小麥抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應用的製作方法
2023-06-07 15:48:01
專利名稱：小麥抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物蛋白質領域，具體而言，本發明涉及能賦予植物(尤其是小麥)除草劑抗性(耐受性)的蛋白及其在植物育種中的應用。
背景技術：
農田中雜草是影響農作物產量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力資源和成本很高，而且不便於農業集約化生產，嚴重製約了農作物種植向高產、優質和低成本方向的發展進程。因此，除草劑就應運而生，其使用為解決農田草害、促進栽培方式的革新及增產中起了很大的作用。常見的除草劑，包括有磺醯脲類、咪唑啉酮類、嘧啶並三唑類、水楊酸嘧啶類等除草劑，目前已經大面積商業推廣使用。然而，由於這些除草劑通常也能殺死農作物本身，因此對一般不具有除草劑抗性(耐受性)的農作物而言，除草劑的使用在時間和空間上受到了極大限制，如需要在農作物播種前一段時間使用除草劑。為此，人們研究開發具有除草劑抗性(耐受性)的植物(農作物)，這樣可以在種植期間使用除草劑，殺死雜草，但不影響植物本身的生長，由此拓寬了除草劑的使用範圍。然而，具有除草劑抗性的植物及其起決定性的物質(如蛋白、基因等)目前還沒有理論來定向設計出，只能依賴於科研人員艱苦實踐而獲得，尤其是依賴長期篩選，並且憑藉一些運氣才能獲得。本發明人正是長期而艱苦的研究實踐，偶然地在小麥寧春4號突變植株中發現了一系列(突變)蛋白，其能夠在除草劑存在的條件下基本保持原有蛋白的正常植物生理功能，從而使得植物具有除草劑抗性(耐受性)。本發明人還開發了這些蛋白及其編碼基因在轉基因或者非轉基因植物育種中的應用，可用於培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農作物，如小麥等。
發明內容
本發明要解決的技術問題在於提供新的使植物具有除草劑抗性的蛋白質。另外， 本發明還提供了編碼這些蛋白質的核酸以及基因工程中間體(如，表達盒、載體和細胞等)， 獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應用，並且提供了判斷植物是否採用本發明方法獲得的鑑定方法。具體而言，在第一方面，本發明提供了使植物具有除草劑抗性的ALS蛋白質，其帶有Alal79和/或kr627突變，即帶有Alal79突變、或者kr627突變、或者Alal79和kr627 雙突變。在本文中，ALS就是乙醯乳酸合成酶(acetolactate synthase)的簡稱，其酶分類編號為EC4，1. 3. 18。乙醯乳酸合成酶是支鏈胺基酸合成中的一個關鍵酶，如在纈氨酸和亮氨酸的合成中催化丙酮酸生成乙醯乳酸和二氧化碳，在異亮氨酸的合成中催化丙酮酸與丁酮酸生成2-乙酸基-2-羥基丁酸(James C. Global Status of Commercialized Biotech/ GM Crops: 2006. ISAAA Briefs. Ithaca, NY)。
本發明第一方面的蛋白質是從本發明人突變的水稻植株中發現的。目前，已經發現ALS突變蛋白在不同植物(包括玉米、小麥、水稻、油菜、和向日葵等)的同源蛋白的第 122、155、197、205、574、653、和/或肪4等位點會產生突變，從而使得相應植物對咪唑啉酮類、磺醯脲類、三唑嘧啶類和嘧啶水楊酸類等除草劑產生抗性(Tan S, Evzns R R, Dahmer M L, et al. Imidazolinone-tolerant crops History, current status and Future. Pest Management Science. 2005, 61: 246-257 ；Tan S, Evzns R R, Dahmer M L, et al. Imidazolinone-tolerant crops: History, current status and Future [J]· Pest Management Science. 2005，61: 246-257)。然而，沒有報導表明，在來自水稻的ALS的第 179和/或627位突變，會使得相應植物(尤其是水稻)具有除草劑抗性。優選本發明第一方面的蛋白質帶有Alal79Val和/或kr627ASn突變，即帶有 Alal79Val突變、或者kr627Asn突變、或者Alal79Val和Ser627Asn雙突變，即從原有胺基酸序列的第179位的Ala突變為Val和/或第627位的Ser突變為Asn。除了本發明具體實施方式
