Dna氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法

2023-06-08 10:45:51

Dna氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法
【專利摘要】本發明公開了一種造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，該方法包括以下步驟：實驗分組及動物模型的建立，標本製作，光鏡下組織形態學觀察，透射電子顯微鏡觀察，TUNEL法檢測骨細胞凋亡情況，單克隆抗體N45.1免疫組織化學法檢測骨髓造血細胞DNA氧化損傷，統計學處理。本方法分別於最後一次給藥後第二周、第四周處死實驗動物，每次每組5隻；取雙側股骨頭常規固定脫鈣待測，HE染色計數空缺骨陷窩、電鏡觀察骨細胞形態變化、TUNEL法檢測骨細胞凋亡、免疫組織化學法檢測骨髓造血細胞DNA氧化損傷，探明SANFH與骨髓造血細胞DNA氧化損傷及骨細胞凋亡之間的關係，為進一步探討激素性股骨頭缺血壞死的發病機理提供新的思路。
【專利說明】DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於股骨頭壞死研究領域，尤其涉及造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法。
【背景技術】
[0002]激素性股骨頭缺血壞死(Steroid-1nducedAvascular Necrosis of FemoralHead，簡稱SANFH)是指長期使用或短期大量使用腎上腺皮質激素(以下簡稱激素)引起股骨頭部分缺血或完全缺血，進而導致骨細胞、骨髓造血細胞及脂肪細胞壞死的病理過程，已經得到醫學界的公認。自1957年首次報導以來，臨床病例屢見不乏。
[0003]SANHli要累及中青年，多為雙側性，壞死範圍廣，病情遠較一般的特發性股骨頭缺血壞死嚴重，致殘率極高。2003年「非典」過後，又湧現出大量病例。激素導致一八研^是一個複雜的生物學過程，其發病機制仍不清楚。因此，探明SANHl的病因學機制，仍然是該領域研究的重點。由於其發病機理至今未完全明確，大部分病人早期得不到明確診斷，臨床亦缺少行之有效的防治方法。這不僅加深了我們探明激素性股骨頭缺血壞死病因學機制的緊迫性，同時也給我們對預防、治療激素性股骨頭缺血壞死提出了新的挑戰。只有探明其發病機理，才能為臨床防治提供理論依據。
[0004]自60年代開始，許多學者已開始致力於研究SANFH的發病機理並提出了諸多比較分散的學說，包括:脂肪代謝紊亂、骨內壓升高、骨質疏鬆、激素的細胞毒作用、血管內凝血、潛在血管炎及血管損傷、前凝血狀態等。儘管上述研究都從不同角度闡述了 SANHl的發病機理，為探討SANFH的病因學機制奠定了一定基礎，但就SANFH早期骨細胞、成骨細胞的病理改變及其潛在原因，特別是上述兩類細胞死亡方式及其可逆轉因素一直未能明確，至今仍有許多質疑。
[0005]90年代開始，隨著分子生物學的發展，細胞凋亡理論逐漸受到眾多研究者的重視，已成為研究組織器官衰老、損傷等發病機制的重要研究方向。
[0006]細胞凋亡即程序化細胞死亡，是多細胞有機體為調控機體發育、維護內環境穩定，由基因控制細胞的主動死亡過程，是細胞衰老自然死亡的主要方式之一，是正常的生理過程。但是，凋亡過多或過少都可引起疾病發生。細胞凋亡的發生機制主要與氧化應激、鈣穩態失衡、線粒體損傷等有關；凋亡信號轉導通路受許多誘導因素及調控基因的影響，如激素和生長因子的失衡為細胞凋亡的一個重要誘因。
[0007]近年，已有學者開始對骨細胞、成骨細胞凋亡在SANFH中的作用進行了初步探討，對其發病機制有了新的認識。遺憾的是，這些研究均未對骨細胞、成骨細胞的凋亡機制進行深入研究。
[0008]研究業已表明，細胞DNA氧化損傷細胞凋亡中扮演著重要的角色。氧化損傷即氧自由基超出生理需求時所造成·的細胞損傷。AOS是原子最外層偶數電子失去一個電子後形成的具有強氧化性的集團。氧自由基化學性質活潑，破壞機體的正常氧化/還原狀態，造成生物大分子的氧化損傷，幹擾正常的生命活動，形成嚴重的氧化應激狀態，而機體氧化損傷的後果之一就是誘導細胞凋亡。當AOS增多時,脂質、蛋白質和DNA發生過氧化，可引起DNA單鏈破壞及斷裂。AOS的強氧化作用是細胞損傷的基本環節。DNA氧化損傷可能與人類衰老、神經退行性疾病、糖尿病以及腫瘤等許多疾病的發生有關，可引起人視網膜血管內皮細胞、人成纖維細胞等發生凋亡。
[0009]骨髓造血細胞作為股骨頭的重要組成部分，在SANFH早期發生何種病理改變？是否存在DNA氧化損傷？其病理改變與骨細胞凋亡的發生時間先後關係如何？目前這些問題仍未獲得有效解決。

【發明內容】

[0010]本發明的目的在於提供一種造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，旨在解決在SANFH早期發生何種病理改變，是否存在DNA氧化損傷，其病理改變與骨細胞凋亡的發生時間先後關係如何的問題。
