幹細胞及胚胎來源的心肌細胞及推定的心肌細胞的純化方法
2023-06-07 19:32:46
專利名稱：幹細胞及胚胎來源的心肌細胞及推定的心肌細胞的純化方法
技術領域：
本發明涉及從千細胞及胚胎來源的細胞群中純化心肌細胞的方法 和利用方法。
背景技術：
成人體內心肌細胞喪失增殖活性，在諸如重症心肌梗塞、心肌症 等病症中，必須依賴心臟移植手術。但現狀的心臟捐贈者不足至今仍 是一 個難以克服的問題，因此尋找心臟移植以外的治療方法是當務之急。
針對此情況，在體外製備、純化心肌細胞，對心肌細胞進行補充， 成為挽救必須依賴心臟移植的患者的最有希望的方法。因此，為了荻 得心肌細胞，對使幹細胞(胚胎幹細胞或各種成體幹細胞)進行分化 的方法、從胎盤獲得等方法進行了大量研究。
可以通過分別在小鼠胎幹細胞中，將抑制分化的因子(滋養細胞、
白血病抑制因子LIF等)、在人胚胎幹細胞中將抑制分化的因子(滋 養細胞、鹼性成纖維細胞生長因子bFGF、轉化生長因子TGF等) 從培養液中除去，形成細胞塊(類胚體)從而積極的引發分化。
在體外進行分化的模式一部分沿襲了生理的發育，特別是發育初 期的事件，在受精卵中發生的生理髮育與體外的分化模式有著眾多的 共同點。體外向心肌細胞分化的語系，與生理髮育相同都要先形成未 分化的中胚葉細胞，其一部分經過推定心肌細胞(presumptive cardiac myocyte)(前心臟中胚葉)後，分化為心肌細胞。但是，由 於胚胎性幹細胞可以分化為構成臟器的所有細胞，使其只分化為一種 細胞在技術上還存在困難。
另外，在體外非生理條件下(in vitro),引發所有細胞發生分 化較難，有可能存在一部分未分化的細胞。另外，可以分化為心肌細 胞的成體幹細胞為存在於骨髓或臍帶中的間葉幹細胞、存在於各組織 中的組織幹細胞(神經管細胞、脂肪肝細胞、骨骼肌幹細胞等)，它 們可分化為多種細胞，而非心肌細胞一種。任何一種成體幹細胞，其 分化為心肌細胞的詳細機制過程均未被充分的探明，它們都經歷一定 時期的遷移狀態後形成含有心肌細胞或其它分化細胞、未分化細胞的 細胞集群。
概括地說，所有的幹細胞都有共同的缺點，即產生心肌細胞以外 的其它細胞的副產物，或殘留有未分化的細胞等對臨床應用有害的性 質。未分化細胞具有增殖活性，並可以分化為多種細胞，因此難以直 接將含有分化誘導後的心肌細胞的細胞集群原狀移植至生物體內，用 於治療。
因此，為了安全的實施使用幹細胞進行治療，獲得理想的治療效 果，有必要尋找將心肌細胞本身從細胞集群中純化分離出來的方法。
目前，多採用使心肌細胞特異性表達GFP等螢光標記，使用流式 細胞分選儀純化表達螢光標記的細胞的方法(非專利文獻1)，或使 心肌細胞特異性表達耐抗生素蛋白質，使用抗生素物質進行選擇的純 化方法(非專利文獻2)，進行心肌細胞的純化。但是在這些方法中， 必須進行遺傳基因的改變存在由此引起的安全性問題，因而無法利用 於實際的移植當中。另外，上述方法均為伴有基因改變的方法，不僅 基因組的改變本身存在著倫理上的問題，還存在細胞癌化率的改變等 無法預測的嚴重風險(非專利文獻3)。
雖然已知心臟可以利用來自骨骼肌等其它器官產生的乳酸作為能 量源(非專利文獻4),但利用該性質純化心肌細胞的嘗試以前還從 未有過。
另外，心臟、肝臟、腎臟中，利用天門冬氨酸和穀氨酸向線粒體 內運送NADH，與其他器官有著不同的機制(非專利文獻5) 。 NADH向 線粒體內的運送對於在線粒體內的能量生產的必不可少的。迄今為止， 根據該機理的不同之處嘗試心肌細胞的純化是沒有先例的。
非專利文獻l: MullerM， etal.， FASEB J. 2000; 14:2540-2548 非專利文獻2: Klug MG, et al.， J. CI in. Invest. 1996; 98: 216-224
非專利文獻3: Schroder AR， et al. ， Cell. 2002; 110:521-529 非專利文獻4: KhairallahM， etal.， Am J Physiol Heart Circ
Physiol 2004; 286， H1461-1470
非專利文獻5: Chatham JC， et al. ， J.Biol Chem 1995;
270:7999-8008
發明內容
發明所要解決的問題
本發明的課題為，開發一種利用在目前以純化心肌細胞為目的研 究中從未想到過利用的諸多性質、以及新發現的諸多性質，可在不改 變遺傳基因，不添加特別的蛋白質及生理活性物質的情況下，從含有 來源於胚胎及幹細胞的心肌細胞的細胞混合物中，高度且高收率的純 4匕心肌幹細力包的方法。
