72。C延伸7min。PCR擴增反應完成後，向產物中加入6xloadingbuffer5jaL混勻，於8%非變性連續PAGE(Acr:Bis=39:1)、150V恆壓電泳2h左右，採用4艮染方法顯帶，記錄結果。依據擴增結果，分析丹參EST-SSR引物有效性及通用性，篩選出可有效擴增的丹參SET-SSR引物。通過上述丹參EST-SSR分子標記的製備方法，依據EST-SSR側翼區域序列設計、並經過PCR擴增檢測篩選得到的一系列EST-SSR位點擴增特異引物，見圖1中的83對正反向引物。上述一系列EST-SSR位點擴增特異引物的應用可用於丹參及鼠尾草屬近緣物種的遺傳多樣性評價、親緣關係或種質鑑定、遺傳連鎖作圖、分子標記輔助選擇、基因定位克隆、功能基因組分析以及相關研究等。與現有技術相比，本發明的有益效果是根據本發明提供的丹參EST-SSR分子標記的製備方法，針對丹參EST進行SSR位點挖掘，對這些EST-SSR在丹參轉錄組中的分布特徵進行全面分析，可依據SSR位點側翼序列進行PCR引物設計，並在此基礎上構建丹參種屬特異性EST-SSR標記體系；為丹參及鼠尾草屬近緣物種的遺傳多樣性評價、親緣關係或種質鑑定、遺傳連鎖作圖、分子標記輔助選擇、基因定位克隆、功能基因組分析以及相關研究奠定基礎。圖1:依據丹參EST中SSR位點側翼序列設計並經PCR擴增篩選的EST-SSR引物序列及相應的重複基序；圖2:實施例1、2中涉及的用於EST-SSR標記檢測的丹參及鼠尾草屬近緣物種材料信息；圖3:丹參EST-SSR標記Sm-ES019在供試材料中的擴增結果(1-23:供試材料編號，詳見圖2;M:DNA分子量標準)；圖4:丹參EST-SSR標記Sm-ES051在供試材料中的擴增結果(l-23:供試材料編號，詳見圖2;M:DNA分子量標準)；圖5:依據EST-SSR檢測結果得到的供試材料聚類結果；圖6:依據EST-SSR檢測結果得到的供試材料主成分分析結果。具體實施例方式下面結合具體實施方式對本發明作進一步的詳細描述。應當指出的是，以下例舉的實施例旨在進一步闡述本發明相關內容，但並不對本發明的保護範圍構成任何限制，即不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於下述實施例。實施例1本實施例為丹參EST-SSR分子標記的製備方法(及擴增效率分析)，其製備方法包括下述主要步驟(1)丹參EST序列的獲得及預處理2008年12月，從GenBank(http〃www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)中以FASTA才各式下載共計10288條丹參EST序列。採用VecScreen及RepeatMasker去除載體汙染和重複序列，以EST-trimmer除去5'端或3'端的polyT或polyA,以Phrap進行EST重疊群分析和聚類去除冗餘EST序列，並去除長度小於1OObp的EST序列。對GenBank中登錄的丹參EST序列進行整理後，拼接後共獲得總長約2026kb的4192條非冗餘Uni-EST序列，其中contigs1276條、singletons2916條。(2)丹參EST序列中SSR位點的篩選採用SSRIT軟體，在上述步驟(l)得到的4192條非冗餘Uni-EST序列中檢索SSR位點，檢索的限制條件包括不同重複基元的SSR其總重複序列長度>20bp;二核苦酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苦酸、六核香酸至少重複次數分別為10次、7次、5次、4次、4次；包括中間被<5bp的間隔鹼基打斷的不完全重複SSR計為一個SSR位點；檢索得到一系列EST-SSR位點。(3)丹參EST-SSR引物設計與合成依據上述步驟(2)得到的EST-SSR側翼區域序列，應用Primer3.0軟體進行引物設計，引物設計主要參數包括GC含量40°/。-60°/。，Tm值45°C-65°C,引物長度18bp-23bp,預期擴增產物長度120bp-350bp。設計的引物序列經Blastn比對，根據結果重點對3'端鹼基及正反向引物間隔進行調整，使引物3'端鹼基與擴增位點相一致，得到一系列EST-SSR位點特異引物。引物設計完成後，由Invitrogen公司(Invitrogen,America)進行合成。(4)丹參EST-SSR引物的篩選選取13份丹參材料，包括7份野生居群和6份栽培居群，同時選取10份鼠尾草屬近緣物種用於檢測丹參EST-SSR標記的通用性，具體信息詳見圖2。每個樣本隨機選取3個單林，採幼葉等量混合，取0.2-0.5g新鮮幼葉於液氮中研成粉末；將粉末轉至1.5mL離心管中，力。500jaL預熱提取緩沖液(2%CTAB、lOOmMTris-HCl,pH8.5、50mMEDTA，pH8.0、lOOmMNaCl)，65。