[0011]本發明是這樣實現的，一種造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，該實驗方法包括以下步驟:
[0012]步驟一、實驗分組及動物模型的建立；
[0013]步驟二、標本製作；
[0014]步驟三、光鏡下組織形態學觀察；
[0015]步驟四、透射電子顯微鏡觀察；
[0016]步驟五、TUNEL法檢測骨細胞凋亡情況；
[0017]步驟六、單克隆抗體N45.1免疫組織化學法檢測骨髓造血細胞DNA氧化損傷；
[0018]步驟七、統計學處理。
[0019]進一步，實驗分組及動物模型的建立的具體方法如下:
[0020]採用隨機數字表法，將實驗動物隨機分成A、B、C、D四組；
[0021]A組:10隻，為模型組，靜脈內注射大腸桿菌內毒素，共兩次，每次IOOyg / kg,間隔24h，在第2次注射完大腸桿菌內毒素後隨即肌肉注射甲基強的松龍，共3次，每次20mg / kg,間隔 24h ；
[0022]B組:10隻，為對照組，靜脈注射大腸桿菌內毒素，共兩次，每次IOOyg / kg，間隔24h，在第2次注射完大腸桿菌內毒素後隨即肌肉注射生理鹽水，共3次，每次20mg / kg，間隔 24h ；
[0023]CM:10隻，為對照組，靜脈注射生理鹽水，共兩次，每次100 g / kg,間隔24h，在第2次注射完生理鹽水後隨即肌肉注射甲基強的松龍，共3次，每次20mg / kg,間隔24h ；
[0024]D組:10隻，為對照組，靜脈注射生理鹽水，共兩次，每次100 g / kg,間隔24h，在第2次注射完生理鹽水後隨即肌肉注射生理鹽水，共3次，每次20mg/kg，間隔24h ；
[0025]將動物在最後一次注射後分別於第二、第四周空氣栓塞法處死動物，每次每組5隻，在相對無菌的條件下取雙側股骨頭。
[0026]進一步，實驗動物為成年健康日本大耳白兔40隻，雌雄不限，體重2.5±0.5kg，標準飲食，單籠餵養。
[0027]進一步，標本製作的方法如下:
[0028]兩次所取股骨頭，一側用5%戊二醛溶液固定，另一側用10%甲醛溶液固定，固定時間為一周，15%乙二胺四乙酸即EDTA脫鈣45天，常規石蠟包埋。
[0029]進一步，光鏡下組織形態學觀察的方法為:
[0030](I)取石蠟包埋組織塊，製成厚4um切片，HE染色:A、二甲苯I5min;B、二甲苯II5min ；C>95% 乙醇 I3min ；D>95% 乙醇 II3min ；E>80% 乙醇 lmin ;F、蒸懼水 lmin ;G、蘇木精液染色IOmin ;H、流水稍洗去蘇木精液3s ;1、1%鹽酸乙醇3s ;J、稍水洗30s ;K、促藍液返藍30s ;L、流水衝洗15min ;M、蒸餾水過洗2s ;N、0.5%曙紅液染色3min ;0、蒸餾水稍洗2s ；P、80%乙醇稍洗2s ;Q、95%乙醇I5min ;R、95%乙醇II5min ;S、無水乙醇5min ;T、無水乙醇5min ;U、二甲苯 I5min ;V、二甲苯 II5min ;W、二甲苯 III5min ;X、中性樹膠封固；
[0031](2)將⑴切片分別置於OLYMPUS顯微鏡100倍及400倍光鏡下觀察組織病理學改變。
[0032]進一步，骨細胞壞死病理變化用空缺骨陷窩百分數表示，即在100倍放大倍率下，任選5個高倍鏡視野，每個視野計數50個骨陷窩，分別數出空缺骨陷窩數，求出空缺骨陷窩所佔的百分數；激素性股骨頭壞死判定標準:股骨頭軟骨下區空缺骨陷窩率作為激素性股骨頭壞死的組織學判定指標，正常成年家兔股骨頭軟骨下區空缺骨陷窩率為8% -12%，同等製片條件下股骨頭軟骨下空缺骨陷窩率超過8% -12%即提示骨壞死。
[0033]進一步，透射電子顯微鏡觀察的方法如下:
[0034]取5%戍二醒固定的股骨頭組織,於股骨頭軟骨下0.2-0.3cm切取ImmX ImmX Imm大小骨塊，5 %硝酸脫鈣2-3h，I %四氧化鋨後固定lh，梯度酒精脫水，環氧樹脂包埋，包埋劑與無水乙醇分別以1:1、2:1、3:1濃度混合逐層置換無水乙醇，包埋，37°C恆溫箱24h浸透，60°C烤箱聚合48h，超薄切片機製備50nm超薄切片，染色即醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙染色；將超薄切片置於電子顯微鏡下觀察。
[0035]進一步，TUNEL法檢測骨細胞凋亡情況的方法為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法；
[0036]試劑組成:A、磷酸緩衝液PBS pH7.4 ;B、蛋白酶 K200iig / ml, pH7.4;C、含 2%H2O2的PBS緩衝液pH7.4 ;D、TdT酶緩衝液；E、TdT酶反應液；F、洗滌與終止反應緩衝液；G、0.05%二氨基聯苯溶液;H、0.5% 甲基綠 pH4.0 ;1、100%丁醇，100%、95%、90%、80%和70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸；J、過氧化物酶標記的抗地高辛抗體；