解決問題所用的方法
技術領域：
本發明的發明者們，為了構建能有效生產胚胎幹細胞來源的心肌 細胞的系統，對培養液進行了系統研究。通過改變使用的培養液的組 成，進行各種培養液組成成分的濃度研究、及應當適應的時期的研究， 結果發現了以下現象
(1 )在低.無血清條件下引起對具有非心肌細胞分化傾向性的細 胞分化增殖抑制及誘導細胞凋亡的現象；
(2 )在弱酸性培養液中引起具有非心肌細胞分化傾向性的誘導細 胞凋亡的現象的現象；
(3) 在低鉤培養液中引起對具有非心肌細胞分化傾向性的細胞分 化增殖抑制及誘導細胞凋亡的現象；
(4) 在低營養培養液中進行培養的情況下非心肌細胞選擇性死亡
的現象；
(5 )在低釣環境下培養心肌細胞時心肌細胞的自律跳動減弱，能
量消耗被抑制的現象。
(6)低.無血清化促進心肌細胞自我集合塊形成的現象，和
(7 )心肌細胞細胞塊零亂分散的情況下心肌細胞的生存率顯著下
降的現象。
本發明的發明者們，通過組合針對上述現象的方法並進行優化， 發現可有效且高度地選擇純化胚胎幹細胞來源的心肌細胞，從而完成 了本發明。另外還發現，胚胎幹細胞中發現的方法，可應用於胎盤來 源的心肌細胞的選擇和/或純化、及成體幹細胞來源的心肌細胞的選擇 和/或純化，從而完成了本發明。
更具體而言，在本發明的一種方案為提供一種選擇心肌細胞的方 法，是從含有胚胎幹細胞來源、成體幹細胞來源或胎盤來源的心肌細 胞和非心肌細胞的細胞混合物中，選擇心肌細胞的方法，其特徵為將
上述細胞混合物在具有選自(i)低糖條件；及(ii )低鉀條件、低營 養條件、添加乳酸條件、添加天門冬氨酸和/或穀氨酸的條件、及添加 丙酮酸的條件中的1個或多個條件的培養液中進行培養，對心肌細胞 進行選擇。在該方案中，對上述細胞混合物進行胚胎幹細胞方向的分 化誘導，形成含有推定心肌細胞(未分化中胚葉)的類胚體，將該類 胚體在低血清條件及/或弱酸性pH條件的培養液中進行培養而進行 製備。
在本發明另一個方案中，提供一種選擇來源於胚胎幹細胞的心肌 細胞的方法，其特徵為，在對胚胎幹細胞進行分化誘導以後，形成含 有未分化的中胚葉的類胚體以後，通過將該類胚體在低血清條件及/ 或弱酸性pH條件的培養液中培養，以製備含有推定心肌細胞的細胞混 合物，然後通過在同一培養液中繼續進行該細胞混合物的培養的而獲 得心肌細胞。
圖1為表示附著培養的類胚體的心肌細胞的存在模式的圖。
圖2為表示無血清條件下培養的結合類胚體中的心肌細胞的存在 模式的圖。
圖3為表示通過無血清化選擇推定心肌細胞的圖。 圖4為表示低鈣環境影響的圖。
圖5為表示對於在胚胎幹細胞中，通過無血清和/或弱酸性pH條 件選擇推定心肌細胞的圖。
圖6 - 1為表示在胚胎幹細胞中，通過無血清和/或弱酸性pH條件 對推定心肌細胞進行分析的圖。
圖6 - 2為表示在胚胎幹細胞中，通過無血清和/或弱酸性pH條件 對推定心肌細胞進行分析的圖。
圖7為表示對於胚胎千細胞，通過無血清和/或弱酸性pH條件選 擇的心肌細胞塊的圖。
圖8為表示對於在無糖和/或無血清和/或添加乳酸的培養條件下 選擇心肌細胞的圖。
圖9為表示對於在無糖和/或無血清，添加乳酸的培養條件下對於 已經選擇和/或回收的心肌細胞的特異性染色的圖。
圖10為表示對於在無血清和/或弱酸性和/或低鈣和/或無糖，並 添加乳酸的培養條件下剛剛選擇後的心肌細胞塊和死細胞塊的圖。
圖11為表示使用密度梯度離心除去死細胞塊構成的高密度凝集 體的方法的圖。
圖12- 1為表示在無血清和/或弱酸性和/或低鉀和/或無糖，並添 加乳酸的培養條件下選擇的心肌細胞塊的圖。
圖12- 2為表示在無血清和/或弱酸性和/或低鈣和/或無糖，並添 加乳酸的培養條件下選擇的心肌細胞塊的圖。
圖13為表示在無血清和/或弱酸性和/或低鈣和/或無糖，並添加 天門冬氨酸和/或穀氨酸的培養條件下純化的心肌細胞的圖。
圖14為表示純化骨髓幹細胞來源的心肌細胞的圖。
圖15為表示純化胎盤來源的心肌細胞的圖。
圖16為表示在無血清和/或弱酸性和/或低鈣和/或無糖，並添加 丙酮酸的培養條件下，在培養時發生自律性搏動的細胞區域的圖。
圖17為表示在無糖和/或無血清，並添加乳酸的培養條件下，在 15天培養後選擇的絨猴心肌細胞塊的圖。
圖18為表示在無糖和/或無血清，並添加乳酸的培養條件下，對 於選擇和/或回收的絨猴細胞的心肌細胞特異性染色的圖。
圖19為表示在無糖和/或無血清，並添加乳酸的培養條件下選擇 回收的絨猴細胞，在受供者心臟內部生長附著的圖。
