具有改進的細胞免疫原性的抗病毒疫苗的製作方法

2023-06-08 06:02:46 2

專利名稱：具有改進的細胞免疫原性的抗病毒疫苗的製作方法
技術領域：
本發明提供用於治療或預防病毒感染的組合物、方法及試劑盒。本文所述的多價 (例如二價)疫苗併入了計算優化的病毒多肽，其可增加接種對象的細胞免疫應答的多樣性或廣度和深度。
背景技術：
引起針對病毒的細胞免疫應答的疫苗必須反映全球的病毒多樣性，以便有效地治療或預防病毒感染。例如，強烈而多樣的HIV-I特異性T細胞應答的啟動可能對於有效的 HIV-I疫苗至關重要。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答與人類緩慢的疾病進程相關，在非人靈長類動物接種模型中，CTL應答的重要性已得到很好的確證。由於高度易變的包膜(Env) 是中和針對HIV的抗體的主要靶點，並且疫苗抗原也需要進行調整以引起這些抗體應答， T細胞疫苗組分能夠靶向作用於更加保守的蛋白以引發更可能是交叉反應的應答。但是即使是最保守的HIV-I蛋白也足夠多樣以至於變異將成為問題。人工中央序列疫苗法，如共有和始祖HIV-I序列，基本上能「分開」株系間的差異，與天然病毒株疫苗相比，能夠刺激具有增強的交叉反應的應答。共有抗原代表合成的抗原序列，其為所有流行株(circulating strain)中唯一最好的「平均水平」。雖然這些抗原能夠引起直接的細胞免疫應答，但是在先前的疫苗策略中，這些應答的廣度和強度未得到大幅度的提高。用於治療或預防病毒感染的下一代疫苗的開發必須引起細胞免疫廣度的增長，以使接種結果成功。在治療或預防HIV-I時，對這類疫苗的需求是尤為緊急的。發明概述第一個方面，本發明的特徵在於一種用於治療或降低哺乳動物如人類的病毒感染風險的疫苗，其包括至少兩個不同的優化病毒多肽(如2、3、4、5或多個不同的優化病毒多肽)，其中所述優化病毒多肽與相同的病毒基因產物相對應。在一個實施方式中，病毒感染由逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒、或多瘤病毒引起。在其它實施方式中，逆轉錄病毒是1型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)，並且病毒基因產物包括feig、Pol、Env, Nef、Tat、Rev、 Vif、Vpr或Vpu。在另一個實施方式中，疫苗包括僅兩個(no more than two) % Gag,Pol, EnV、Nef Jat、ReV、Vif、Vpr或Vpu病毒基因產物之一相對應的優化病毒多肽。在另一個實施方式中，疫苗不包括與Gag和Nef相對應的優化病毒多肽。在又一個實施方式中，疫苗包括至少兩個對於選自feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu的第一個病毒基因產物的不同的優化病毒多肽(例如2、3、4、5或多個不同的優化病毒多肽)，以及包括一個或多個對於與選自feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu的第一個病毒基因產物不同的第二個病毒基因產物的不同的優化病毒多肽(例如2、3、4、5或多個不同的優化病毒多肽)。第二個方面，本發明的特徵在於一種用於治療或降低哺乳動物如人類1型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)感染風險的疫苗，其包括具有至少7個連續胺基酸(如，長度為至少 8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50，100， 150，175，200，250，300，350，400，450，500或更多的連續胺基酸)的優化病毒多肽，該胺基酸與SEQ IDNOS 1-29所描述的序列中的任意一個具有至少85 %的胺基酸序列同一性 (identity)。在一個實施方式中，優化病毒多肽具有至少7個連續的胺基酸(如，長度為至少 8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50，100， 150,175, 200, 250, 300, 350,400,450, 500或更多的連續胺基酸)，該些胺基酸與SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個具有胺基酸序列同一性。在另一個實施方式中，優化病毒多肽具有SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個的胺基酸序列。在又一個實施方式中，疫苗包括至少兩個優化病毒多肽，其選自組a)-k)中的任意一個或多個a) SEQ ID NOS :1 和 2 ;b)SEQ ID NOS :3、4和 5 ;c)SEQ IDNOS :6 和 7 ;d)SEQ ID NOS :8-12 ;e)SEQ ID NOS 13、14 禾口 15 ;f)SEQ IDNOS 16、17 禾口 18 ;g)SEQ ID NOS :19 和 20 ;h)SEQ ID NOS :21、 22 和 23 ;i) SEQ ID NOS :24 和 25 ;j) SEQ ID NOS :26 和 27 ;k) SEQ IDNOS :21_22。在另一個實施方式中，疫苗可包括一對選自上組a)-k)中任意一個的優化病毒多肽，以及一個或多個來自相同或不同的組a)-k)的不同的優化病毒多肽。在其它實施方式中，疫苗可包括至少三個或四個或多個優化病毒多肽，其來自組a) -k)中的一個或多個。第三個方面，本發明的特徵在於一種用於治療或降低哺乳動物如人類的病毒感染風險的疫苗，其包括至少兩對不同的優化病毒多肽，其中每一對優化病毒多肽與相同的病毒基因產物相對應，並且其中僅僅兩個(no more than two)已併入疫苗的優化病毒多肽與相同的病毒基因產物相對應。在一個實施方式中，疫苗包括至少三對不同的優化病毒多肽。 在另一個實施方式中，疫苗包括至少四對不同的優化病毒多肽。在一個實施方式中，病毒感染由逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、 沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒、或多瘤病毒引起。在其它實施方式中，逆轉錄病毒是1型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)，並且病毒基因產物包括fetg、P0l、Env、Nef、Tat、Rev、 Vif、Vpr或Vpu。在又一個實施方式中，疫苗僅包括兩個與病毒基因產物&^、？0^1^、徹廠 Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu之一相對應的優化病毒多肽。在另一個實施方式中，疫苗不包括與Gag和Nef相對應的優化病毒多肽。在又一個實施方式中，疫苗包括至少三對與病毒基因產物feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu中的任意三個相對應的不同的優化病毒多肽。在另一個實施方式中，疫苗包括至少四對與病毒基因產物fetg、Pol、Env、Nef、Tat、 Rev、Vif、Vpr或Vpu中的任意四個相對應的不同的優化病毒多肽。在本發明前三個方面中任意一個方面的實施方式中，疫苗引起針對病毒基因產物的細胞免疫應答。在另一個實施方式中，疫苗引起針對HIV-I的細胞免疫應答。在又一個實施方式中，至少一個不同的優化病毒多肽的核苷酸序列由核酸或載體編碼。在一個實施方式中，載體為重組腺病毒，如血清26型腺病毒(Ad26)、血清34型腺病毒(Ad34)、血清35 型腺病毒(Ad3Q、血清48型腺病毒(Ad48)或血清5HVR48型腺病毒(Ad5HVR48)。在又一個實施方式中，疫苗與藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑結合。第四個方面，本發明的特徵在於一種包括優化病毒多肽的核苷酸序列的核苷酸， 該優化病毒多肽具有至少7個連續的胺基酸(如，長度為至少8，9，10，11，12，13，14，15，16， 17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50，100，150，175，200，250，300，350，400， 450，500或更多的連續胺基酸)，該核苷酸序列與SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個具有至少85%的胺基酸序列同一性。在一個實施方式中，優化病毒多肽具有至少7個連續的胺基酸(如，長度為至少 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24， 25,26,27,28,29,30,50,100，150，175，200，250，300，350，400，450，500 或更多的連續胺基酸)，該優化病毒多肽與SEQ IDNOS 1-29所描述的胺基酸序列中的任意一個具有序列同一性。在另一個實施方式中，優化病毒多肽具有SEQ ID NOS :1- 所描述的胺基酸序列中的任意一個。