靶向性、高表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒及其製法和用途的製作方法

2023-06-07 21:55:56

專利名稱：靶向性、高表達人粒細胞巨噬細胞集 落刺激因子的重組腺病毒及其製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因治療領域。更具體地，本發明涉及一種新的靶向性的、高表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒，該重組腺病毒的製備方法和用途，以及含有該重組腺病毒的藥物組合物。
集落刺激因子(Colony stimulating factor，CSF)是一類造血生長因子，能刺激骨髓多能造血幹細胞向各系祖細胞集落分化，並使其發育成為成熟的粒細胞、巨噬細胞等終末細胞。CSF包括多能集落刺激因子(multipotent CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，簡稱為「GM-CSF」)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)等。GM-CSF體外、體內均能促進粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的增殖分化(Metcalf D.Science，1985；22916-22)。在體內給予GM-CSF後，觀察到持續性的白細胞升高。此外，除了作用於未分化成熟的造血細胞，GM-CSF對已分化成熟的免疫細胞也有重要的調節作用，如抑制中性粒細胞運動、增強中性粒細胞趨化、吞噬和增強單核-巨噬細胞抗腫瘤和抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)等(Gasson JC et al.Blood，1991；771131)。近年來尤其受到廣泛重視的是，發現GM-CSF能增強巨噬細胞和樹突狀細胞的抗原提呈功能等，顯示其在抗腫瘤和抗感染免疫治療中也具有廣闊的臨床應用前景。動物實驗表明，GM-CSF基因修飾的腫瘤細胞在體內能誘導長期、有效的特異性抗腫瘤免疫排斥反應，有顯著的治療作用(Dranoff G.etal，Proc Natl Acad Sci USA，1993，903539)。目前GM-CSF基因修飾的腫瘤細胞作為一種新型有效的腫瘤瘤苗，已用於臨床試驗，治療黑色素瘤、腎癌和前列腺癌等晚期腫瘤患者(Roth J and Cristiano R.J Natl Cancer Inst.1997；8921-39)。
自從成功克隆到人GM-CSF的cDNA序列(Wong G et al.Science，1985；228810.Burgess A et al.J Biol Chem，1987；2521991)以來，GM-CSF作為第一個利用重組DNA技術生產的造血因子(Vlich TR et al.Blood，1990；75846)，顯示了其巨大的臨床應用價值。體內應用粒細胞巨噬細胞集落刺激因子刺激白細胞的增多，主要是中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞的增多，而淋巴細胞僅偶爾有輕度增多。臨床上，重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子被廣泛用於癌症放療化療(Silver GM et al.Surgery，1989；106452-455，Salgaller ML et al.J Surg Oncol 1998；68122-138)、骨髓異常增生綜合症(Vadhan-Raj S et al.Blood，1989；741491-1498)、AIDS(Baldwin GC et al.Blood，1989；741673-1667)、骨髓移植(NemunaitisJ et al.Blood，1988；72834-836)等疾病的治療或輔助治療。此外，GM-CSF對慢性和遺傳性中性粒細胞缺乏症、寄生蟲感染、再生障礙性貧血等亦具有較為顯著的療效。
基因重組技術生產的人GM-CSF現已正式應用於臨床，治療各種原因導致的急性和慢性骨髓造血功能低下的患者，並收到顯著療效。其主要的臨床適應症包括化療和放療引起的粒細胞減少、骨髓增生異常綜合症(MDS)、再生障礙性貧血、AIDS以及促進骨髓移植患者的造血恢復等等(Biotherapy 1998，10299；Int J Hematol.1996，6517；Med Oncol.1996，13155；Cancer 1996，771149)。