所述的突變植株篩選和擴增方法之外，在蛋白質序列已知的情況下，本領域技術人員有能力通過改變已知蛋白質的編碼基因序列並將其導入表達載體，就可以製備出取代、添加或缺失了胺基酸殘基的蛋白質，這些方法記載於《分子克隆實驗指南》(北京科學出版社，2002年)等文獻中。在本發明的具體實施方式
中，本發明第一方面的蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO :2、4或6所示。這些蛋白質經證實是對除草劑不敏感的乙醯乳酸合成酶。目前，以抑制ALS為靶位的除草劑包括磺醯脲類、咪唑啉酮類、嘧啶並三唑類、水楊酸嘧啶類等除草劑(Peter Babczinski, Thomas Zelinski. Mode of action herbicidal ALS-inhibitors on acetolactate synthase from green plant cell cultures, yeast, and Escherichia coli. Pesticide science, 1991, 31: 305-323;鄭培忠，沈健英.乙醯乳酸合成酶抑制劑的種類及其耐藥性研究進展.雜草科學，2009， 2: 4-8)。因此，在本文中，除草劑抗性指的是對包括磺醯脲類、咪唑啉酮類、嘧啶並三唑類、 水楊酸嘧啶類在內的除草劑具有耐受性。優選在本發明中，除草劑是咪唑啉酮類除草劑， 如在本發明的具體實施方式
中，除草劑是咪草煙(其化學名稱為(RS)5-乙基-2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)煙酸，CAS號為81335-77-5)。即優選在本發明中，除草劑抗性是咪唑啉酮類除草劑抗性，更優選是咪草煙抗性。在第二方面，本發明提供了核酸，其編碼本發明第一方面的蛋白質。在本文中，核酸可以是DNA，也可以是RNA，優選是DNA。在知曉所編碼蛋白序列或核酸序列的前提下，通過常規的密碼子對應關係和宿主表達頻率，運用PCR方法、DNA重組法或人工合成的方法， 本領域技術人員有能力獲得並優化編碼本發明第一方面的蛋白質的核酸。一旦獲得該核酸，就可以將其克隆入載體，再轉化或轉染入相應的細胞，然後通過常規的宿主細胞進行增殖，從中分離得到大量的核酸。優選本發明第二方面的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO=U 3或5所示。在第三方面，本發明提供了表達盒(cassette)，其包含本發明第二方面的核酸。本發明第三方面的表達盒優選在5』 -3』的轉錄方向上包含啟動子區、本發明第二方面的核酸和轉錄和翻譯的終止區。本發明第三方面的表達盒優選適合在植物中表達本發明第二方面的核酸。示例性的啟動子包括來自CaMV 35S啟動子或者稻肌動蛋白I基因、玉米醇脫氫酶基因、玉米矮縮I基因或菸草花葉病毒(TMV) Ω元件的啟動子；示例性的轉錄和翻譯的終止區包括轉錄終止元件或多聚腺苷酸化信號等。本發明第三方面的表達盒還可以包括，在細菌中複製所需的複製起點(例如，來自PBR322或Ρ15Α ori的ORI區)，土壤桿菌T-DNA轉移所需要的元件(例如，T-DNA的左邊界和/或右邊界)，從而方便從細菌往植物中的轉化過程。另外，本發明第三方面表達盒還可以包含增強子、內含子、多克隆位點、操縱基因、阻遏物結合位點、轉錄因子結合位點等，例如來自TMV、玉米褪綠斑點病毒(MCMV)或苜蓿花葉病毒(AMV)的前導序列等作為增強子，又如可以包括來自Adh Ubronze 1、肌動蛋白1或肌動蛋白2的內含子。在第四方面，本發明提供了載體，其包含本發明第二方面的核酸。在本文中，載體是指本領域中常用的細菌質粒、粘粒、噬菌粒、酵母質粒、植物細胞病毒、動物病毒及其它各種病毒載體。根據所應用的目的不同，載體可以分為克隆載體、表達載體和轉化載體，指的是所使用的目的分別針對克隆並驗證基因、表達相應基因和將相應基因轉化。本發明中可用的載體包括但不限於在細菌中表達用的載體(原核表達載體)、在酵母中表達用的載體 (如畢赤酵母載體)、在昆蟲細胞中表達的杆狀病毒載體、在哺乳動物細胞中表達用的載體 (痘苗病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達用的各種載體。本發明第四方面的載體是轉化載體， 尤其是植物轉化載體，特別是適合農桿菌轉化植物的載體。這些載體很多已經商品化了。在第五方面，本發明提供了細胞，其包含本發明第二方面的核酸。細胞可以是原核細胞，也可以是真核細胞，如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。 在本文中，植物細胞指的是來自植物的細胞(可以包括細胞群，但優選是單個細胞)，但是這些細胞不能僅僅藉助光合作用而以水、二氧化碳和無機鹽等無機物合成碳水化合物、蛋白質來發育成存活的單個植株。植物細胞可以是必須使用有機物(如某些植物激素)才能發育的植物細胞或細胞群，也可以是完全無發育成植株能力的植物細胞或細胞群，通俗地說，即死亡的植物細胞或細胞群，如乾燥粉碎過的市售小麥麵等。本發明的第二方面的核酸可被插入轉化進細胞中的任何載體中。優選的細胞是細菌細胞，尤其是用於克隆或儲存核酸、或是用於轉化植物細胞的細菌細胞，例如農桿菌、大腸桿菌，包括根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌等。另外優選的細胞是植物細胞，優選是小麥細胞，更優選是寧春4號細胞，所述植物細胞中包含的本發明第二方面的核酸可以是通過轉基因技術導入植物細胞的，包括導入到植物細胞的核、葉綠體、線粒體和/或質體中，也可以是通過突變技術(如本發明具體實施方式