在又一個實施方式中，核酸包括載體。在一個實施方式中，載體為重組腺病毒， 如血清沈型腺病毒(Ad26)、血清34型腺病毒(Ad34)、血清35型腺病毒(Ad3Q、血清48型腺病毒(Ad48)或血清5HVR48型腺病毒(Ad5HVR48)。第五個方面，本發明的特徵在於一種優化病毒多肽，其具有至少7個連續的胺基酸(如，長度為至少 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27， 28，29，30，50，100，150，175，200，250，300，350，400，450，500 或更多的連續胺基酸)，該優化病毒多肽與SEQ ID NOS :1- 所描述的胺基酸序列中的任意一個具有至少85%的胺基酸序列同一性。在一個實施方式中，優化病毒多肽具有至少7個連續的胺基酸(如，長度為至少 8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50， 100，150，175，200，250，300，350，400，450，500或更多的連續胺基酸)，該優化病毒多肽的序列與SEQ ID NOS :1- 所描述的胺基酸序列中的任意一個完全一致。在另一個實施方式中，優化病毒多肽具有SEQID NOS 1-29所描述的胺基酸序列中的任意一個。第六個方面，本發明的特徵在於通過給予本發明所述的疫苗或核酸，治療或降低哺乳動物如人類的病毒感染風險的方法。在一個實施方式中，病毒感染由逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒或多瘤病毒引起。在又一個實施方式中，逆轉錄病毒是1型人類免疫缺
一個實施方式中，疫苗或核酸引起針對病毒基因產物的細胞免疫應答。第七個方面，本發明的特徵在於通過合成本發明所述的疫苗，製備用於治療或降低哺乳動物如人類的病毒感染風險的疫苗的方法。第八個方面，本發明的特徵在於通過將本發明的核酸與細胞接觸並分離出優化病毒多肽，製備用於治療或降低哺乳動物如人類的病毒感染風險的疫苗的方法。在本發明的第七個或第八個方面的實施方式中，優化病毒多肽在給予哺乳動物時引起細胞免疫應答。細胞免疫應答可針對病毒基因產物。在另一個實施方式中，病毒感染由逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、 皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒或多瘤病毒引起。在又一個實施方式中，逆轉錄病毒是 1型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)，並且病毒基因產物包括feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、CN 102282175 A
Vpr 或 Vpu ο第九個方面，本發明的特徵在於一種試劑盒，其包括本發明的疫苗、藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑及其使用說明書。在一個實施方式中，試劑盒還包括佐劑。最後一個方面，本發明的特徵在於一種試劑盒，其包括本發明的核酸，藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑及其使用說明書。在一個實施方式中，試劑盒還包括佐劑。在本發明所有方面的實施方式中，優化病毒多肽由為在人類中表達而優化的核苷酸序列編碼(例如，SEQ ID NOS :5、10、11、12、15、18和23中的任意一個)。定義「優化的病毒多肽」或「計算優化的病毒多肽」指的是一種免疫原性多肽，其不是天然存在的病毒肽、多肽或蛋白。優化病毒多肽序列起初是通過修飾一個或多個天然存在的病毒基因產物(例如肽、多肽和蛋白)的胺基酸序列而生成，以增加哺乳動物(例如人類)免疫(例如，當併入本發明所述的疫苗)後所產生的抗病毒免疫應答(例如，細胞或體液免疫應答)的廣度、強度、深度或壽命。因此，優化病毒多肽可能與「親本」病毒基因序列相對應；可替換地，優化病毒多肽可能不與特定的「親本」病毒基因序列相對應，而可能與病毒的變異株或準種產生的類似物的序列相對應。對優化病毒多肽中包括的病毒基因序列進行的修飾包括胺基酸的添加、替換和刪除。在本發明的一個實施方式中，優化病毒多肽是兩個或多個天然存在的病毒基因產物(例如，天然或臨床的病毒分離物)的複合或融合的胺基酸序列，其中每個潛在的抗原表位(例如，每個連續或重疊的胺基酸序列，其長度為 5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30或多個胺基酸)經分析和修飾，以提高所生成的優化病毒多肽的免疫原性。與不同病毒基因產物相對應的優化病毒多肽也可融合以促進其併入本發明的疫苗。生成優化病毒多肽的方法在，例如，Fisher等「全球性HIV-I變體中潛在T細胞表位的最佳覆蓋率的多價疫苗(Polyvalent Vaccine for Optimal Coverage of Potential T-CeIl Epitopes in Global HIV-I Variants) 」Nat. Med. 13 (1) :100-106(2007)以及國際專利申請公開文本TO 2007/024941中所描述，此處以引用方式併入。一旦生成了優化病毒多肽序列，可通過標準技術生產或管理相對應的多肽(例如，重組病毒載體，如國際專利申請公開WO 2006/040330和W02007/104792所公開的腺病毒載體，此處以引用方式併入)。「藥學上可接受的載體」指的是接受治療的哺乳動物在生理上可接受的、並且保留與其共同給予的化合物的治療性質的載體。典型的藥學上可接受的載體為生理鹽水。其它生理上可接受的載體及其配方對於本領域技術人員是已知的，並且在例如Remington』 s Pharmaceutical Sciences (18thedition,ed. A. Gennaro,1990,Mack Publishing Company, Easton, PA)中描述，此處以引用方式併入。「載體」指的是DNA構建體，其包含可操作的連接到下遊基因或編碼區域(例如， 編碼多肽或多肽片段的cDNA或基因組DNA片段)的啟動子。在受體細胞(例如原核或真核細胞，如細菌、酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞，取決於表達載體中的啟動子)或生物體 (包括，例如人類)中導入載體後，細胞能夠表達載體編碼的mRNA，之後其翻譯為本發明所述的編碼的優化病毒多肽。體外轉錄/翻譯的載體在本領域是熟知的，並在此處作進一步描述。載體可能是基因工程質粒，病毒或衍生自例如噬菌體、腺病毒、逆轉錄病毒、痘病毒或皰疹病毒的人工染色體。
「病毒基因產物」指的是任何天然存在的病毒肽、多肽、或蛋白、或其片段。在本發明的一個實施方式中，病毒基因產物衍生自1型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)。HIV-I病毒基因產物包括 Gag、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr 和 Vpu 多肽。


圖1為說明針對恆河猴中的全球潛在T細胞表位(PTE)肽，計算優化的HIV-lGag、 Pol和Env病毒多肽的擴大的廣度的圖表。用優化病毒多肽(藍色)免疫的動物以最大數量與記憶肽池反應。圖2為顯示計算修飾的HlV-lfeig、Pol和Env病毒多肽擴大了表位特異性細胞免疫應答的廣度的圖表。圖3說明在用來自本發明的計算修飾的病毒多肽的HIV-I病毒基因產物feg、P0l 和Env進行免疫後的恆河獼猴以及接種共有HIV-I抗原或者HIV-I進化支C分離抗原的動物中檢測到的細胞免疫應答的廣度。用優化病毒多肽(藍色)免疫的動物以最大數量與記憶肽池反應。由於動物是遠交種，池在動物與動物之間不同。kg、Pol和Env各自引起多種細胞免疫應答，並可以共享反應模式。圖4A-4C為顯示用病毒多肽(Pol (圖4A)、Gag (圖4B)和Env (圖4C))測試的不同疫苗(二價鑲嵌序列(Mos2)、M共有序列(Mcon)和優化的進化支C (OptC))之間共享的潛在表位的圖表。圖4A-C顯示不同疫苗候選物對目前HIV資料庫全長基因組和PTE肽的