Tarr等人在1996年進行了人體試驗，在該實驗中將重組HBV疫苗(注射一次)與rhGM-CSF(注射一次)合用，兩者被注射至同一部位以希望GM-CSF能激活局部的抗原提呈細胞(如郎罕氏細胞)，從而利於抗原的攝取加工與提呈。結果發現，在對照組的27例志願者只有一例出現低滴度保護性的抗HBV抗體反應，而皮下注射GM-CSF的實驗組人中，27例中有5例產生保護性的高滴度抗體反應。接受肌肉注射GM-CSF的實驗組中，27例患者6例產生保護性的高滴度抗體反應(Tarr PE，et al.Vaccine 1996，141199-204)。這一實驗說明，GM-CSF作為一種有效的免疫佐劑，可有效增強瘤苗的免疫效果。
然而，在將GM-CSF直接用於臨床時，仍存在一些問題。例如GM-CSF的體內半衰期較短，因而治療時需要每天注射一次或多次，再加上GM-CSF製劑本身成本較高，所以導致治療費用十分昂貴而且治療效率也不高。此外，在局部施用GM-CSF(如治療腫瘤時)，需要在同一部位附近反覆進行注射，使病人非常痛苦。因此，本領域迫切需要一種成本低，使用方便的施用GM-CSF的方法以及相關的製劑。傳統的GM-CSF基因療法具有成本低廉、使用方便等優點，但往往基因轉染不高、且靶向性差。
本發明的目的就是提供一種新穎的在臨床上施用GM-CSF的方法和相關製劑，從而克服現有技術中的上述缺點，使得臨床施用GM-CSF不僅成本低廉、使用方便，而且效率更高、體內外能靶向性感染特定細胞群體。
在本發明的第一方面，提供了一種靶向性的表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒，該腺病毒的基因組缺失E1區和E3區，並且在E1區位置插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒，該表達盒依次包括啟動子序列，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列和聚腺苷酸化信號序列；而且，在腺病毒表面結合有雙特異性抗體，該抗體既特異性地針對腺病毒表面的結合位點，又特異性地針對細胞表面的受體分子。
較佳地，所述腺病毒為Ad5型腺病毒；且所述的受體分子選自下組CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
在另一優選例中，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒中所含的啟動子序列包括選自下組的真核表達啟動子巨細胞病毒啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子。在另一優選例中，在表達盒中有雙拷貝的人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
在本發明的第二方面，提供了一種藥物組合物，它包括有效量的上述的靶向性的且表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒和藥學上可接受的載體或賦形劑。
在本發明的第三方面，提供了一種製備靶向性的、表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒的方法，該方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP複合物，在該腺病毒DNA基因組缺失E1區和E3區，並且在腺病毒基因組DNA的兩端結合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因組的粘粒載體，在該粘粒載體中的腺病毒基因組缺失了E1區和E3區，並且在E1區位置插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒，其中該表達盒依次包括啟動子序列，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列和聚腺苷酸化信號序列；(c)將步驟(a)中的腺病毒DNA-TP複合物和步驟(b)中的粘粒載體共轉染表達E1區基因的宿主細胞；(d)篩選陽性克隆；
(e)從陽性克隆中分離純化重組腺病毒。
(f)將步驟(e)中的腺病毒與雙特異性抗體結合，該抗體既特異性地針對腺病毒表面的結合位點，又特異性地針對細胞表面的受體分子，從而獲得靶向性的、表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒。