[0037]缺口末端標記法實驗步驟:A、標本預處理:將製備好的石蠟組織切片置於染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min,用無水乙醇洗兩次,每次3min,用95%和75%乙醇各洗一次，每次3min,用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液20ug / ml,於室溫水解15min,去除組織蛋白；用蒸餾水洗4次，每次2min ;B、色缸中加入含2%過氧化氫的PBS，於室溫反應5min，用PBS洗兩次，每次5min ;C、用濾紙吸去載玻片上組織周圍的液體，在切片上加2滴TdT酶緩衝液，置室溫I?5min ;D、用濾紙小心吸去切片周圍的液體，在切片上滴加54iilTdT酶反應液，置溼盒中於37°C反應I小時；E、將切片置於染色缸中，加入已預熱到37°C的洗滌與終止反應緩衝液，於37°C保溫30min,每IOmin將載玻片提起和放下一次,使液體攪動；F、組織切片用PBS洗3次，每次5min後，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，於溼盒中室溫反應30min ;G、用PBS洗4次，每次5min ;H、在組織切片上直接滴加新鮮配製的0.05% DAB溶液，室溫顯色6min ;1、用蒸餾水洗4次，前3次每次Imin，最後I次5min ；J、於室溫用甲基綠進行復染lOmin，用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最後I次靜置30s ;依同樣方法再用100%正丁醇洗三次；K、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、乾燥後，OLYMPUS顯微鏡下觀察並記錄實驗結果；每張切片隨機選5個高倍鏡視野，每個區域計數50個骨細胞，計算凋亡細胞指數即凋亡細胞數/視野中細胞總數。
[0038]進一步，單克隆抗體N45.1免疫組織化學法檢測骨髓造血細胞DNA氧化損傷的方法如下:
[0039]A、切片置於 0.3% H2O2 中 37°C下孵育 30min ；
[0040]B、0.1%胰蛋白酶消化15min ;
[0041]C、加入單克隆抗體N45.1 一滴，37°C下孵育2h ；
[0042]D、DAB 顯色 5min ；
[0043]E、HE 復染。
[0044]進一步，統計學處理的方法如下:
[0045]數據均以X ± S表示，用Spssl3.0軟體進行統計分析，空缺骨陷窩率、骨髓造血細胞DNA氧化損傷率、骨細胞凋亡指數的統計檢驗採用方差分析，多個樣本均數的兩兩比較採用LSD檢驗。
[0046]激素作為非創傷性股骨頭缺血性壞死的重要原因業已被廣泛接受，實驗證實激素是一種細胞凋亡誘導劑，促使成骨細胞和骨細胞凋亡導致骨細胞減少，同時還影響成骨細胞功能，使成骨作用延遲，介導細胞凋亡，造成骨丟失。本實驗方法進一步證實了細胞凋亡在激素性股骨頭缺血壞死中的作用。
[0047]氧化性DNA損傷在生物體細胞老化、死亡的發生過程中起重要作用，自由基一直被認為是引起DNA損傷的主要因素之一。羥自由基和超氧陰離子能直接與DNA分子反應，導致DNA鏈斷裂、鹼基修飾和DNA蛋白交聯等氧化性DNA損傷，其中最主要的致突變性損傷反應是C-8上烏嘌呤與胸腺嘧啶鹼基顛換性突變，產生8-羥基脫氧烏苷(8-0HdG)。骨髓造血細胞作為股骨頭骨組織的重要組成部分，其病理改變勢必影響股骨頭缺血壞死的發生發展，本實驗方法證實，骨髓造血細胞DNA氧化損傷發生於骨細胞凋亡之前，是SANFH的早期分子事件。
[0048]本實驗方法通過對家兔靜脈注射大腸桿菌內毒素模擬出系統的前凝血狀況後再應用大劑量激素，誘導出典型的激素性股骨頭缺血壞死的動物模型，在此基礎上對股骨頭進行組織形態學、超微結構等觀察；並運用免疫組織化學進行綜合分析。得出以下結論:激素在導致股骨頭發生缺血壞死的過程中骨髓造血細胞DNA氧化損傷率增高，骨細胞凋亡指數增高。本發明提供的實驗方法說明骨髓造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡參與了激素股骨頭缺血壞死中的發生。總之，激素性股骨頭壞死發病機制並非單一，骨髓造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡可能是激素性股骨頭壞死的發病機制之一。