C水浴60min，其間混勻ft次；加等體積氯仿異戊醇(24:1),3000r/min離心20min;取上清，加2/3體積預冷異丙醇沉澱DNA,加200jaL超純水溶解；加RNA酶至200ng/|jL，37。C處理60min;加等體積氯仿異戊醇(24:1)抽提2次；取上清，加2倍體積預冷無水乙醇於-20。C下沉澱DNA,70%乙醇洗滌2~3次，室溫乾燥後溶於適量超純水。DNA純度和濃度用0.8°/。瓊脂糖凝膠和BioSpec-mini分光光度儀(Shimadzu，Japan)檢測。採用上述步驟(3)合成的引物，首先以丹參樣品樣品基因組DNA進行擴增，以檢測引物設計的可靠性、擴增^^莫式及其可用性。然後進一步以不同鼠尾草近緣物種基因組DNA進行PCR擴增，檢測丹參EST-SSR標記在鼠尾草屬種間的通用性；根據擴增結果，篩選得到可有效擴增的丹參EST-SSR引物(如圖1所示)。本實施例中，對各樣品的基因組DNA進行PCR擴增時，採用下述擴增體系25jaL擴增體系中含有1xPCRbuffer、MgCl21.5mmol/L、dNTPs(Sigma，America)200jamol/L、正反向引物各0.5jumol/L、基因組模板DNA50ng以及TaqDNA聚合酶(Takara,Japan)。5U。在I-Cycler熱循環儀(Bio-RAD，America)進行擴增，PCR擴增程序為①94。C預變性3min;②94。C變性30s、65。C退火30s，每循環降rC，72。C延伸60s,IO個循環；③94。C變性30s、55。C退火30s、72。C延伸60s、23個循環；④72。C延伸7min。擴增反應完成後，向PCR產物中加入6xloadingbuffer5inL混勻，於8°/。非變性連續PAGE(Acr:Bis=39:1)、150V恆壓電泳2h左右，採用銀染方法顯帶，拍照、記錄結果。依據擴增結果，分析丹參EST-SSR引物有效性及通用性，篩選出可有效擴增的丹參SET-SSR引物83對(圖1)。實施例2本實施例為實施例1所得的引物用於丹參的遺傳多樣性分析及種質鑑定1、供試材料選取13份丹參材料，包括7份野生居群和6份栽培居群，同時選取10份鼠尾草屬近緣物種用於^r測丹參EST-SSR標記在遺傳多樣性分析及種質鑑定應用中的有效性，具體信息詳見圖2。2、DNA提取每個樣本隨機選取3個單林，採幼葉等量混合，取Q.2-0.5g新鮮幼葉於液氮中研成粉末；將粉末轉至1.5mL離心管中，力。500yL預熱提取緩衝液(2%CTAB、lOOmMTris-HC1,pH8.5、50mMEDTA,pH8.0、lOOmMNaCl)，65。C水浴60min,其間混勻^t次；加等體積氯仿異戊醇(24:1),3000r/min離心20min;取上清液，加2/3體積預冷異丙醇沉澱DNA，加200juL超純水溶解；加RNA酶至20Qng/|jL,37。C處理6Gmin;加等體積氯仿異戊醇(24:1)抽提2次；^Ji清，加2倍體積預冷無水乙醇於-2(TC下沉澱DNA，70%乙醇洗滌2~3次，室溫乾燥後溶於適量超純水。DM純度和濃度用0.8%瓊脂糖凝膠和BioSpec-mini分光光度儀(Shimadzu,Japan)檢測。3、EST-SSR擴增以篩選鑑定的丹參EST-SSR引物對供試材料進行PCR擴增；PCR擴增反應體系為25iaL擴增體系中含有:1xPCRbuffer、MgCl21.5mmol/L、dNTPs(Sigma,America)200jumol/L、正反向引物各0,5|amol/L、基因組模板DNA50ng以及TaqDNA聚合酶(Takara，Japan)0.5U;PCR擴增在I-Cycler熱循環儀(Bio-RAD,America)進行，PCR擴增反應程序如下①94'C預變性3min;②94。C變性30s、65。C退火30s，每循環降rC，72。C延伸60s，IO個循環；③94。C變性30s、55。C退火30s、72。C延伸60s、23個循環；④72。C延伸7min。向PCR產物中加入6xloadingbuffer5juL混勻，於8°/。非變性連續PAGE(Acr:Bis=39:1)、150V恆壓電泳2h左右，採用銀染方法顯帶，拍照、記錄結果(見圖3、4)。在13個丹參居群中，EST-SSR引物共擴增出279個位點，平均每對引物產生3.88個位點，而且所有EST-SSR引物在供試丹參樣品中均顯示多態性擴增(圖3、4)。同時，大多數丹參EST-SSR引物在供試的其他IO個異源鼠尾草屬物種中同樣能進行有效擴增，可轉移率為50%-100%,平均為85%,丹參EST-SSR在鼠尾草屬中具有很高的可轉移性，可用於進一步的多樣性分析、比較基因組學等研究中(圖3、4)。4、EST-SSR擴增結果數據轉化及分析EST-SSR為共顯性標記，按照擴增條帶的有無分別記為1和0，只選用150bp-500bp間且在兩次重複中均出現的清晰條帶記分。