相對覆蓋率。圖5為一圖表，其顯示PTE肽與二價鑲嵌(Mos2)疫苗的反應數量(認為每個應答是一個獨立事件，不論重疊與否)大於與M組共有(Mcon)疫苗和天然病毒株疫苗(優化的進化支C(天然C(最佳)))的反應數量，已選擇該天然病毒株疫苗以產生M組集合(OptC) 疫苗抗原的最佳覆蓋率。圖5顯示蛋白、⑶8+T細胞和⑶4+T細胞在每隻動物中的PTE肽應答數量。統計學上，Mos2 > Mcon OptC (Mcon顯示比OptC更多的應答的趨勢)。Mos2 與 Mcon 相比的 Wilcoxon ρ 值ρ 值=0. 001058。圖6為一圖表，其顯示引發T細胞應答的PTE肽的數量。二價鑲嵌(Mos2)疫苗中的中位數為16(範圍12- )的PTE肽引發CD8+T細胞內的應答，而中位數僅為6 (範圍 0-7)的Mcon肽和OptC肽中的中位數僅為3 (範圍；0-3)的肽引發CD8+T細胞內的應答。 二價鑲嵌(Mos2)疫苗中的中位數為4(範圍2-6)的PTE肽觸發CD4+T細胞內的應答，而中位數僅為1(範圍0-2)的Mcon肽和OptC肽中的中位數僅為0.5(範圍0_2)的肽觸發 CD4+T細胞內的應答。因此，應答的趨勢是Mos2 > Mcon > OptC。圖7為一示意圖，總結了由每隻被研究動物的T細胞識別的所有CD8+T細胞Gag PTE肽的圖譜(見下面的實施例幻。動物編號，肽池和肽編號標記每個活性肽的邊界。組用符號表示*，Mos2 ;￥，ConM; 士，OptC。此處Gag作為實施例被包括。即使動物是遠交種， CD8應答仍傾向於聚類。鑲嵌疫苗與單價疫苗相比具有潛在的優勢。鑲嵌型(mosaic，嵌合體)有更好的機會刺激應答，其與更普通的變體相作用。鑲嵌型還刺激針對在混合物中存在的不同形式的多重應答。因此，鑲嵌型有阻斷普通逃逸途徑的潛力。在我們的研究中，鑲嵌疫苗傾向於刺激T細胞應答，識別更多重疊肽。有許多活性肽定位的熱點。設計PTE肽以使用於評估疫苗的肽試劑中的HIV-IM組的潛在表位(或9個胺基酸連續段的九聚體)的覆蓋率最大化。不可避免地，在PTE肽中有許多重疊，但是由於算法，重疊通常是與某些變異的重疊。圖7公開了 SEQ ID N0:42。圖8為一示意圖，總結了由每隻被研究動物的T細胞識別的⑶4+T細胞(iag PTE 肽的圖譜(mapping)。圖 8 公開了 SEQ ID NO :43。圖9為一圖表，其描述了針對ConM疫苗或最佳天然疫苗的PTE應答的典型模式， 比對了引起應答的肽和疫苗相關區域的肽。疫苗和目標PTE肽之間的具有同一性的穩定肽段的良好匹配對於實現對這些疫苗的反應是必要的。圖9桉出現順序分別公開了 SEQ ID NOS 44-57。圖10為一圖表，其說明了鑲嵌疫苗產生多個應答，識別具有不明顯抗原性競爭和具有寬泛局部應答的多個變異重疊肽。尤其識別四個易變(variable)的PTE肽。此外，在重疊區域，兩個鑲嵌形式以及兩者的結合均被識別。最後，新形式( 被識別。圖10桉出現順序分別公開了 SEQ ID NOS 58-63。圖11為一圖表，其說明了在鑲嵌疫苗接種的動物中(361-07)⑶8+PTE肽應答的典型模式。測試了 22個PTE肽並確定了 8個CD8應答區域；5個區域包括與在一個或另一個鑲嵌序列(mosaic)中的胺基酸匹配的易變的肽。確定了 5個CD4應答區域。因此，對鑲嵌序列的T細胞應答在給定區域內可見更多易變的肽。這對於CD8T細胞應答似乎尤為真實。 這可能是引發多個T細胞克隆而識別表位變體的結果，而且這可能阻斷合適的逃逸途徑。 不僅有更多的應答，而且它們更深入並且覆蓋了更多的變體。圖11桉出現順序分別公開了如SEQ ID NOS 64-101所描述的⑶8應答。按出現順序分別公開了如SEQ ID NOS 102-117 所描述的⑶4應答。圖12為一圖表，其顯示了重疊的易變PTE肽的數量，該PTE肽貫穿了疫苗引起的 T細胞所靶向的區域。圖13為一圖表，其顯示相對於Mcon和OptC疫苗，2個鑲嵌抗原疫苗產生更多的針對含有一個或多個重疊PTE肽的區域的T細胞應答。圖13與圖5相似，猴子從右至左以相同的順序顯示，但改變其比例以反映對含有一個或多個重疊PTE肽而不是單肽的區域的應
答數量。圖14為一圖表，其顯示在給予動物二價鑲嵌疫苗(Mod)、Mcon疫苗和OptC疫苗後，T細胞應答的數量。二價鑲嵌(Mod)疫苗在CD8+T細胞中引發中位數為8的應答，而 Mcon疫苗和OptC疫苗分別引發中位數僅為3 (範圍0_6)和1.5(範圍0- 個肽的CD8+T 細胞應答。二價鑲嵌(Mod)疫苗在CD4+T細胞中引發中位數為3(範圍2-5)的應答，而 Mcon疫苗和OptC疫苗分別引發中位數僅為1 (範圍0-2)和0. 5 (範圍0_2)的CD4+T細胞應答。因此，應答的趨勢是Mos2 > Mcon > OptC。圖15為一圖表，其顯示鑲嵌疫苗與進化支C(進化枝C)天然疫苗相比能夠引起更多的應答與進化支C天然蛋白交叉反應GAG整合肽(pooled peptide)代表5個蛋白。接種了 M組共有序列或最佳覆蓋率進化支C天然蛋白的動物對來自這些蛋白的肽有0-2個應答，而接種了鑲嵌疫苗的動物能夠應答1-5個肽池。與Mcon或最佳C序列相比，鑲嵌疫苗引起對每個測試蛋白的更多的應答。由鑲嵌疫苗引起的T細胞應答也識別更多的貫穿真實 Gag蛋白的整合肽組。10-12個亞池=IOX十五聚體肽(96ZM Gag除外，其為5X 二十聚體肽)。
圖16為一圖表，其顯示隨著時間的推移，鑲嵌設計對於病毒多肽中的變化穩定 (例如(^ag M)。圖17為一圖表，其顯示利用九聚體優化的覆蓋率在接近(例如，八-十二聚體) 優化長度時穩定(顯示的是kg)。圖18為一圖表，其顯示變異數量的增加使覆蓋率增加，但僅有遞減的恢復 (return)(顯示的是 Gag)。圖19A-19B為顯示錶位特異性T淋巴細胞對PTE肽應答的廣度和幅度的圖表。圖 19A為一圖表，其顯示了在表達鑲嵌序列(藍色)、M共有序列(綠色)、進化支B+進化支 C (紫色)或最佳天然進化支C (紅色)HIV-lfeig、P0l和Env抗原的rAc^6載體的單次免疫後，表位特異性CD4+(頂部)和CD8+(底部)T淋巴細胞對單個PTE肽應答的數量。單個猴子描繪在χ軸上。每種顏色的不同陰影反映了對不同抗原(Gag、Pol、Env)的應答。圖19B 為一圖表，其顯示⑶4+(頂部)和⑶8+(底部)T淋巴細胞應答區域的數量。圖 20A-20C示出一圖解，其顯示定位(mapping)於HIV-IGag(圖 20A) (SEQ ID NO 118)、Pol(圖 20B) (SEQ ID NO :119)禾口 Env (圖 20C) (SEQ ID NO :120)蛋白序列的免疫 4 周后，CD8+T淋巴細胞對PTE肽的應答。顏色表示接受鑲嵌序列(藍色)、M共有序列(綠色)、進化支B+進化支C(紫色)或最佳天然進化支C(紅色)HIV-mag、Pol和Env抗原的猴子。對於每個表位，猴子編號、抗原(G，Gag;P，Pol ；E，Env)、子池編號和單個PTE肽編號均有顯示。圖21A-21C 示出一圖解，其顯示定位於 HIV-I Gag(圖 21A) (SEQ IDNO :121)， Pol(圖 21B) (SEQ ID NO :122)禾口 Env(圖 21C) (SEQ ID NO :123)蛋白序列的免疫 4 周后， CD4+T淋巴細胞對PTE肽的應答。顏色表示接受鑲嵌序列(藍色)、M共有序列(綠色)、進化支B+進化支C (紫色)或最佳天然進化支C (紅色)HIV-mag、Pol和Env抗原的猴子。 對於每個表位，猴子編號、抗原(G，Gag ；P, Pol ；E，Env)、子池編號和單個PTE肽編號均有顯
7J\ ο圖22示出一個圖解，其顯示使用表達鑲嵌序列、M共有序列、進化支B+進化支C或最佳天然進化支C HIV-lGag.Pol和Env抗原的rAc^6載體免疫4周後，所有猴子中具有活性PTE肽的疫苗序列的比對。對於每隻猴子，疫苗序列顯示在頂部，活性PTE肽顯示在由抗原(G，Gag;P，Pol ；Ε,Env)和PTE肽編號表示的疫苗序列下方。最小重疊區域以粗體顯示。 兩個鑲嵌序列或兩個進化支B+進化支C抗原之間的序列多態性顯示為藍色。疫苗序列與活性PTE肽之間的差異顯示為紅色。圖22按出現順序分別公開了 SEQ ID NOS 124-640。可能含有免疫應答表位的肽內最小區域，基於其出現時的活性肽間的重疊，在疫苗中是粗體的。如果沒有重疊肽，我們推測表位可以在肽中的任何位置，因此整個區域是粗體的。我們不能區分肽內部具有不同邊界的不同的T細胞應答靶向表位，或當變體存在時可耐受變異的更多雜亂的克隆T細胞應答；在疫苗免疫應答中兩種情況均是有利的。靶向區域的數量與說明數據所需的T細胞應答的最小數量相對應。疫苗和肽不匹配處的胺基酸寫為紅色；如果它們落入可能帶有表位的區域，它們為粗體紅色。當多個肽重疊時，重疊區域外的胺基酸差異以非粗體紅色標記。疫苗總是在頂部。代表每個蛋白(Gag為G，Pol為P，Envelope為E)的字母和肽編號用來標記每個活性PTE肽。蛋白和HXB2編碼接在每個肽後。