[0049]本發明通過對家兔用激素誘導出股骨頭缺血壞死模型，分別於最後一次給藥後第二周、第四周處死實驗動物，每次每組5隻；取雙側股骨頭常規固定脫鈣待測，HE染色計數空缺骨陷窩、電鏡觀察骨細胞形態變化、TUNEL法檢測骨細胞凋亡、免疫組織化學法檢測骨髓造血細胞DNA氧化損傷。探明SANFH與骨髓造血細胞DNA氧化損傷及骨細胞凋亡之間的關係。為進一步探討激素性股骨頭缺血壞死的發病機理提供新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】[0050]圖1是本發明提供的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法的流程圖；
[0051]圖2是本發明實施例提供的第二周A組出現空缺骨陷窩400X ；
[0052]圖3是本發明實施例提供的第二周B組骨陷窩中骨細胞清晰可見400X ；
[0053]圖4是本發明實施例提供的第二周C組骨陷窩中骨細胞清晰可見400X ；
[0054]圖5是本發明實施例提供的第二周D組骨陷窩中骨細胞清晰可見400X ；
[0055]圖6是本發明實施例提供的第四周A組出現大量空缺骨陷窩400X ；
[0056]圖7是本發明實施例提供的圖6第四周B組骨陷窩中骨細胞清晰可見400X ；
[0057]圖8是本發明實施例提供的第四周C組骨陷窩中骨細胞清晰可見400X ；
[0058]圖9是本發明實施例提供的第四周D組骨陷窩中骨細胞清晰可見400X ；
[0059]圖10是本發明實施例提供的第二周A組，骨細胞染色質邊集，細胞核固縮，可見突起形成，細胞膜完整，褶皺10000X ；
[0060]圖11是本發明實施例提供的第四周A組骨細胞染色質邊集，細胞核固縮，可見突起形成，並見凋亡小體12000X ；
[0061]圖12是本發明實施例提供的第四周A組骨細胞染色質邊集，細胞核固縮，可見突起形成，細胞膜，完整，褶皺10000X ；
[0062]圖13是本發明實施例提供的第四周D組，骨細胞細胞胞膜完整，漿內可見分布均勻的粗面內質網，胞核內，染色質分布均勻，10000 X ；
[0063]圖14是本發明實施例提供的第二周A組未出現凋亡細胞400X ；
[0064]圖15是本發明實施例提供的第二周B組未出現凋亡細胞400X ；
[0065]圖16是本發明實施例提供的第二周C未出現凋亡細胞400X ；
[0066]圖17是本發明實施例提供的第二周D組未出現凋亡細胞400X ；
[0067]圖18是本發明實施例提供的第四周A組出現大量凋亡細胞400X
[0068]圖19是本發明實施例提供的第四周B組未出現凋亡細胞400X ；
[0069]圖20是本發明實施例提供的第四周C組未出現凋亡細胞400X ；
[0070]圖21是本發明實施例提供的第四周D組未出現凋亡細胞400X ；
[0071]圖22是本發明實施例提供的第二周A組出現大量DNA氧化損傷的骨髓造血細胞400 X ；
[0072]圖23是本發明實施例提供的第二周B組見少量DNA氧化損傷的骨髓造血細胞400 X ；
[0073]圖24是本發明實施例提供的第二周C組未見DNA氧化損傷的骨髓造血細胞400 X ；
[0074]圖25是本發明實施例提供的第二周D組見少量DNA氧化損傷的骨髓造血細胞400 X ；
[0075]圖26是本發明實施例提供的第四周A組出現大量DNA氧化損傷的骨髓造血細胞400 X ；
[0076]圖27是本發明實施例提供的第四周B組見少量DNA氧化損傷的骨髓造血細胞400 X ；
[0077]圖28是本發明實施例提供的第四周C組未見DNA氧化損傷的骨髓造血細胞400 X ；
[0078]圖29是本發明實施例提供的第四周D組見少量DNA氧化損傷的骨髓造血細胞400 X。
【具體實施方式】
[0079]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0080]圖1示出了本發明提供的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法的流程。為了便於說明，僅僅示出了與本發明相關的部分。
[0081]下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。
[0082]1.0材料與方法
[0083]1.1實驗材料
[0084]1.1.1實驗動物成年健康日本大耳白兔40隻，雌雄不限,體重2.5±0.5kg,標準飲食，單籠餵養。由北京富豪動物養殖中心提供，該動物已獲國家醫學實驗學會頒發的合格證書。(合格證編號:20090137)
[0085]1.1.2實驗儀器日立H-700H電鏡(日本產)，瑞典LKB2800型超薄切片機(瑞典產)，恆溫槽(中國重慶銀沙試驗儀器有限公司)高速臺式離心機(上海精宏試驗設備有限公司)，超低溫冰箱(日本三洋)，石蠟包埋機(上海LEICA有限公司)，切片機(上海LEICA有限公司)展片機(天津久聖醫療電子儀器有限公司)，烤片機(天津久聖醫療電子儀器有限公司)，JD801圖象分析系統(江蘇捷訊公司)，MILIP0RE超純水儀，OLYMPUS顯微鏡。以上設備由內蒙古醫學院分子生物學研究中心及電鏡中心提供。