較佳地，在步驟(c)中共轉染方法是磷酸鈣DNA共沉澱轉染法，該宿主細胞是293細胞，而且人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒中所含的啟動子序列選自下組巨細胞病毒啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子；所述的受體分子選自下組CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子；表達盒中有雙拷貝的人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
在本發明的又一方面，提供一種製備表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒的方法，該方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP複合物，在該腺病毒DNA基因組缺失E1區和E3區，並且在腺病毒基因組DNA的兩端結合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因組的粘粒載體，在該粘粒載體中的腺病毒基因組缺失了E1區和E3區，並且在E1區位置插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒，其中該表達盒依次包括啟動子序列，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列和聚腺苷酸化信號序列；(c)將步驟(a)中的腺病毒DNA-TP複合物和步驟(b)中的粘粒載體共轉染表達E1區基因的宿主細胞；(d)篩選陽性克隆；(e)從陽性克隆中分離純化重組腺病毒。
在附圖中，

圖1.人GM-CSF cDNA序列圖2.人GM-CSF雙順反子融合基因及其編碼蛋白序列圖3.pShuttle-CMV穿梭載體物理圖譜圖4.pAdEasy-1腺病毒載體的物理圖譜圖5.細菌內同源重組產生重組腺病毒示意圖在本發明中，術語「粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列(GM-CSF)」指天然存在的或人工合成的GM-CSF編碼序列，該編碼序列可以編碼天然形式的GM-CSF，也可以編碼各種變異形式的GM-CSF(例如GM-CSF的保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體，或其活性片段)，只要該變異形式的GM-CSF具有GM-CSF的生物活性。
在本發明中，術語「粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒」指含有GM-CSF編碼序列以及表達所需元件的序列組件，表達所需的組件包括啟動子和聚腺苷酸化信號序列。此外，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒還可以含有或不含有其他序列，其中包括但並不限於增強子、分泌信號肽序列等。較佳地， 在粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒含有雙拷貝或多拷貝的GM-CSF編碼序列。一種實現雙拷貝表達的方法是利用IRES序列將GM-CSF的cDNA進行串聯融合，從而實現雙拷貝表達。
在本發明中，術語「細胞表面受體分子」指在哺乳動物細胞(尤其是樹突狀細胞、B細胞、單核細胞或其他與免疫有關的細胞)的細胞表面上，可用作抗體結合位點的分子。代表性的例子包括各種CD分子，例如CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子等。CD40是一種主要表達於樹突狀細胞、B細胞、單核細胞等細胞表面的膜分子，在其對應的配體分子CD40L左右下，介導細胞活化信號。
在本發明中，可以適用於人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒的啟動子可以是任何一種常見的啟動子，它可以是組成型啟動子或誘導型啟動子。較佳地，該啟動子是組成型的強啟動子，例如巨細胞病毒啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子等其它適用於真核表達的啟動子。
在本發明中，可供使用重組腺病毒可以是任何一種血清型的腺病毒，較佳地，為了防止在製備過程產生親本的複製型腺病毒，宜採用E1區缺失型腺病毒。更佳地，使用E1區和E3區都缺失的腺病毒。此外，宜採用已研究得較為透徹的腺病毒類型，例如Ad2和Ad5型腺病毒。