對於鑲嵌序列和進化支B+C疫苗，每個含有2個抗原並且均包括在比對中；疫苗中的胺基酸差異標記為藍色，如果活性肽在第二鑲嵌序列中帶有變異胺基酸，也標記為藍色。 在兩個疫苗抗原具有差異的每個位置，活性肽也標記為粗體，以顯示包括兩個變體的位置可能影響疫苗免疫應答並且使廣度和深度更大。例如，總結的第一個疫苗是進化支B+C疫苗，動物觀7_95是應答被列出的第一隻動物。有3個針對PTE肽的⑶8應答，1個針對⑶4。兩個⑶8肽E^和E282顯示大量的重疊，因此兩者可能是相同CTL應答的靶點；因此我們也注意到僅有2個CD8應答區域，以及1個CD4應答區域。對於每個應答區域，我們寫出每個區域中重疊肽的數量(例如，CD8 12CD4 1)以評估應答的深度；兩個為紅色，表明重疊區域在活性肽中易變。如果疫苗不同， 如第二活性區域中的D/E，則標記為藍色。僅重疊的區域為粗體。E282中的H在兩個疫苗中均未發現，因此標記為紅色；它在重疊區域中因此為粗體。每個活性肽具有其蛋白和相應的HXB2編號，標記在右側。圖23A-23C為圖表，其顯示了從最低到最高排列的所有(iag、Pol和Env特異性 CD8+(圖23A和23B)和CD4+(圖23C) T淋巴細胞應答的幅度。圖24A-C顯示了對PTE肽的表位特異性T淋巴細胞應答的深度。圖24A為一圖解，其顯示在接受了最佳天然進化支C抗原的猴子366中，定位的T淋巴細胞應答的實例。 圖24B為一圖解，其顯示在接受了二價鑲嵌抗原的猴子361中，定位的T淋巴細胞應答的實例。在圖24A禾口 24B中，疫苗序列顯示在頂端(OptC ；Mosl, Mos2)，活性PTE肽顯示在由抗原(G，Gag ；P, Pol ；E, Env)和PTE肽編號表示的疫苗序列的下方。最小重疊區域以粗體顯示。兩個鑲嵌抗原間的序列多態性顯示為藍色。疫苗序列與活性PTE肽之間的差異顯示為紅色。所有由應答區域構成的陽性肽的完整比對均顯示在圖22中。圖24C為一圖表，其顯示了用表達鑲嵌序列、M共有序列、進化支B+進化支C或最佳天然進化支C抗原的rAd26 載體進行免疫後，CD4+(頂部)和CD8+(底部)T淋巴細胞應答的深度。單個猴子描繪在 χ軸上。對於每個表位區域，顯示一個應答變異(淺陰影)或> 1個應答變異(深陰影)。 圖24A按出現順序分別公開了 SEQ ID N0S641-650。圖24B按出現順序分別公開了 SEQ ID NOS 651-685。圖25為一圖表，其顯示了對來自進化支A、B和C的HIV-IGag肽的表位特異性T 淋巴細胞應答的廣度。利用來自下列HIV-IGag株的重疊肽的子池來評估細胞免疫應答的廣度進化支C DU422、進化支C ZM651、共有序列C、共有序列A和共有序列B。用表達鑲嵌序列(藍色)、M共有序列(綠色)、進化支B+進化支C (紫色)或優化天然進化支C (紅色)HlV-lfeg、Pol和Env抗原的rAc^6載體進行單次免疫後，顯示了陽性子池的數量。單個猴子描繪在χ軸上。圖^A-D為圖表，其顯示加強免疫後的細胞和體液免疫應答。顯示了每隻猴子在初免後第4周(每個畫面左側)和加強後第44周(每個畫面右側)單個T淋巴細胞應答的幅度(圖2躺和廣度(圖^B)。在第O周用rAc^6載體對猴子進行初免，並且在第40周用表達鑲嵌序列、M共有序列或最佳天然進化支C HIV-I Gag.Pol和Env抗原的rAd5HVR48載體進行加強。單個猴子描繪在χ軸上。在圖26A中，紅色表示CD8+T淋巴細胞應答，藍色表示 CD4+T淋巴細胞應答，用線條描繪在兩個時間點均觀察到的應答，用點描繪僅在一個時間點觀察到的應答。在圖26B中，每種顏色的不同陰影反映對不同抗原(Gag、Pol、Env)的應答。圖^C為一圖表，其顯示在0、4、44周的Env特異性ELISA終點效價。圖^D為一圖表，其顯示在第44周時對1級進化支A (DJ263. 8)，進化支B (SF162. LS)和進化支C (MW965. 26)病毒的中和抗體(NAb)效價。對鼠白血病病毒的NAb效價作為陰性對照，在所有樣品中<20。圖27為一圖表，其顯示不同的疫苗抗原對PTE肽的理論覆蓋率。顯示了被鑲嵌序列(藍色)、M共有序列(綠色)、進化支B+進化支C (紫色)或優化天然進化支C (紅色) HIV-lGag, Pol和Env抗原所覆蓋的9個胺基酸PTE肽的百分比。發明詳述本發明的特徵在於一種優化的病毒多肽，其是從天然存在的病毒基因產物計算衍生的。使用一個或多個本發明的優化病毒多肽或併入一個或多個本發明的優化病毒多肽的疫苗(例如載體)對對象(例如人類)進行免疫後，本發明所述的優化病毒多肽使病毒特異性免疫(例如，細胞免疫，如基於T細胞的免疫應答)的廣度和深度增高。本發明提供疫苗，其可給予已感染或具有感染病毒感染的風險的對象(例如人類)。本發明所述疫苗併入了至少兩個不同的每個相應的病毒基因產物所代表的優化病毒多肽。發明人發現併入兩個不同優化病毒多肽使疫苗中的覆蓋率和免疫原性表位表現增加，導致在對象接種後，病毒特異性免疫應答總數量增長。本發明還提供了給予和製備用於對象(例如人類)的疫苗、 載體和優化病毒多肽的方法。此處所述的組合物、方法和試劑盒通過提供至少兩個不同的優化病毒多肽，能夠明顯增加病毒特異性細胞免疫應答的多樣性、廣度和/或深度。本發明的優化病毒多肽本發明提供多價(例如二價)疫苗，其併入了對應於並來自天然傳播的病毒基因產物的計算優化(computationally-optimized)的病毒多肽。多價鑲嵌蛋白由天然序列通過計算機上執行的(in silico)重組並優化而裝配得到，以便對於給定的價提供潛在T細胞表位(PTEs)最大化的覆蓋率。鑲嵌抗原為全長蛋白，其設計成保留天然的抗原表達和加工。發明人發現使用對應於並來自單病毒基因產物(即二價疫苗)的兩個不同的優化病毒多肽進行免疫，與傳統的併入來自相同病毒基因產物(例如，基於臨床分離株的序列) 的天然存在的多肽，或來自相同病毒基因產物的天然存在多肽的共有序列的單價或多價疫苗相比，能夠明顯引起更高數量的細胞免疫應答(例如T細胞應答)。因此，關於併入了計算優化(或計算機上優化)的病毒多肽的疫苗，其序列提供流行病毒序列的非稀有短節段最大化的覆蓋率，該疫苗能夠提高免疫應答的廣度和深度。一種遺傳算法用來創建優化病毒多肽組，作為任意一組天然存在的病毒基因產物序列的片段的「鑲嵌」混合物，提供作為輸入數據。該遺傳算法策略使用來自普通病毒群體的未經比對的蛋白序列作為輸入數據組，因此具有「不依賴於比對」的優點。其創建的人工優化病毒多肽類似於在自然界中發現的病毒蛋白，但不是天然存在的。可以調整遺傳算法以根據預期靶點或期望的免疫應答來優化不同長度的病毒多肽。由於大部分T細胞表位的長度為九個胺基酸，設計本發明所述的優化病毒多肽所利用的遺傳算法基於優化給定病毒基因產物(例如，HIV-Ifeig)的每個連續的九聚體胺基酸序列。根據該方法，可排除自然界中不存在的或非常稀有的(例如)九聚體——相對於基於共有序列的疫苗策略是一種改進，因為後者可包含一些稀有或自然界中根本不存在的(例如)九聚體。用於遺傳算法中的適合度的定義是，最「合適的」多價混合物是在群體中產生所有九聚體的最佳覆蓋率(完美匹配的最高分數)的輸入病毒序列的組合，並且滿足群體中無九聚體缺失或稀有的限制。 用於生成本發明的優化病毒多肽的遺傳算法在國際專利申請公開WO 2007/024941中進一步描述，此處以引用方式併入。在一個實施方式中，本發明提供了併入單一優化HIV-I多肽(例如，在SEQ ID NOS :1- 中所描述的多肽)的多價(例如二價)HIV-I疫苗。在另一個實施方式中，本發明的特徵在於一種併入兩個或多個優化HIV-I多肽的多價疫苗。在每種情況下，優化HIV-I 多肽都是基於全球流行的所有HIV-I變體，稱為HIV-I主要(M)組。發明人生成了一組優化的HIV-I多肽(SEQ ID NOS :1- )，其增加基於M組鑲嵌基因的細胞免疫的廣度和深度， 該M組鑲嵌基因中每個基因僅利用兩個變體(例如，兩個多肽序列，每個為feig、Pol、Env, Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu)。我們已經在恆河猴(Rhesus macaques)中獲得新的並且驚人的結果，在多價(例如二價)HIV-IM組疫苗中使用這些優化HIV-I多肽，與其它兩個領先疫苗抗原策略(M共有序列抗原和最佳天然進化支C抗原)相比，引起明顯更大的HIV-I 特異性細胞免疫應答的廣度和深度。本發明提供了與不同的病毒基因產物相對應的優化病毒多肽的融合。上述遺傳算法可用於生成在本發明的疫苗中所使用的融合多肽。例如，Gag/Nef(SEQ ID NOS :19-20)、 Gag/Pol (SEQ ID NOS :21-27) ,Gag/Pol/Nef (SEQ ID NOS :28-29)的優化HIV-1 多肽融合可併入本發明的載體中，以給予感染HIV-I或具有感染HIV-I風險的對象(例如人類)。本發明所述疫苗(不論是多肽還是核酸的形式)還可以包括一個或多個非「鑲嵌」多肽(或分別編碼它們的序列)，如，例如，最佳進化支C序列(SEQ IDNOS 30-36)或共有序列(SEQ ID NOS 37-39)。本發明公開的優化病毒多肽可通過化學合成技術進行傳統製備，如Merrifield， J. Amer. Chem. Soc. 85 :2149(1963)(也見於例如 Memmer 等，164Gene 49(1995))中所描述。 例如，該疫苗可容易地使用固相肽合成(SPPQ製備。自動固相合成可通過使用很多熟知的、市售的自動合成器中的任何一個進行，如應用生物系統公司(Applied Biosystems)的 ABI433A肽合成器。可替換地，本發明的優化病毒多肽可通過使用可實現優化病毒多肽細胞內表達的核酸或載體(例如，病毒載體，如腺病毒)對細胞或有機體進行轉染或轉導而進行重組化生產。編碼本發明的優化病毒多肽的核苷酸序列的核酸和載體可通過熟知的重組 DNA技術合成，包括本文中描述的技術。本發明的疫苗本發明的特徵還在於一種疫苗，其可給予已感染病毒或具有感染病毒(例如 HIV-1)風險的患者。本發明的疫苗包含至少一個本發明的優化病毒多肽，如本文所討論。 本發明的疫苗可以是編碼兩個或多個本發明的優化病毒多肽的核苷酸序列的核酸(例如， 重組體的免疫原性組分(例如亞單元)或完整有機體(例如，完整病毒)病毒載體)。核酸包括併入兩個或多個本發明的優化病毒多肽的核苷酸序列的載體(例如，病毒載體，如腺病毒)。本發明的優化病毒多肽，以及併入了優化病毒多肽的疫苗、核酸和載體，可在細胞或有機體中進行重組化表達，或可直接給予已感染病毒或具有感染病毒風險的對象(例如人類)。