[0086]1.1.3主要試劑大腸桿菌內毒素(中國藥品生物製品檢定所提供)，甲基強的松龍(法瑪西亞普強公司比利時)，單克隆抗體N45.1DNA氧化損傷檢測試劑盒(日本產，Sigma-Aldrich公司)、TUNEL凋亡檢測試劑盒(武漢博士德公司)。HE染色、乙二胺四乙酸脫鈣液等常規試劑由內蒙古醫學院分子生物學研究中心提供。
[0087]1.2實驗方法
[0088]1.2.1實驗分組及動物模型的建立
[0089]採用隨機數字表法，將實驗動物隨機分成四組。A組:10隻，為模型組，靜脈內注射大腸桿菌內毒素，共兩次，每次IOOiig / kg，間隔24h。在第2次注射完大腸桿菌內毒素後隨即肌肉注射甲基強的松龍，共3次，每次20mg / kg,間隔24h。B組:10隻為對照組，靜脈注射大腸桿菌內毒素，共兩次，每次IOOyg / kg，間隔24h。在第2次注射完大腸桿菌內毒素後隨即肌肉注射生理鹽水，共3次，每次20mg/kg，間隔24h。C組:10隻，為對照組，靜脈注射生理鹽水，共兩次，每次IOOyg / kg，間隔24h。在第2次注射完生理鹽水後隨即肌肉注射甲基強的松龍，共3次，每次20mg / kg，間隔24h。D組:10隻，為對照組，靜脈注射生理鹽水，共兩次，每次IOOyg / kg，間隔24h。在第2次注射完生理鹽水後隨即肌肉注射生理鹽水，共3次，每次20mg/kg，間隔24h。將動物在最後一次注射後分別於第二、第四周空氣栓塞法處死動物，每次每組5隻，在相對無菌的條件下取雙側股骨頭。
[0090]1.2.2標本製作[0091]兩次所取股骨頭，一側用5%戊二醛溶液固定，另一側用10%甲醛溶液固定，固定時間為一周，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣45天，常規石蠟包埋。
[0092]1.2.3光鏡下組織形態學觀察取石蠟包埋組織塊，製成厚4um切片，HE染色:A、二甲苯 I5min ;B、二甲苯 II5min ；C>95% 乙醇 I3min ；D>95% 乙醇 II3min ；E>80% 乙醇 lmin ；
F、蒸餾水lmin ;G、蘇木精液染色IOmin ;H、流水稍洗去蘇木精液3s ;1、1%鹽酸乙醇3s ;J、稍水洗30s ;K、促藍液返藍30s ;L、流水衝洗15min ;M、蒸餾水過洗2s ;N、0.5%曙紅液染色3min ;0、蒸懼水稍洗 2s ；P>80% 乙醇稍洗 2s ；Q>95% 乙醇 I5min ；R>95% 乙醇 II5min ;S、無水乙醇 5min ;T、無水乙醇 5min ;U、二甲苯 I5min ;V、二甲苯 II5min ;W、二甲苯 III5min ;X、中性樹膠封固。將上述切片分別置於OLYMPUS顯微鏡100倍及400倍光鏡下觀察組織病理學改變。骨細胞壞死病理變化用空缺骨陷窩百分數表示，即在100倍放大倍率下，任選5個高倍鏡視野，每個視野計數50個骨陷窩，分別數出空缺骨陷窩數，求出空缺骨陷窩所佔的百分數。激素性股骨頭壞死判定標準:股骨頭軟骨下區空缺骨陷窩率作為激素性股骨頭壞死的組織學判定指標已被廣泛採用。正常成年家兔股骨頭軟骨下區空缺骨陷窩率為8% _12%，同等製片條件下股骨頭軟骨下空缺骨陷窩率超過此數目即提示骨壞死。
[0093]1.2.4透射電子顯微鏡觀察取5%戊二醛固定的股骨頭組織，於股骨頭軟骨下0.2-0.3cm切取1_X ImmX Imm大小骨塊，5%硝酸脫I丐2_3h, I %四氧化鋨後固定Ih,梯度酒精脫水，EP0N812(環氧樹脂)包埋，包埋劑與無水乙醇分別以1:1、2:1、3:1濃度混合逐層置換無水乙醇，包埋，37°C恆溫箱24h浸透，60°C烤箱聚合48h，瑞典LKB2800型超薄切片機製備50nm超薄切片，染色(醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙染色)。將上述超薄切片置於日立H-700H電子顯微鏡下觀察。
[0094]1.2.5 TUNEL法檢測骨細胞凋亡情況細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然後大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下,在核小體單位之間被隨機切斷，形成180-200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3』 -OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下，將脫氧核糖核苷酸和螢光素、過氧化物酶、鹼性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3』-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，此方法為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)。由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3』 -OH形成，很少能夠被染色。