下面詳細描述本發明的可用於臨床的複製缺陷型人GM-CSF重組腺病毒和相關藥物組合物(製劑)的製備過程和方法。
1、腺病毒的病毒生物學和分子生物學特性腺病毒是一種無包膜的DNA病毒，病毒顆粒呈正二十面體，直徑為80-90nm。腺病毒主要有三種結構蛋白六鄰體，構成20面體的表面；五鄰體，位於蛋白質外殼中的12個頂角；纖維蛋白，每個五鄰體上的一條纖維突起。
腺病毒基因組為雙螺旋線性雙鏈DNA，約有36000個鹼基對(bp)，在兩端結合有55kDa末端肽(Terminal peptide，TP)。傳統上將病毒基因組劃分100個基因圖距單位(mu)，1mu相當360bp。基因組兩端各有一個約100bp的末端倒置反向重複DNA序列(ITR)。在基因組左端載有病毒包裝信號。基因組分為早期轉錄區(分為E1-E4)和晚期轉錄區(分為L1-L5)，每個轉錄區在病毒生活周期中都起重要作用。此外，還有幾個小的中間區和晚期區。
人腺病毒有近50種血清型，其中Ad2和Ad5基因組結構和基因表達的研究較為廣泛和深入，現已確定這兩型腺病毒的全部核苷酸序列，目前構建的腺病毒載體大多源於這兩種血清型。
腺病毒基因組中的E1區，在病毒基因組一進入宿主細胞核中即被激活，從而編碼起始因子，調節病毒的早期活動，因此E1區為病毒複製所必需。
E2區編碼的蛋白與病毒DNA的複製有關，包括病毒DNA末端結合蛋白(TP)，DNA結合蛋白(DBP)和DNA聚合酶，DBP與轉錄調控有關。
E3區編碼的多肽與病毒逃避宿主抗病毒免疫反應有關，比如，E3編碼的一個19kDa糖蛋白，可抑制I類主要組織相容性抗原(MHC)提呈到感染細胞表面，使細胞毒性T淋巴細胞(CTL)不能有效識別和殺傷感染細胞；此外，E3編碼的10.4kDa、24.5kDa、14.7kDa蛋白可抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)的細胞毒作用。E3區缺失對腺病毒的感染性無明顯影響。
E4區編碼產物參與病毒DNA複製、晚區基因表達、病毒蛋白合成和宿主蛋白合成終止等活動。主要晚期基因產物是病毒結構蛋白，而由pIX編碼的小結構蛋白，有助於大於34kb的基因組包裝。
腺病毒通過經介導吸附和介導內吞的兩種不同受體而進入宿主細胞。病毒先通過纖維蛋白與未知的某種受體結合從而吸附到細胞表面。介導病毒內吞入內體(endosomes)的受體已被鑑定為αv整合素(αv integrins)。在內吞過程中，內體的酸化引起病毒外殼蛋白構象改變，從而導致病毒衝破內體進入胞漿，進一步在外殼蛋白的核靶向信號引導下進入細胞核。E1區編碼的蛋白質首先上調自身表達和激活其他早期區基因表達，8小時後，病毒DNA開始複製，隨後晚期蛋白表達並在感染細胞核中進行子代病毒顆粒的裝配。腺病毒可抑制宿主細胞DNA的轉錄和翻譯，而促進自身的蛋白合成。被感染約30-40小時後，宿主細胞溶解，釋放出子代病毒顆粒。臨床上，腺病毒一般可引起上呼吸道感染、角結膜炎、胃腸炎、肺炎、支氣管炎、肝炎和膀胱炎，多數為輕度的自限性疾病。近20年來，腺病毒口服活疫苗已被廣泛使用，從使用過的一千多萬人的結果來看，療效顯著且無明顯的毒副作用。
2、腺病毒載體的特點基因轉移技術和導入途徑是影響基因治療效果的重要因素。雖然逆轉錄病毒載體仍是目前基因轉移和基因治療中應用最廣的載體系統，具有穩定整合表達等優點，但它只能感染分裂期的細胞，感染效率較低，一般不能用於體內(in vivo)途徑，臨床應用中難免受到限制。
腺病毒載體是繼逆轉錄病毒載體後在基因治療方面應用開發得較早的一種基因載體，由於其本身的特點及載體系統不斷改進，近年來在基因治療中得到日益廣泛的應用。腺病毒載體首先應用於纖維囊性變(Cystic Fibrosis，CF)和a1抗胰蛋白酶缺陷型肺氣腫的基因治療，現廣泛應用於其他疾病的治療，如嗜血桿菌A和B、Duehene肌營養不良、家族性膽固醇血病、血管成形術後動脈再狹窄、表面活性蛋白B缺乏、紅細胞生成素缺陷和各種腫瘤，顯示其具有良好的應用前景和開發價值。1995年，美國食品與藥品管理局(FDA)批准腺病毒介導的p53基因療法進入臨床，試用於晚期腫瘤病人的治療，收到顯著療效，且無明顯的毒副作用。
腺病毒載體具有以下幾個特點①其宿主範圍廣，感染率高，包括靜息細胞和終末細胞；②病毒的滴度高，可達109～1010空斑形成單位(pfu)/ml，由於其理化性質較穩定，可以通過沉積、柱層析或超離心純化獲得高滴度病毒載體；③腺病毒無胞膜，對補體介導的滅活作用不敏感，體內更穩定；④目前應用的腺病毒載體多為Ad2和Ad5，對齧齒動物無致瘤性，臨床上通常僅引起輕度的上呼吸道反應，甚至對於免疫抑制病人亦如此；⑤腺病毒通常不整合入宿主細胞基因組內，適用於基因的短期表達，理論上講就不會引起宿主細胞的插入突變，比逆轉錄病毒更為安全。