本發明的載體本發明的特徵還在於編碼一個或多個本發明的優化病毒多肽的核苷酸序列(例如DNA或RNA)的載體。載體可以是包括編碼一個或多個本發明的優化病毒多肽的核苷酸序列的載體(例如脂質體)、質粒、黏粒、酵母人工染色體或病毒。載體能夠包括其他的來自幾個來源的核酸序列。編碼一個或多個本發明的優化病毒多肽的載體可以使用任何本領域公知的重組分子生物技術進行構建。對靶細胞或有機體進行轉染或轉導後，載體可在染色體外或可整合入宿主細胞的染色體。每個靶細胞中載體的核酸組分可以為單或多拷貝數，可為線型、環形或串聯狀。本發明的載體也可以包括內部核糖體進入位點(IREQ序列，以實現單次核酸轉錄表達多個肽或多肽鏈。例如，本發明的載體可以編碼一個或多個本發明的優化病毒多肽以及其它多肽(例如，可檢測的標記，如綠色螢光蛋白(GFP))。本發明所述的載體進一步包括促進本發明優化病毒多肽表達的基因表達元件。有助於編碼本發明所述的優化病毒多肽的載體的表達的基因表達元件包括，但不限於(a)調節序列，如病毒轉錄啟動子及其增強子元件，如SV40早期啟動子、勞斯(Rous)肉瘤病毒LTR 和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒LTR ； (b)例如來自SV40晚期區的拼接區和多腺苷酸化位點；以及(c)例如在SV40中的多腺苷酸化位點。還包括來源於複製的質粒、抗生素耐藥性或選擇性基因、多克隆位點(例如，限制性內切酶位點)以及其它病毒基因序列(例如， 編碼病毒結構元件、功能元件或調節元件的序列，如HIV長末端重複序列(LTR))。本發明載體也可以包括本發明的用於在人類中表達而優化的優化病毒多肽，如， 例如SEQ ID NOS 11,14-18和23中的任意一個。本發明的載體可以被設計成包括多克隆位點(MCS)，該多克隆位點含有如下酶切位點:Xbal-EcoRI-Kozak-起始· · ·終止-BamHI-NheI ；以及如下序列TCTAGA GAATTC GCCACC[ATG基因TAA TGA]GGATCCGCTAGC。具有該MCS的載體可與優化病毒多肽共同使用， 該優化病毒多肽不具有內部)(bal、EcoRI, BamHI, NheI位點也不具有6個或多個C或G的節段。體內給予本發明的特徵在於一種用於體內給予對象(例如人類)一種或多種本發明的疫苗 (例如，編碼兩個或多個本發明的優化病毒多肽)的方法，以促進兩個或多個本發明的優化病毒多肽的表達。給予對象疫苗後，將表達一個或多個本發明的優化病毒多肽，能夠引起針對病毒免疫原的保護性或治療性免疫應答(例如，細胞或體液免疫應答)。可使用若干種載體來將編碼本發明所述的一個或多個優化病毒多肽的核苷酸序列直接遞送至對象(例如人類)。本發明的載體包括病毒、裸露DNA、寡核苷酸、陽離子類脂 (例如脂質體)、陽離子聚合物(如多核糖體)、病毒顆粒和樹枝狀聚合物。本發明提供細胞 (例如血細胞)的體外轉染或轉導，隨後將這些細胞給予供體對象，以表達本發明的具有免疫原特性的優化病毒多肽。根據本發明所述方法能夠被分離並且進行體外轉染或轉導的細胞包括但不限於血細胞、皮膚細胞、成纖維細胞、內皮細胞、骨骼肌細胞、肝細胞、前列腺上皮細胞和血管內皮細胞。幹細胞也適合用本發明的載體進行轉染或轉導。全能、多能性、多能或單能幹細胞，包括骨髓祖細胞和造血幹細胞(HSC)，可被分離並利用編碼一個或多個本發明的優化病毒多肽的載體進行轉染或轉導，並且根據本發明的方法給予對象。用於表達本發明所述的優化病毒載體的轉染或轉導的方法，對在轉染或轉導細胞中以及在隨後接受細胞的對象中的蛋白表達的強度和壽命有著很強的影響。本發明提供自然界中壽命短暫的(例如腺病毒載體)或壽命長的(例如逆轉錄病毒載體)載體。調節序列(例如啟動子和增強子)是本領域已知的，可用於調節蛋白表達。轉染或轉導的細胞類型對蛋白表達的強度和壽命也有著很強的影響。例如，可以預期具有高周轉率的細胞類型具有更短的蛋白表達周期。體外轉染和轉導本發明的特徵還在於一種用於體外細胞(例如，血細胞，如淋巴細胞)轉染和轉導的方法，隨後將這些細胞給予對象(例如人類)。在一個實施方式中，細胞為所處理對象的自體細胞。可使用編碼一個或多個本發明所述優化病毒多肽的核苷酸序列的一個或多個載體對細胞進行體外轉染或轉導，以使優化病毒多肽能夠在處理的對象中進行短暫或長期表達。將這些修飾的細胞給予對象後，會表達一個或多個本發明所述的優化病毒載體，以引起針對病毒免疫原的保護性或治療性的免疫應答(例如細胞或體液免疫應答)。可使用若干種載體來將編碼一個或多個本發明所述的優化病毒多肽的核苷酸序列遞送至細胞(例如血細胞，如淋巴細胞)。本發明所述載體包括病毒、裸露DNA、寡核苷酸、 陽離子類脂(例如脂質體)、陽離子聚合物(如多核糖體)、病毒顆粒和樹枝狀聚合物。本發明提供細胞(例如血細胞)的體外轉染或轉導，隨後將這些細胞給予供體對象，以表達本發明所述的具有免疫原特性的優化病毒多肽。根據本發明所述方法，能夠被分離並且進行體外轉染或轉導的細胞包括但不限於血細胞、皮膚細胞、成纖維細胞、內皮細胞、骨骼肌細胞、肝細胞、前列腺上皮細胞和血管內皮細胞。幹細胞也是用於用本發明所述的載體進行轉染或轉導的合適的細胞。全能、多能性、多能或單能幹細胞，包括骨髓祖細胞和造血幹細胞 (HSC)，可被分離並利用編碼一個或多個本發明的優化病毒多肽的載體進行轉染或轉導，並且根據本發明所述的方法給予對象。用於表達本發明所述的優化病毒載體的轉染或轉導的方法，對在轉染或轉導細胞中以及在隨後接受細胞的對象中的蛋白表達的強度和壽命有著很強的影響。本發明提供在自然界中壽命短暫的(例如腺病毒載體)或壽命長的(例如逆轉錄病毒載體)載體。調節序列(例如啟動子和增強子)是本領域已知的，其可用於調節蛋白表達。轉染或轉導的細胞類型對蛋白表達的強度和壽命也有著很強的影響。例如，可以預期具有高周轉率的細胞類型具有更短的蛋白表達周期。病毒載體編碼一個或多個本發明的優化病毒多肽的核苷酸序列的病毒載體可用作本發明的疫苗。例如，一個或多個本發明的優化病毒多肽的核苷酸序列可重組地插入適於對象或從對象中分離的細胞(例如，體外轉導之後將細胞給予對象)的轉導(例如，體內給予)的天然或修飾(例如，減毒)的病毒基因組的核苷酸序列中。可以對病毒進行額外的修飾，以提高感染性或趨性(例如假型)，減少或消除複製能力，或降低病毒組分的免疫原性(例如， 所有與免疫原性疫苗因子不相關的組分)。本發明所述載體可以由轉導的細胞表達並分泌到細胞外的空間或留在表達細胞中(例如，作為細胞內分子或呈現在細胞表面)。嵌合或假型病毒載體也可用於轉導細胞以實現一個或多個本發明所述優化病毒多肽的表達。典型的載體描述如下。腺病毒
重組腺病毒在用作表達一個或多個本發明所述的優化病毒多肽的載體時提供數個顯著的優點。病毒可製備成高效價，可感染非複製的細胞，也可在接觸靶細胞群後提供體外靶細胞的高效轉導。此外，腺病毒不將其DNA整合入宿主的基因組中。因此，其作為表達載體的使用降低了誘導自發增殖異常的風險。在動物模型中，通常發現腺病毒載體介導約一星期的高水平表達。轉基因表達(編碼本發明所述優化病毒多肽的核酸的表達)的持續時間可通過使用細胞或組織特異性啟動子延長。腺病毒載體自身的分子工程中的其它改進產生更持久的轉基因表達和更少的炎症。這見於所謂的「第二代」具有在另外的早期腺病毒基因中的特異性突變的載體，以及實際上已利用Cre-Lox策略刪除了所有病毒基因的「沒有生機的(膽小的，gutless) 」載體(Engelhardt 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 6196(1994)和 Kochanek 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :5731 (1996)，此處每個以引用方式併入)ο公開於國際專利申請公開WO 2006/040330和WO 2007/104792 (此處每個以引用方式併入)的稀有血清型和嵌合腺病毒載體，作為本發明所述的載體尤其有用。例如，重組腺病毒rAd26、rAd34、rAd35、rAd48和rAd5HVR48能夠編碼一個或多個本發明所述的優化病毒多肽。一個或多個編碼本發明所述的優化病毒多肽的重組病毒載體可給予對象，以治療或預防病毒感染。腺相關病毒(AAV)腺相關病毒(AAV)，來自非致病性細小病毒，由於這些載體引起幾乎無抗載體的細胞免疫應答，並在大多數實驗系統中產生持續數月的轉基因表達，因此也可以用於表達本發明所述的優化病毒多肽。逆轉錄病毒逆轉錄病毒用於本發明所述的優化病毒多肽的表達。與腺病毒不同，逆轉錄基因組是基於RNA的。當逆轉錄病毒感染細胞時，會將其RNA與數種酶一起導入該細胞。來自逆轉錄病毒的病毒RNA分子將通過稱為逆轉錄的過程產生雙鏈的DNA拷貝，稱為前病毒。在轉運至細胞核後，前病毒DNA整合入宿主細胞染色體，持久地改變所轉導細胞及任何來自該細胞的後代細胞的基因組。持久地將基因導入細胞或有機體的能力是用於基因治療的逆轉錄病毒的必然特徵。逆轉錄病毒包括慢病毒，其為包括人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒家族，包括若干輔助蛋白以促進病毒感染和前病毒整合。