圖20為表示在有糖(對照)條件下進行培養的人胚胎幹細胞來源 的細胞塊(對照)、和無糖(心肌選擇)條件下進行15天心肌細胞選 擇培養的人胚胎幹細胞來源的細胞塊(心肌選擇條件)的狀態的圖。
圖21為表示在無糖(心肌選擇)條件下對人胚胎幹細胞進行15 天心肌細胞選擇培養後，變更培養液條件後，再次啟動自律性搏動的 心肌細胞形成的胚胎幹細胞來源的各細胞塊的，抗肌動蛋白抗體及抗 Nkx2. 5抗體的染色圖像的圖。
具體實施例方式
對於具有向心肌細胞分化能力的幹細胞(胚胎千細胞、骨髓幹細 胞等成體幹細胞)，進行適當的心肌細胞分化誘導後，發生向心肌細 胞的分化。即，例如通過從培養液中去除白血病抑制因子(LIF)進行 懸浮培養，使形成細胞塊(類胚體)以懸滴法對小鼠胚胎幹細胞進行 處理，可誘導胚胎幹細胞向心肌細胞進行分化。或者使用絨猴胚胎幹 細胞或人類胚胎幹細胞，可同樣的誘導胚胎幹細胞向心肌細胞進行分 化。
本發明的方法可適用於來源於任意一種哺乳動物的幹細胞。例如， 本發明的方法可適用於來源於小鼠、牛、山羊、豬、貓、絨猴、獼猴、 人的幹細胞，只要是來自於上述動物的幹細胞無其他限定。例如，作 為本發明中使用的幹細胞，可例舉出目前已經作為培養細胞廣泛使用 的小鼠、猴子、人等哺乳動物的來源的ES細胞。
作為來源於小鼠的ES細胞的具體例子，可舉出EB3細胞、El4細 胞、D3細胞、CCE細胞、Rl細胞、129SV細胞、Jl細胞等。本發明中 使用的源於小鼠的ES細胞可從例如美國典型培養物保藏中心 (American Type Culture Collection, ATCC)或Chemicon公司、Cell & Molecular Technologies公司等購入。
源於猴子的ES細胞，有例如獼猴(rhesus monkey: Macaca mulatta ) ( Thomson et al.， Proc. Natl.Acad.Sci. USA 1995; 92: 7844 ) 或食蟹猴(cynomolgus monkey: Macaca fascicularis ) (Suemoriet al.， Dev. Dyn. 2001; 222: 273-279 )、普通絨猴(common marmoset: Callithrix jacchus ) ( Sasaki et al.， Stem Cells. 2005; 23: 1 304-1313 )等建立的報導，可以進行使用。例如，可以從財 團法人.實驗動物中央研究所處獲得絨猴的ES細胞。
來源於人的ES細胞，目前全世界已經建立有數10種以上，例如 美國.國立衛生研究所的清單(http:〃stemcells. nih.gov/ registry/index, asp)上登記了很多細胞林可供使用，同時還可以從 Cel lart is公司或ES Cell International公司、Wisconsin Alumni Research Foundation等處購入。另夕卜，曰本方面，可以從國立大學 法人 京都大學再生醫科學研究所附屬幹細胞醫學研究中心處獲得 (Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.， 2006; 345: 926-932 )
另外，也有確立牛(Mitalipova et al. ， Cloning 2001; 3:59-67 )、 鳥(Petitte et al.， Mech. Dev. 2004; 121: 1159-1168 )、斑馬魚 (Fishman， M. C. ， Science 2001; 294: 1290-1291 )的ES細胞的報導。
通常ES細胞通過培養初期胚胎進行建立，從進行了體細胞核的核 移植的初期胚胎可以製得ES細胞(Munsie et al.， Curr. Biol. 10: 989, 2000; Wakayama et al. ， Science 292:740, 2001; Hwang et al., Science 303:1669， 2004 )。另外，還有使孤雌胚胎在嚢胚期 同樣的階段發生，從其製備ES細胞的嘗試(美國專利公開第02/ 168763號；Vrana K et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 11911-6 );或還有通過ES細胞與體細胞的融合，製備具有體細胞核的遺傳基因的 ES細胞的方法等的報導(國際
發明者服部文幸, 福田惠一 申請人:阿斯比奧製藥株式會社;學校法人慶應義塾