[0095]試劑組成:A、磷酸緩衝液PBS(pH7.4) ;B、蛋白酶 K(200 y g / ml, pH7.4) ;C、含2% H2O2的PBS緩衝液(pH7.4) ;D、TdT酶緩衝液(新鮮配);E、TdT酶反應液；F、洗滌與終止反應緩衝液；G、0.05%二氨基聯苯(DAB)溶液；H、0.5%甲基綠(pH4.0) ;1、100%丁醇，100%、95%、90%、80%和70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸；J、過氧化物酶標記的抗地高辛抗體(ONCOR)。實驗步驟:A、標本預處理:將製備好的石蠟組織切片置於染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次,每次3min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液(20ug / ml),於室溫水解15min,去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，B、色缸中加入含2%過氧化氫的PBS，於室溫反應5min。用PBS洗兩次,每次5min。C、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多餘液體,立即在切片上加2滴TdT酶緩衝液，置室溫I?5min。D、用濾紙小心吸去切片周圍的多餘液體，立即在切片上滴加54iU TdT酶反應液，置溼盒中於37°C反應I小時。E、將切片置於染色缸中，加入已預熱到37°C的洗滌與終止反應緩衝液，於37°C保溫30min，每IOmin將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。F、組織切片用PBS洗3次，每次5min後，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，於溼盒中室溫反應30min。G、用PBS洗4次，每次5min。H、在組織切片上直接滴加新鮮配製的0.05% DAB溶液，室溫顯色6min。1、用蒸餾水洗4次，前3次每次lmin，最後I次5min。J、於室溫用甲基綠進行復染lOmin。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最後I次靜置30s。依同樣方法再用100%正丁醇洗三次。K、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、乾燥後，OLYMPUS顯微鏡下觀察並記錄實驗結果。TUNEL染色陽性細胞著色定於胞核內，呈棕褐色或棕黃色，少數胞漿內出現陽性顆粒。每張切片隨機選5個高倍鏡視野，每個區域計數50個骨細胞，計算凋亡細胞指數(凋亡細胞數/視野中細胞總數)。
[0096]1.2.6單克隆抗體N45.1免疫組織化學法檢測骨髓造血細胞DNA氧化損傷
[0097]原理:氧化性DNA損傷在生物體細胞老化、死亡的發生過程中起重要作用，自由基一直被認為是引起DNA損傷的主要因素之一。羥自由基和超氧陰離子能直接與DNA分子反應，導致DNA鏈斷裂、鹼基修飾和DNA蛋白交聯等氧化性DNA損傷，其中最主要的致突變性損傷反應是C-8上鳥嘌呤與胸腺嘧啶鹼基顛換性突變，產生8-羥基脫氧鳥苷(8-0HdG)，單克隆抗體N45.1能夠與8-羥基脫氧烏苷特異性結合。A、切片置於0.3% H2O2中37°C下孵育30min ;B、0.1 %胰蛋白酶消化15min ;C、加入單克隆抗體N45.1 一滴，37°C下孵育2h ;D、DAB 顯色 5min ;E、HE 復染。
[0098]1.2.7統計學處理數據均以X ± S表示，用Spssl3.0軟體進行統計分析，空缺骨陷窩率、骨髓造血細胞DNA氧化損傷率、骨細胞凋亡指數的統計檢驗採用方差分析(ANOVA)，多個樣本均數的兩兩比較採用LSD檢驗。A組的空缺骨陷窩率與細胞凋亡率採用線性相關，-1 ^ r ^ +1表 示兩個變量呈直線相關關係，r為正數表示正相關，r為負數表示負相關。P〈0.05有統計學意義。
[0099]2 結果
[0100]2.1組織形態學觀察四個組的股骨頭肉眼觀察大體形態無明顯差異。
[0101]2.1.1光鏡改變