目前，「第三代」慢病毒載體具有完全無複製能力、廣泛的趨向性以及對哺乳動物細胞的基因轉移能力增強的特徵(見於，例如 Mangeat 禾口 Trono, Human Gene Therapy 16(8) :913(2005)以及 Wiznerowicz 禾口 Trono, Trends Biotechnol. 23(1) :42 (2005)，此處每個以引用方式併入)。其它病毒載體除了腺病毒和逆轉錄病毒，本領域已知其它病毒載體和技術可用於在細胞(例如血細胞，如淋巴細胞)或對象(例如人類)中表達本發明的優化病毒多肽。這些病毒包括痘病毒(例如牛痘病毒和修飾的安卡拉牛痘病毒或(MVA)；見於，例如美國專利號4，603，112 和5，762，938，此處每個以引用方式併入)、皰疹病毒、披蓋病毒(例如委內瑞拉馬腦炎病毒；見於，例如美國專利號5，643，576，此處以引用方式併入)、小核糖核酸病毒(例如脊髓灰質炎病毒；見於，例如美國專利號5，639，649，此處以引用方式併入)、杆狀病毒以及其它由 Wattanapitayakul 禾口 Bauer 所描述的(Biomed. Pharmacother, 54 :487 (2000)，此處以引用方式併入)。其它表達載體裸露DNA和寡核苷酸編碼一個或多個本發明所述的優化病毒多肽的裸露DNA或寡核苷酸也可用於在細胞(例如血細胞，如淋巴細胞)或對象(例如人類)中表達這些多肽。見於，例如，Cohen， Science 259:1691-1692(1993) ；Fynan 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，90 11478 (1993)；禾口 Wolff等，BioTechniques 11 :474485 (1991)，在本文中每一個以引用方式併入。這是最簡單的非病毒轉染方法。遞送裸露DNA的有效方法有如電穿孔和「基因槍」的使用，其用高壓氣體和載體微粒(例如金)將DNA包被的金微粒射入細胞中。脂複合物和聚合複合物為提高編碼本發明所述的優化病毒多肽的核酸遞送進入細胞或對象，脂複合物 (例如脂質體)和聚合複合物可以用於保護載體DNA在轉染過程中免於不希望的降解。質粒DNA可以覆蓋著像膠束或脂質體的組織結構的脂質。當該組織結構與DNA複合時，被稱為脂複合物(lipoplex)。有三種類型的脂類，陰離子的(帶負電荷的)、中性的或陽離子的 (帶正電荷的)。利用陽離子脂類的脂複合物已證明對基因轉運有用。陽離子脂類，由於其正電荷，自然地與帶負電荷的DNA形成複合物。同樣由於其電荷，它們與細胞膜相互作用， 發生脂複合物的內吞，並將DNA釋放至細胞質。陽離子脂類也保護DNA免於被細胞降解。聚合物與DNA的複合物稱為聚合複合物(polyplex)。大多數聚合複合物由陽離子聚合物組成，其產生是由離子相互作用所調節的。聚合複合物和脂複合物作用方式之間的較大差異是，聚合複合物不能將其DNA負載釋放至細胞質中，因此，必須用內涵體溶解劑 (以溶解在細胞內吞過程中生成的內涵體)如滅活的腺病毒進行共轉染。然而，這並非總是如此；聚合物如聚乙烯亞胺具有其特有的內涵體破壞方法，如同殼聚糖和三甲基殼聚糖那樣。可用於與編碼本發明所述的優化病毒多肽的核酸結合以形成脂複合物或聚合複合物的典型的陽離子脂類和聚合物包括但不限於，聚乙烯亞胺、脂轉染試劑(IiPOfectin)、 脂轉染胺試劑(lipofectamine)、聚賴氨酸、殼聚糖、三甲基殼聚糖和海藻酸鹽。雜交方法幾種基因轉移的雜交方法結合了兩種或多種技術。病毒顆粒，例如，將脂複合物 (例如脂質體)與滅活的病毒結合。已顯示該方法與單獨使用病毒或脂質體方法相比，導致在呼吸道上皮細胞中更有效的基因轉移。其它方法涉及將其它病毒載體與陽離子脂質或雜交病毒混合。這些方法中每一個都可用於促進編碼本發明所述的優化病毒多肽的核酸轉移至細胞(例如血細胞，如淋巴細胞)或對象(例如人類)中。樹枝狀聚合物樹枝狀聚合物也可用於將編碼本發明所述的優化病毒多肽的核酸轉移至細胞 (例如血細胞，如淋巴細胞)或對象(例如人類)中。樹枝狀聚合物是高度支化的球形大分子。微粒的表面可在許多方面發揮作用，並且所產生構建體的許多性質由其表面決定。尤其可能構建陽離子樹枝狀聚合物(即具有表面正電荷的樹枝狀聚合物)。當存在於基因材料如DNA或RNA中，電荷互補性導致核酸與陽離子樹枝狀聚合物的短暫的結合。一旦到達目標，樹枝狀聚合物-核酸複合物通過細胞內吞作用攝入細胞內。體內給予
本發明的特徵在於一種使用本發明的疫苗對對象(例如人類)進行免疫的體內方法。在一個實施方式中，本發明所述的一個或多個疫苗可直接給予對象，以引起針對病毒 (HIV-I)的保護性或治療性的免疫應答(例如，細胞或體液免疫應答)。可替換地，可將如上所述的編碼一個或多個本發明的優化病毒多肽的載體直接給予對象以預防或治療病毒感染。有效地在體內轉染或轉導一個或多個細胞的載體(例如病毒載體)能夠在所處理對象中引起廣泛的、持久的以及有效的免疫應答。在表達載體的核酸組分轉移至宿主細胞(例如血細胞，如淋巴細胞)後，宿主細胞產生並呈現或分泌本發明所述的疫苗，隨後用於活化免疫系統的組分，如抗原呈遞細胞(APCs)、T細胞和B細胞，導致免疫的建立。藥物組合物本發明的特徵在於本發明的疫苗、載體和優化病毒多肽與一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑、緩衝液或其它可接受的載體的組合。疫苗、載體或優化病毒多肽的配方會使用或實現有效量的優化病毒多肽免疫原的表達。也就是說，會包括一定量的抗原，其導致所處理對象(例如人類)產生特異性和充分的免疫應答，以保護對象以免隨後暴露於病毒(例如HIV-1)或治療已有的病毒感染。例如，本發明的疫苗的配方可實現一定量的抗原表達，其導致對象產生廣泛和特異性的細胞免疫應答。使用本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽處理的對象也可產生抗病毒抗體(例如中和抗體)，該抗體可向對象提供保護性或治療性的益處。本發明的疫苗、載體或優化病毒多肽可單獨或與本領域已知的任何藥學上可接受的載體、鹽或佐劑結合後直接給予對象。藥學上可接受的鹽可能包括製藥工業中常用的無毒酸加成鹽或金屬複合物。酸加成鹽的例子包括有機酸如乙酸、乳酸、撲酸、馬來酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、 苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲基磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸或類似物；共聚物酸如單寧酸、羧甲基纖維素或類似物；和無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸或類似物。金屬複合物包括鋅、鐵及類似物。典型的藥學上可接受的載體是生理鹽水。其它生理上可接受的載體及其配方對本領域技術人員是已知的，並且在例如，Remi股ton' s Pharmaceutical Sciences, (18th 版),ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA 中描述。本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽的預防性或治療性有效量的藥物配方與藥學上可接受的適合於給予途徑的載體混合後，可通過口服、胃腸道外(例如，肌肉、腹腔內、靜脈或皮下注射，吸入，皮內注射，滴眼或植入)、鼻腔、陰道、直腸、舌下或局部給予。配方中本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽的濃度可在約0.1-100質量％間變化。用於胃腸道外給予含有本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽的組合物的配方包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮液或乳劑。適宜的載體的例子包括丙二醇、聚乙二醇、 植物油、凝膠、氫化萘以及可注射的有機酯，如油酸乙酯。這種配方也可包含添加劑，如防腐齊U、潤溼劑、乳化劑和分散劑。可生物相容、生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙醇酸交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用於控制化合物的釋放。其它可能有用的包含本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽的組合物的胃腸道外遞送系統包括乙烯-醋酸乙烯共聚物微粒、滲透泵、植入式輸注系統和脂質體。液體配方可通過例如細菌濾器過濾、在組合物中加入滅菌劑或輻照或加熱組合物進行滅菌。可替換地，也可以無菌、固態的組合物形式生產，該組合物在溶解於無菌水或一些其它的無菌可注射介質後立即使用。