其結果為一個0、1二元矩陣，將其輸入NTSYS-pc軟體處理分析，以SIMQUAL子程序計算樣本間的Jaccard相似係數。之後，基於遺傳相似係數矩陣，依據UPGMA算法並以SHAN子程序進行聚類分析(圖5)。同樣，基於遺傳相似係數矩陣，以DCENTER和EIGEN子程序進行主成分分析(PC0)，生成前2個主成分的二維圖(圖6)。以UPGMA算法對所有供試材料進行聚類分析，結果表明EST-SSR分析可明確區分丹參及其他鼠尾草屬近緣物種，所有分析材料可聚為兩大類一I:丹參；II:其他鼠尾草屬近緣物種(圖5)。將Jaccard相似性係數做DCENTER轉換，進行主成分分析，結果顯示供試丹參居群間存在豐富的多樣性，野生居群與栽培居群間分化明顯(圖6)。權利要求1、丹參EST-SSR分子標記的製備方法，包括下述主要步驟(1)、丹參EST序列的獲得及預處理從GenBank中下載丹參EST序列；去除載體汙染和重複序列，去除5』端或3』端的polyT或polyA，進行EST重疊群分析和聚類、去除冗餘EST序列，並去除長度小於100bp的EST序列，拼接後得到非冗餘Uni-EST序列；(2)、丹參EST序列中SSR位點的篩選採用SSR位點檢索專用軟體，在上述步驟(1)得到的非冗餘Uni-EST序列中檢索SSR位點，檢索的限制條件包括不同重複基元的SSR其總重複序列長度≥20bp；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸至少重複次數分別為10次、7次、5次、4次、4次；中間被≤5bp的間隔鹼基打斷的不完全重複SSR計為一個SSR位點；檢索得到一系列EST-SSR位點。(3)、丹參EST-SSR引物的設計與合成依據上述步驟(2)得到的EST-SSR位點的側翼區域序列，進行引物設計，引物設計主要參數包括GC含量40％-60％，Tm值45℃-65℃，引物長度18bp-23bp，預期擴增產物長度120bp-350bp；得到的引物序列經Blastn比對，根據結果重點對引物的3』端鹼基及正反向引物間隔進行調整，得到一系列EST-SSR位點擴增特異引物；引物設計完成後進行合成；(4)、丹參EST-SSR引物的篩選採用上述步驟(3)合成的引物，以丹參或者其它鼠尾草屬近緣物種樣品的基因組DNA進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，根據擴增結果，篩選得到可有效擴增的丹參EST-SSR引物。2、根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟(4)中，進行PCR擴增時，採用下述擴增體系25jaL擴增體系中含有:lxpCRbuffer、MgCl21.5mmol/L、dNTPs200jimol/L、正反向引物各O.5|amol/L、基因組模板DNA50ng以及TaqDNA聚合酶0,5U。3、根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟(4)中，進行PCR擴增時，採用的PCR擴增程序為①94。C預變性3min;②94。C變性30s、65。C退火30s，每循環降1'C,72。C延伸60s,10個循環;③94"C變性30s、55。C退火30s、72。C延伸60s、23個循環；④72。C延伸7niin。4、根據權利要求1所述的製備方法得到的EST-SSR位點特異引物，分別包括下列表格中的83對引物序列:tableseeoriginaldocumentpage3tableseeoriginaldocumentpage4tableseeoriginaldocumentpage55、權利要求4所述的引物的應用，包括用於丹參及鼠尾草屬近緣物種的:(1)遺傳多樣性評價；(2)親緣關係鑑定；(3)種質鑑定；(4)遺傳連鎖作圖；(5)分子標記輔助選擇；(6)基因定位克隆；(7)功能基因組分析。全文摘要本發明公開了一種丹參EST-SSR分子標記的製備方法，主要包括丹參EST序列的獲得及預處理、丹參EST序列中SSR位點的篩選、丹參EST-SSR引物的設計與合成、丹參EST-SSR引物的篩選等步驟。該方法針對丹參EST進行SSR位點挖掘，依據SSR位點側翼序列進行PCR引物設計，並在此基礎上構建丹參種屬特異性EST-SSR標記體系；為丹參及鼠尾草屬近緣物種的遺傳多樣性評價、親緣關係或種質鑑定、遺傳連鎖作圖、分子標記輔助選擇、基因定位克隆、功能基因組分析以及相關研究等奠定基礎。本發明還公開了依據上述丹參EST-SSR分子標記製備方法得到的EST-SSR位點特異引物及其應用。文檔編號C12P19/00GK101684481SQ20091005874公開日2010年3月31日申請日期2009年3月30日優先權日2009年3月30日發明者任正隆,勇張,彭金華,熊丙全,趙曉楠,鄧科君申請人:電子科技大學