所述的技術)使得本發明第二方面的核酸存在於植物細胞中的。在第六方面，本發明提供了植物，其包含本發明第二方面的核酸，和/或其表達本發明第一方面的蛋白質。由於引入了本發明第二方面的核酸和本發明第一方面的蛋白質， 本發明第六方面的植物具有除草劑抗性。在本文中，植物指的是藉助光合作用，以水、二氧化碳和無機鹽等無機物就能合成碳水化合物、蛋白質來維繫生存的單個植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品種、植株、植物事件、植物後代、植物種子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物後代本身就是植物，包括通過轉基因技術產生的植物後代、與其他植物品種雜交產生的植物後代、以及回交或自交產生的植物後代。本發明第六方面的植物可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物。示例性的植物包括小麥、水稻、玉米、黑麥、燕麥、大麥、大豆、馬鈴薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西紅柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、菸草、或擬南芥等。在本發明的具體實施方式
中，優選本發明第六方面的植物是小麥，更優選是寧春4號。其中，寧春4號是我國在1980 年代初期就在寧夏培育出的非轉基因小麥品種，已經可以在我國推廣使用了 30年，是我國解放以來累計種植面積最大的小麥品種，其品種審定編號為寧審種8101。本發明第六方面優選的植物，可以繼承了寧春4號豐產性突出、適應性廣泛、品質優良等特性，並具有除草劑抗性，尤其具有咪唑啉酮類除草劑抗性，特別是咪草煙抗性。在第七方面，本發明提供了本發明前述各方面在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用。在獲得具有除草劑抗性的植物過程中，可以應用到本發明前述各方面。本發明第七方面所提供的應用包括，本發明第一方面的蛋白質在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第二方面的核酸在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第三方面的表達盒在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第四方面的載體在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第五方面的細胞在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第六方面的植物在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用。優選在本發明的第七方面中，除草劑是咪唑啉酮類除草劑，優選是咪草煙。在本文中，獲得包括製備、培育、生產或以其他方式產生得到，包括通過轉基因育種方式獲得，如將本發明第二方面的核酸轉化入植物後使之表達本發明第一方面的蛋白質；也包括通過非轉基因育種方式獲得，如通過雜交、回交、自交或無性繁殖本發明第六方面的植物並分選出仍舊包含本發明第二方面的核酸並表達本發明第一方面的蛋白質的植物。因此，本發明的第七方面提供的應用包括，在獲得具有除草劑抗性的轉基因植物過程中的應用和在獲得具有除草劑抗性的非轉基因植物過程中的應用。在第八方面，本發明提供了獲得具有除草劑抗性的植物的方法，其包括如下步驟
(1)使植物包含本發明第二方面的核酸；和/或，
(2)使植物表達本發明第一方面的蛋白質。可以採用前述或者本領域技術人員能獲知的轉基因和非轉基因方法，使植物包含本發明第二方面的核酸，或者使植物表達本發明第一方面的蛋白質。實施本發明第八方面的方法，能夠獲得本發明第六方面的植物。優選在本發明的第八方面中，可以採用的步驟包括轉基因、雜交、回交、自交或無性繁殖步驟。這些步驟本身對於轉基因或非轉基因育種領域的技術人員來說，都是可以獲知並實施的。在第九方面，本發明提供了鑑定本發明第六方面的植物或者本發明第八方面的方法獲得的植物的方法，其包括如下步驟