用於直腸或陰道給予含有本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽的組合物優選栓劑，其可能含有除活性物質以外的賦形劑，如可可油或栓劑蠟。用於鼻腔或舌下給予的組合物也用本領域已知的標準賦形劑進行製備。用於吸入給予的配方可能含有賦形劑例如乳糖，或可能是含有例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水性溶劑，或可能是油性溶劑，以滴鼻劑或噴霧劑形式或作為凝膠給予。本發明所述的組合物中活性成分的量可以是不同的。本領域技術人員應懂得準確的個體劑量可能有所調整，取決於多種因素，包括所給予的肽、給予時間、給予途徑、配方的性質、排洩的速率、對象疾病的性質以及患者的年齡、體重、健康狀況和性別。此外，由疫苗、 載體或優化病毒多肽所治療的疾病的嚴重程度也對劑量水平產生影響。通常，劑量水平在 0. 1 μ g/kg體重至100mg/kg體重間，每天單劑量或分為多個劑量給予。優選地，一般劑量範圍在每天250 μ g/kg體重至5. Omg/kg體重間。由於不同給予途徑的效率不同，可以預期所需劑量有廣泛變化。例如，與靜脈注射給予相比，通常預期口服給予需要更高的劑量水平。 這些劑量水平的變化可以使用本領域熟知的優化用標準經驗程序進行調整。通常，準確的預防性或治療性有效的劑量能夠由主治醫生參考如上確定因素進行確定。在給予患者的每個劑量中存在的本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽的量是鑑於對患者年齡、體重、性別、一般身體狀況及類似情況的考慮而選擇的。在患者中誘導免疫應答(例如細胞免疫應答)或產生外源性效應而無明顯不良副作用所需的疫苗、載體或優化病毒多肽的量根據所使用的藥物組合物和可選佐劑的存在進行變化。如果需要，初始劑量可選地跟隨反覆的加強。方法可涉及長期給予本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽。對於治療性用途或預防性用途，免疫疫苗、載體或優化病毒多肽的重複劑量是可取的， 例如每年加強或其它時間間隔的加強。當然，所給予的劑量根據已知因素如特定疫苗、載體或優化病毒多肽的藥效學特徵及其給予模式和途徑；接受者的年齡、健康狀況和體重；症狀的性質和程度，同時治療的種類，治療的頻率和所需的效果有所不同。本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽可在長期治療中給予由於針刺或母性感染而具有急性感染風險的對象。該「急性」感染的劑量頻率範圍可從每日劑量到每周一次或兩次肌注或靜注，持續約6 星期。疫苗、載體或優化病毒多肽也可在長期治療中給予已感染患者，或晚期感染病毒(例如HIV-1)的患者。在已感染患者中，長期給予的頻率範圍可從每日劑量到每周一次或兩次肌注或靜注，並取決於存在於本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽中的免疫原的半衰期。佐劑本發明所述的用於接種需要其的哺乳動物(例如人類)的針對病毒的疫苗可與一個或多個藥學上可接受的佐劑共同給予或連續給予，以增加疫苗的免疫原性。批准用於人類的佐劑包括鋁鹽(明礬)。這些佐劑已用於某些疫苗，包括B型肝炎、白喉、狂犬病、脊髓灰質炎及流感疫苗。其它有用的佐劑包括完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)、胞壁醯二肽(MDP)、MDP的合成類似物、N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯基-D-異穀氨醯基-L-丙氨酸-2-[l，2-二棕櫚醯基-S-甘油-3-(羥基磷醯氧基)]乙醯胺(MTP-PE)和含有可代謝油和乳化劑的組合物，其中所述油和乳化劑以水包油乳劑形式存在，該乳劑的油滴基本上所有的直徑小於一微米。試劑盒
本發明提供試劑盒，其包括含有本發明所述的用於預防或治療病毒感染的治療有效量的疫苗、載體或優化病毒多肽和藥學上可接受的載體的藥物組合物。所述試劑盒包括使用說明書，以允許臨床醫生(例如醫生或護士)給予其中所含的組合物。優選地，所述試劑盒包括多包裝的單劑量藥物組合物，其含有有效量的本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽。可選地，試劑盒可包括給予藥物組合物所必需的儀器或裝置。例如，本發明所述試劑盒可提供一個或多個預充注射器，其含有有效量的本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽。此外，所述試劑盒也可包括其它組分，例如已感染病毒或具有感染病毒風險的患者使用含有本發明所述的疫苗、載體或優化病毒多肽的藥物組合物的使用說明書或給予日程。對本領域技術人員顯而易見的是，可以作出各種對本發明所述的組合物、方法和試劑盒的修改和變化而不違背本發明的精神和範圍。因此其意圖是，如果本發明所述的修改和變化落入所附權利要求及其等同物的範圍，其被本發明所涵蓋。
具體實施例方式本發明由如下實施例進行說明，該些實施例並不意在限制本發明。實施例1鑲嵌抗原Gag、Pol、Nef和Env序列(SEQ ID NOS :1_8)使用如上討論的遺傳算法進行構建。然後修改這些序列，通過消除Env (SEQ IDNOS :9-11)中的切割/融合活性，消除Pol (SEQ ID NOS :12-14)中的催化活性，消除Nef (SEQ ID NOS 16-18)中的十四烷基化位點，以及構建包括feigNef、feigPol或feigPolNef(SEQ ID NOS :19-29)的融合構建體，使這些序列對於疫苗開發具有實用性。也描繪了比對最佳天然進化支C基因(SEQ ID NOS 30-36)。實施例2用來自M共有序列(組1)、二價M鑲嵌序列(組幻或最佳天然進化支C序列(組 3)的表達( g、Pol和Env基因的3X101°Vp rAc^6載體對20隻恆河猴進行免疫。M共有序列代表合成序列，該合成序列代表全球流行病毒中唯一最好的「平均水平」。二價M鑲嵌序列描述如上。最佳天然進化支C序列是來自性質最「類似共有序列」的真實進化支C HIV-I 病毒的天然存在的序列。通過評價來自全球潛在T細胞表位(PTE)肽組中的應答肽的數量來評估細胞免疫的廣度。所述PTE肽代表> 85%的全球HIV-I序列，並由NIH免費提供。結果顯示新型二價M鑲嵌序列顯著優於其它兩個主要抗原概念。如表1所示，與M 共有抗原和最佳天然進化支C抗原相比，二價M鑲嵌抗原引起Gag特異性、Env特異性、Pol 特異性和總T淋巴細胞應答的廣度顯著增加。(平均值代表每組猴子的平均#表位；SEM代表平均值的標準誤差)。表1 恆河猴中鑲嵌HIV-lGag/Pol/Env抗原針對全球PTE肽的擴展廣度
權利要求
1.一種用於治療哺乳動物病毒感染或降低哺乳動物病毒感染風險的疫苗，包括至少兩個不同的優化病毒多肽，其中所述優化病毒多肽與相同的病毒基因產物相對應。
2.根據權利要求1所述的疫苗，其中所述哺乳動物為人類。
3.根據權利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗引起針對所述病毒基因產物的細胞免疫應答。
4.根據權利要求1所述的疫苗，其中所述病毒感染由逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒、或多瘤病毒引起。
5.根據權利要求4所述的疫苗，其中所述逆轉錄病毒是1型人類免疫缺陷病毒 (HIV-I)。
6.根據權利要求5所述的疫苗，其中所述病毒基因產物選自由feg、P0l、Env、Nef、Tat、 Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組。
7.根據權利要求6所述的疫苗，其中所述疫苗僅包含兩個優化病毒多肽，所述優化病毒多肽與選自由feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組中的病毒基因產物之一相對應。
8.根據權利要求5或6所述的疫苗，其中所述疫苗不包括與Gag和Nef相對應的優化病毒多肽。
9.一種用於治療哺乳動物中1型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)感染或降低其風險的疫苗，包含含有至少七個連續胺基酸的優化病毒多肽，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個具有至少85%的胺基酸序列同一性。
10.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述優化病毒多肽包含至少七個連續胺基酸，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的序列中的任意一個具有胺基酸序列同一性。
11.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述優化病毒多肽包含SEQIDNOS :1- 所描述的任意一個序列中的胺基酸序列。
12.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述哺乳動物為人類。
13.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗引起針對HIV-I的細胞免疫應答。
14.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少兩個所述優化病毒多肽。