[0102]第二周時，A組:股骨頭病理切片上出現骨壞死，壞死區域主要集中於軟骨下，可見骨小梁稀疏、變細，結構紊亂，造血細胞數量減少；空缺骨陷窩增加；骨髓內脂肪細胞體積增大，有的融合成泡狀(附圖2)。B組:股骨頭病理切片觀察見骨小梁完整，排列整齊，緻密飽滿，骨小梁中骨細胞清晰可見，核大，位於中央；骨髓造血細胞豐富，脂肪細胞相對較少，形態正常(附圖3)。C組:股骨頭病理切片中未見出現骨壞死，光鏡下小梁完整，排列整齊，骨小梁中骨細胞清晰可見(附圖4)。D組:股骨頭病理切片觀察見骨小梁完整，排列整齊，緻密飽滿，骨小梁中骨細胞清晰可見，核大，位於中央；骨髓造血細胞豐富，脂肪細胞相對正常，形態正常(附圖5)。第四周時，A組:股骨頭病理切片上出現典型的骨壞死，可見骨小梁稀疏、變細，甚至斷裂，結構紊亂，有碎片出現；造血細胞數量減少；成骨細胞排列不規則；空缺骨陷窩明顯增加；骨髓內脂肪細胞體積增大，有的融合成泡狀(附圖6)。B組:股骨頭病理切片觀察見骨小梁完整，排列整齊，緻密飽滿，骨小梁中骨細胞清晰可見，核大，位於中央；骨髓造血細胞豐富，脂肪細胞相對較少，形態正常(附圖7)。C組:股骨頭病理切片中未見出現骨壞死，光鏡下骨小梁完整，排列整齊(附圖8)。D組:股骨頭病理切片觀察見骨小梁完整，排列整齊，緻密飽滿，骨小梁中骨細胞清晰可見，核大，位於中央；骨髓造血細胞豐富，形態正常(附圖9)。第二周、第四周時各組平均空缺骨陷窩率見表1。
[0103]表1第二周、第四周時各組平均空缺骨陷窩率)
[0104]
【權利要求】
1.一種造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，該實驗方法包括以下步驟: 步驟一、實驗分組及動物模型的建立； 步驟二、標本製作； 步驟三、光鏡下組織形態學觀察； 步驟四、透射電子顯微鏡觀察； 步驟五、TUNEL法檢測骨細胞凋亡情況； 步驟六、單克隆抗體N45.1免疫組織化學法檢測骨髓造血細胞DNA氧化損傷； 步驟七、統計學處理。
2.如權利要求1所述的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，實驗分組及動物模型的建立的具體方法如下: 採用隨機數字表法，將實驗動物隨機分成A、B、C、D四組； A組:10隻，為模型組 ，靜脈內注射大腸桿菌內毒素，共兩次，每次IOOyg / kg，間隔24h，在第2次注射完大腸桿菌內毒素後隨即肌肉注射甲基強的松龍，共3次，每次20mg /kg,間隔 24h ； B組:10隻，為對照組，靜脈注射大腸桿菌內毒素，共兩次，每次IOOyg / kg，間隔24h，在第2次注射完大腸桿菌內毒素後隨即肌肉注射生理鹽水，共3次，每次20mg / kg，間隔24h ； C組:10隻，為對照組，靜脈注射生理鹽水，共兩次，每次100 yg / kg，間隔24h，在第2次注射完生理鹽水後隨即肌肉注射甲基強的松龍，共3次，每次20mg / kg，間隔24h; D組:10隻，為對照組，靜脈注射生理鹽水，共兩次，每次100 yg / kg，間隔24h，在第2次注射完生理鹽水後隨即肌肉注射生理鹽水，共3次，每次20mg / kg，間隔24h; 將動物在最後一次注射後分別於第二、第四周空氣栓塞法處死動物，每次每組5隻，在相對無菌的條件下取雙側股骨頭。
3.如權利要求2所述的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，實驗動物為成年健康日本大耳白兔40隻，雌雄不限，體重2.5±0.5kg，標準飲食，單籠餵養。
4.如權利要求1所述的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，標本製作的方法如下: 兩次所取股骨頭，一側用5%戊二醛溶液固定，另一側用10%甲醛溶液固定，固定時間為一周，15%乙二胺四乙酸即EDTA脫鈣45天，常規石蠟包埋。
5.如權利要求1所述的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，光鏡下組織形態學觀察的方法為: (I)取石蠟包埋組織塊，製成厚4um切片，HE染色:A、二甲苯I5min ;B、二甲苯II5min ；C、95%乙醇I3min ;D、95%乙醇II3min ;E、80%乙醇Imin ;F、蒸餾水Imin ;G、蘇木精液染色IOmin ;H、流水稍洗去蘇木精液3s ;1、1%鹽酸乙醇3s ;J、稍水洗30s ;K、促藍液返藍30s ;L、流水衝洗15min ;M、蒸餾水過洗2s ;N、0.5%曙紅液染色3min ;0、蒸餾水稍洗2s ;P、80%乙醇稍洗2s ；Q>95%乙醇I5min ；R>95%乙醇II5min ;S、無水乙醇5min ;T、無水乙醇5min ；U>二甲苯I5min ;V、二甲苯II5min ;W、二甲苯III5min ;X、中性樹膠封固；(2)將(I)切片分別置於OLYMPUS顯微鏡100倍及400倍光鏡下觀察組織病理學改變。
6.如權利要求5所述的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，骨細胞壞死病理變化用空缺骨陷窩百分數表示，即在100倍放大倍率下，任選5個高倍鏡視野，每個視野計數50個骨陷窩，分別數出空缺骨陷窩數，求出空缺骨陷窩所佔的百分數；激素性股骨頭壞死判定標準:股骨頭軟骨下區空缺骨陷窩率作為激素性股骨頭壞死的組織學判定指標，正常成年家兔股骨頭軟骨下區空缺骨陷窩率為8% _12%，同等製片條件下股骨頭軟骨下空缺骨陷窩率超過8% -12%即提示骨壞死。