(1)測定所述植物是否包含本發明第二方面的核酸；和/或，
(2)測定所述植物是否表達本發明第一方面的蛋白質。通過該方法，可以判斷植物是否屬於本發明的植物，即是否屬於本發明第六方面的植物，或者是否屬於本發明第八方面的方法獲得的植物。測定的步驟可以通過常規的核酸檢測和/或蛋白質檢測方法來進行，只需要能夠檢測出蛋白質或其編碼核酸帶有Trp548 突變或其相應核酸突變的方法都可以，優選能夠檢測TrpMSCys或TrpMSMet突變或其相應核酸突變。示例性的方法包括蛋白質測序、核酸測序、聚合酶鏈式反應(PCR)檢測、探針雜交檢測等。本發明取得的有益效果在於獲得可替代現有技術的使植物具有除草劑抗性的蛋白質、核酸、表達盒、載體、細胞、植物、獲得具有除草劑抗性的植物的應用和方法、以及鑑定本發明的植物的方法，並且可以通過轉基因或非轉基因方法獲得具有除草劑抗性的植物品種，尤其是能繼承寧春4號優良特性的小麥品種。本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重複敘述過一樣。為了便於理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的了。
圖1顯示了抗咪唑啉酮類除草劑的小麥突變植株。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常用分子生物學、組織培養技術和農學手冊所記載的方法。例如，具體步驟可參見《Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition))) (Sambrook, J. ,Russell, David W. , 2001,Cold Spring Harbor), ((Plant Propagation by Tissue Culture)) (Edwin F. George, Michael A. Hall, Geert-Jan De Klerk, 2008， Springer)。實施例1從寧春4號突變植株中提取抗咪唑啉酮類除草劑的蛋白突變體
取市售的小麥品種——寧春4號種子400kg，用水浸沒種子4小時，將種子撈出，控幹水分。然後，用0.5% (w/w)甲磺酸乙酯(EMS)浸泡種子12小時，保證液面浸沒種子。12小時後棄去EMS溶液，換自來水浸泡種子，棄自來水，浸泡共重複5次，每次浸泡5分鐘，然後用自來水衝洗種子2小時，衝洗過程中翻動種子，從而將EMS洗淨，稍微風乾後播種，待植株成熟後收割。將收割的種子在田間種植，待長至三葉期時，用咪唑啉酮類除草劑咪草煙 ((RS) 5-乙基-2- (4-異丙基-4-甲基-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)煙酸，CAS號81335-77-5) 以640g/公頃的用藥量田間噴施。調查秧苗枯死情況，發現其中有綠色秧苗持續生長(圖 1)，保留並繁殖這些綠色秧苗，其為抗咪唑啉酮類除草劑的寧春4號突變植株3株。分別取各寧春4號突變植株的葉片，連同野生型的寧春4號植株葉片，分別提取它們的基因組DNA，委託北京三博遠志生物技術有限公司進行測序，發現突變植株1相對於野生型寧春4號，在乙醯乳酸合成酶(ALS)基因的第536位點發生突變，由C變為T，導致相應編碼蛋白的第179位由丙氨酸變為纈氨酸，即該突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，其編碼的ALS蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO :2所示；突變植株2相對於野生型寧春4號，在ALS基因的第1880位點發生突變，由G變為A，導致相應編碼蛋白的第 627位由絲氨酸變為天冬醯胺，即該突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，其編碼的ALS蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO :4所示；突變植株3相對於野生型寧春4 號，在ALS基因的第536和1880位點發生突變，在第536位由C變為T，且在第1880位由G變為A，導致相應編碼蛋白的第179位由丙氨酸變為纈氨酸，且第627位由絲氨酸變為天冬醯胺，即該突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，其編碼的ALS蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO 6所示。實施例2蛋白突變體的抗咪唑啉酮類除草劑的離體活性測定