15.根據權利要求14所述的疫苗，其中所述至少兩個所述優化病毒多肽包含a) SEQIDNOS:1 禾口 2 ;b)SEQIDNOS:3 禾口 4 ;c) SEQIDNOS:5 和 6 ；d) SEQIDNOS:7 禾口 8 ；e)SEQIDNOS9 禾口 10 ；f) SEQIDNOS10 禾口 11 ；g) SEQIDNOS9 禾口 11 ；h) SEQIDNOS12 禾口 13 ；i)SEQIDNOS13 禾口 14 ；j) SEQIDNOS12 禾口 14 ；k) SEQIDNOS3 禾口 15 ；1)SEQIDNOS4 禾口 15 ；m) SEQIDNOS16 禾口 17 ；n) SEQIDNOS17 禾口 18 ；ο) SEQIDNOS16 禾口 18 ；ρ) SEQIDNOS19 禾口 20 ；q) SEQIDNOS21 禾口 22 ；r) SEQIDNOS22 禾口 23 ；s) SEQIDNOS21 禾口 23 ；t)SEQIDNOS24 禾口 25 ；u) SEQIDNOS26和27 ；或ν) SEQIDNOS28 禾口 29。
16.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少三個所述優化病毒多肽。
17.根據權利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗包含至少四個所述優化病毒多肽。
18.一種用於治療哺乳動物病毒感染或降低其風險的疫苗，包括至少兩對不同的優化病毒多肽，其中每一對所述優化病毒多肽與相同的病毒基因產物相對應，並且其中僅兩個已結合到所述疫苗中的優化病毒多肽與所述相同的病毒基因產物相對應。
19.根據權利要求18所述的疫苗，其中所述哺乳動物為人類。
20.根據權利要求18所述的疫苗，其中所述疫苗引起針對所述病毒基因產物的細胞免疫應答。
21.根據權利要求18所述的疫苗，包含至少三對不同的優化病毒多肽。
22.根據權利要求18所述的疫苗，包含至少四對不同的優化病毒多肽。
23.根據權利要求18所述的疫苗，其中所述病毒感染由逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、 痘病毒、或多瘤病毒引起。
24.根據權利要求23所述的疫苗，其中所述逆轉錄病毒是1型人類免疫缺陷病毒 (HIV-I)。
25.根據權利要求M所述的疫苗，其中所述至少兩對不同的優化病毒多肽與選自由 feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組中的任意兩個病毒基因產物相對應。
26.根據權利要求25所述的疫苗，其中所述至少兩個病毒基因產物不是Gag和Nef。
27.根據權利要求25所述的疫苗，包含至少三對不同的優化病毒多肽，所述優化病毒多肽與選自由feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組中的任意三個病毒基因產物相對應。
28.根據權利要求18所述的疫苗，包含至少四對不同的優化病毒多肽，所述優化病毒多肽與選自由feig、Pol、Env、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu組成的組中的任意四個病毒基因產物相對應。
29.根據權利要求M所述的疫苗，其中所述疫苗引起針對HIV-I的細胞免疫應答。
30.根據權利要求1、9或18所述的疫苗，其中至少一個不同的優化病毒多肽的核苷酸序列由核酸或載體編碼。
31.根據權利要求30所述的疫苗，其中所述載體是重組腺病毒。
32.根據權利要求31所述的疫苗，其中所述重組腺病毒是腺病毒血清型^(Ad26)、腺病毒血清型34(Ad34)、腺病毒血清型35(Ad3Q、腺病毒血清型48 (Ad48)或腺病毒血清型 5HVR48(Ad5HVR48)。
33.根據權利要求1、9或18所述的疫苗，進一步與藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑結合。
34.一種包含優化病毒多肽的核苷酸序列的核酸，所述優化病毒多肽包含至少七個連續的胺基酸，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的胺基酸序列中的任意一個具有至少85%的胺基酸序列同一性。
35.根據權利要求34所述的核酸，其中所述優化病毒多肽包含至少七個連續胺基酸， 其與SEQ ID NOS :1- 所描述的胺基酸序列中的任意一個具有序列同一性。
36.根據權利要求34所述的核酸，其中所述優化病毒多肽包含SEQIDNOS :1- 所描述的胺基酸序列中的任意一個。
37.根據權利要求34所述的核酸，進一步包含載體。
38.根據權利要求37所述的核酸，其中所述載體是重組腺病毒。
39.根據權利要求38所述的核酸，其中所述重組腺病毒是腺病毒血清型^(Ad26)、腺病毒血清型34 (Ad34)、腺病毒血清型35 (Ad35)、腺病毒血清型48 (Ad48)或腺病毒血清型 5HVR48(Ad5HVR48)。
40.一種優化病毒多肽，包含至少七個連續的胺基酸，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的胺基酸序列中的任意一個具有至少85 %的胺基酸序列同一性。
41.根據權利要求40所述的優化病毒多肽，其中所述優化病毒多肽包含至少七個連續胺基酸，其與SEQ ID NOS :1- 所描述的胺基酸序列中的任意一個具有序列同一性。
42.根據權利要求40所述的優化病毒多肽，其中所述優化病毒多肽包含SEQID NOS 1-29所描述的胺基酸序列中的任意一個。
43.一種用於治療哺乳動物病毒感染或降低其風險的方法，包括給予所述哺乳動物根據權利要求1、9或18所述的疫苗，或根據權利要求37所述的核酸。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。
45.根據權利要求43所述的方法，其中所述疫苗或核酸引起針對所述病毒基因產物的細胞免疫應答。
46.根據權利要求43所述的方法，其中所述病毒感染由逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、 痘病毒、或多瘤病毒引起。
47.根據權利要求46所述的方法，其中所述逆轉錄病毒是1型人類免疫缺陷病毒 (HIV-I)。
48.根據權利要求43所述的方法，其中所述病毒基因產物選自由feg、Pol、Env,Nef、 Tat、Rev、Vif、Vpr 和 Vpu 組成的組。
49.一種製備用於治療哺乳動物病毒感染或降低哺乳動物病毒感染風險的疫苗的方法，所述方法包含合成根據權利要求1、9或18所述的疫苗。
50.一種製備用於治療哺乳動物病毒感染或降低哺乳動物病毒感染風險的疫苗的方法，所述方法包含以下步驟a)將權利要求37所述的核酸與細胞接觸；和b)分離所述優化病毒多肽。
51.根據權利要求49或50所述的方法，其中當所述優化病毒多肽給予哺乳動物時引起細胞免疫應答。
52.根據權利要求49或50所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
53.根據權利要求49或50所述的方法，其中所述疫苗引起針對所述病毒基因產物的細胞免疫應答。
54.根據權利要求49或50所述的方法，其中所述病毒感染由逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、 小核糖核酸病毒、披蓋病毒、正粘病毒、副粘病毒、杯狀病毒、沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、 布尼亞病毒、冠狀病毒、星狀病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、皰疹病毒、嗜肝性DNA病毒、痘病毒、或多瘤病毒引起。
55.根據權利要求M所述的方法，其中所述逆轉錄病毒是1型人類免疫缺陷病毒 (HIV-I)。
56.根據權利要求55所述的方法，其中所述病毒基因產物選自由feg、Pol、Env、Nef、 Tat、Rev、Vif、Vpr 和 Vpu 組成的組。
57.一種試劑盒，包含a)根據權利要求1、9或18所述的疫苗；b)藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑；和c)其使用說明書。
58.根據權利要求57所述的試劑盒，進一步包含佐劑。
59.一種試劑盒，包含a)根據權利要求37所述的核酸；b)藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑；和c)其使用說明書。
60.根據權利要求59所述的試劑盒，進一步包含佐劑。
全文摘要
本發明提供用於治療或預防病毒感染的組合物、方法及試劑盒。本發明所述的多價(例如二價)疫苗併入了計算優化的病毒多肽，其可增加接種對象的細胞免疫應答的多樣性或廣度和深度。
文檔編號C07K17/00GK102282175SQ200980154787
公開日2011年12月14日 申請日期2009年11月18日 優先權日2008年11月18日
發明者丹·H·巴勞赫, 威廉·M·菲舍爾, 貝特·T·科貝爾 申請人:洛斯阿拉莫斯國家安全有限責任公司, 貝斯以色列護理醫療中心