7.如權利要求1所述的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，透射電子顯微鏡觀察的方法如下: 取5%戍二醒固定的股骨頭組織，於股骨頭軟骨下0.2-0.3cm切取ImmX ImmX Imm大小骨塊，5 %硝酸脫鈣2-3h，I %四氧化鋨後固定lh，梯度酒精脫水，環氧樹脂包埋，包埋劑與無水乙醇分別以1:1、2:1、3:1濃度混合逐層置換無水乙醇，包埋，37°C恆溫箱24h浸透，60°C烤箱聚合48h，超薄切片機製備50nm超薄切片，染色即醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙染色；將超薄切片置於電子顯微鏡下觀察。
8.如權利要求1所述的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，TUNEL法檢測骨細胞凋亡情況的方法為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法； 試劑組成:A、磷酸緩衝液PBS pH7.4 ;B、蛋白酶K200i! g / ml，pH7.4 ;C、含2% H2O2的PBS緩衝液pH7.4 ;D、TdT酶緩衝液；E、TdT酶反應液；F、洗滌與終止反應緩衝液；G、0.05%二氨基聯苯溶液；H、0.5% 甲基綠 pH4.0 ;1、100%丁醇，100%、95%、90%、80%和 70 % 乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸；J、過氧化物酶標記的抗地高辛抗體； 缺口末端標記法實驗步驟:A、標本預處理:將製備好的石蠟組織切片置於染色缸中，用二甲苯洗兩次,每次5min,用無水乙醇洗兩次,每次3min,用95%和75%乙醇各洗一次，每次3min,用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液20ug / ml,於室溫水解15min,去除組織蛋白；用蒸餾水洗4次，每次2min ;B、色缸中加入含2%過氧化氫的PBS，於室溫反應5min，用PBS洗兩次，每次5min ;C、用濾紙吸去載玻片上組織周圍的液體，在切片上加2滴TdT酶緩衝液，置室溫I~5min ;D、用濾紙小心吸去切片周圍的液體，在切片上滴加54iilTdT酶反應液，置溼盒中於37°C反應I小時；E、將切片置於染色缸中，加入已預熱到37°C的洗滌與終止反應緩衝液，於37°C保溫30min,每IOmin將載玻片提起和放下一次,使液體攪動；F、組織切片用PBS洗3次，每次5min後，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，於溼盒中室溫反應30min ;G、用PBS洗4次，每次5min ;H、在組織切片上直接滴加新鮮配製的0.05% DAB溶液，室溫顯色6min ;1、用蒸餾水洗4次，前3次每次lmin，最後I次5min ;J、於室溫用甲基綠進行復染lOmin，用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最後I次靜置30s ;依同樣方法再用100%正丁醇洗三次；K、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、乾燥後，OLYMPUS顯微鏡下觀察並記錄實驗結果；每張切片隨機選5個高倍鏡視野，每個區域計數50個骨細胞，計算凋亡細胞指數即凋亡細胞數/視野中細胞總數。
9.如權利要求1所述的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，單克隆抗體N45.1免疫組織化學法檢測骨髓造血細胞DNA氧化損傷的方法如下:A、切片置於0.3% H2O2中37°C下孵育30min ； B、0.1 %胰蛋白酶消化15min ； C、加入單克隆抗體N45.1 一滴，37°C下孵育2h ； D、DAB顯色 5min ； E、HE復染。
10.如權利要求1所述的造血細胞DNA氧化損傷與骨細胞凋亡在缺血壞死中作用的實驗方法，其特徵在於，統計學處理的方法如下: 數據均以X ± S表示，用Spssl3.0軟體進行統計分析，空缺骨陷窩率、骨髓造血細胞DNA氧化損傷率、骨細胞凋亡指數的統計檢驗採用方差分析，多個樣本均數的兩兩比較採用LSD檢驗。
【文檔編號】G01N33/50GK103675250SQ201310653567
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】劉萬林, 趙振群, 白銳, 王文選, 王勇 申請人:劉萬林