參照 Fan ZJ 等的方法(Specific activity determination of acetolactate synthase from maize (Zea mays L.).參見 Han WN 等編· The Proceedings of the 18 th Asia-Pacific Weed Science Society Conference . 515 - 522 . May 28 -June 2, 2001 . Beijing Standards Press of China.)，提取上述寧春4號的野生型和各突變植株的ALS酶，並測定相應酶活性被咪唑啉酮類除草劑抑制的比率。過程簡而言之，分別取各植株苗5g切碎後，加入IOmL pH 7的50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩衝液(其中含lmmol/L丙酮酸鈉，0. 5mmol/L MgCl2,0. 5mmol/L TPP,10ymol/L FAD)，用石英砂研磨粉碎後用 8 層紗布過濾，濾液於4°C、20000rpm離心30分鐘。取上清液，加入硫酸銨使之達到50%飽和度，然後0°C放置2小時後，於4°C、20000rpm離心30分鐘。棄上清液，將沉澱溶解於5mL pH 7 的 50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4 緩衝液(其中含 20mmol/L 丙酮酸鈉，0. 5 mmol/L MgCl2), 分別得各植株的ALS酶液。將0. ImL 0. 5%咪草煙水劑(對照用水替代)、0. 5mL酶反應液 (其中含 24mmol/L 丙酮酸鈉，0. 6mmol/L MgCl2, lmmol/L TPP,20ymol/L FAD, 50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4,pH 7)和0. 4mL ALS酶液混合，於35°C避光靜置反應1小時，然後加入0. ImL 3mol/L硫酸終止反應，於60°C放置15分鐘脫羧。然後加入顯色劑(0. 5ml 0. 5% (w/w)肌酸和0. 5 ml 5% (w/w) α -萘酚的混合溶液(溶於2. 5mol/L的NaOH溶液))於60°C放置15 分鐘顯色，測定525 nm處的吸光度。將加入對照的野生型寧春4號的ALS酶活性分別記為 100%,計算咪唑啉酮類除草劑對寧春4號的野生型和各突變ALS酶的活性的影響。結果如下表所示，寧春4號的各突變ALS酶都基本保持了野生型ALS酶的活性，而且在存在咪唑啉酮類除草劑的情況下，野生型ALS酶的活性都有十分顯著的下降，而各突變ALS酶卻都保持了原有酶活性，表明突變ALS酶能夠帶來抗咪唑啉酮類除草劑的性能。咪唑啉酮類除草劑對寧春4號的野生型和突變ALS酶活性的影響表
權利要求
1.使植物具有除草劑抗性的ALS蛋白質，其帶有Alal79和/或kr627突變，優選帶有 Alal79Val 和 / 或 kr627Asn 突變。
2.權利要求1所述的蛋白質，其中除草劑是咪唑啉酮類除草劑，優選是咪草煙。
3.權利要求1或2所述的蛋白質，其胺基酸序列如SEQID NO :2、4或6所示。
4.核酸，其編碼權利要求廣3之任一所述的蛋白質，優選其核苷酸序列如SEQID NO 1、3或5所示。
5.表達盒、載體或細胞，其包含權利要求4所述的核酸。
6.植物，其包含權利要求4所述的核酸，或者其表達權利要求廣3之任一所述的蛋白質，優選所述植物是小麥。
7.權利要求廣3之任一所述的蛋白質、權利要求4所述的核酸、權利要求5所述的表達盒、載體或細胞、或權利要求6所述的植物在獲得具有除草劑抗性的植物中的應用，優選其中除草劑是咪唑啉酮類除草劑，優選是咪草煙。
8.獲得具有除草劑抗性的植物的方法，其包括如下步驟(1)使植物包含權利要求4所述的核酸；或，(2)使植物表達權利要求廣3之任一所述的蛋白質。
9.權利要求8所述的方法，其包括轉基因、雜交、回交、自交或無性繁殖步驟。
10.鑑定權利要求6所述的植物或者權利要求8或9所述的方法獲得的植物的方法，其包括如下步驟(1)測定所述植物是否包含權利要求4所述的核酸；或，(2)測定所述植物是否表達權利要求廣3之任一所述的蛋白質。
全文摘要
本發明提供了使植物具有除草劑抗性的ALS蛋白質，其衍生自小麥品種寧春4號，其帶有Ala179和/或Ser627突變。另外，本發明還提供了相應的核酸、表達盒、載體、細胞、植物、獲得具有除草劑抗性的植物的應用和方法、以及鑑定本發明的植物的方法。
文檔編號A01H5/00GK102559646SQ20121004216
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月22日 優先權日2011年11月24日
發明者周寬基, 王曉雪, 鄧興旺, 馬力耕 申請人:未名興旺系統作物設計前沿實驗室(北京)有限公司