3、腺病毒載體的構建策略目前的腺病毒載體大多來源於腺病毒Ad2和Ad5這兩種血清型。適用於基因治療應用的腺病毒載體屬於複製缺陷型病毒。由於E1編碼的蛋白功能是其他所有腺病毒基因有效表達所必須的，因此最常見的策略就是用外源DNA替代病毒E1區序列，通過包裝細胞反式提供E1區序列而產生的複製缺陷腺病毒載體。
可用於本發明的宿主包裝細胞是可以表達腺病毒E1區基因的任何宿主細胞，因為該細胞能夠提供複製缺陷型腺病毒複製所需的E1區基因表達產物。一種優選的常用包裝細胞是293細胞，該細胞由人胚腎細胞經Ad5腺病毒DNA片段轉化而成，載有整合入細胞基因組的腺病毒E1區等病毒基因片段，並持續表達E1區蛋白，能為E1區置換型腺病毒載體提供反式補償。
利用E3區缺失不影響病毒感染性，切去E3區可增加載體外源性DNA容量。切去E1和E3區，外源基因插入容量可達約8kb。而克隆更大的外源DNA片段則需切去其他的病毒序列，缺失的功能再通過互補細胞系或輔助病毒反式提供。
本發明的重組腺病毒的方法可以用多種方法產生，其中主要有以下四種共轉染入互補細胞系通過體內同源重組而產生重組腺病毒的方法更為常用，更佳地是用COS/TPC共轉染同源重組法產生的。
(1).細胞外病毒DNA直接連接法(也稱Stow方法)此法是選d1309腺病毒基因組在3.7mu(E1區內)的XbaI限制內切酶點，切斷和分離3.7-100mu病毒基因組大片段(稱XbaI片段)，然後將載有外源DNA的腺病毒基因組的最左端0-1.3mu，用連接酶連到XbaI大片段上。連接產物可用於轉染293細胞以製備重組腺病毒。
(2).細胞內病毒DNA同源性重組與Stow方法很類似，將載有外源DNA的腺病毒基因左端0-1.3/9.8-16mu片段與XbaI大片段同時轉染到293細胞內，通過同源性重組來製備病毒載體。
(3).細胞內質粒DNA同源重組此法利用質粒的形式，將腺病毒基因組DNA的倒置末端相連形成環狀，能在細菌內複製，從而簡化了XbaI大片段的製備手續。環狀腺病毒DNA由於細菌質粒插入其總基因組長度超過包裝限度，在細胞內不會被包裝成病毒顆粒，僅提供病毒DNA同源重組的所需片段。構建E1替代型腺病毒載體時，首先將外源DNA插入細菌質粒(如pΔElsp1A)中，該質粒含腺病毒基因組左端序列(包括ITR、包裝信號和部分缺失的E1區)。含外源DNA的穿梭質粒與含腺病毒基因組其餘序列的DNA共轉染293細胞，通過體內的同源重組產生重組腺病毒。這種含其餘序列、用於同源重組的腺病毒基因組DNA可有不同的形式，或是通過體外經限制性內切酶消化無感染性的病毒DNA，或者來源於重組質粒pJM17或pBHG系列質粒。該方法目前較為常用，但缺點是重組效率還不構理想。
(4).COS/TPC共轉染同源重組腺病毒DNA的兩端各共價結合有一個55kDa的末端肽(Terminal peptide，TP)，結合有末端肽的腺病毒DNA導入允許細胞後產生的空斑數是裸腺病毒DNA的100倍以上(Horwitz M.FundamentalVirolgy，2nd edition，edited by Fields B et al.Raven Press，Ltd.NewYork，1991；771)，表明TP的存在對腺病毒DNA的感染能力有著重要的影響。Miyake等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996，931320)首先採用含有TP的腺病毒DNA-TP複合物(TPC)進行同源重組，建立了COS/TPC同源重組法製備重組腺病毒，並且證明該法的重組效率可提高近百倍，而且幾乎不產生親代病毒。
(5).細菌內同源重組將穿梭載體與腺病毒DNA共轉化至具有重組能力的細菌，如BJ5183，通過細菌內的同源重組，產生重組腺病毒DNA載體，然後通過293細胞的包裝，獲得重組腺病毒。該方法的優點是省時、高效。
在本發明的一個優選實施例中，應用細菌內同源重組法來製備複製缺陷型人GM-CSF重組腺病毒載體，具體過程如下首先將人GM-CSF雙順反子插入穿梭載體pShuttle-CMV，置於巨細胞病毒(CMV)啟動子的控制之下，通過與腺病毒DNA載體pAdEasy-1在細菌BJ5183中的同源重組獲得GM-CSF的重組腺病毒載體，最後通過293細胞的包裝獲得人GM-CSF的複製缺陷性重組腺病毒，滴度達8.67×1010pfu/ml；並證明了所製備的人GM-CSF重組腺病毒體外能有效表達人GM-CSF(100～900ng/106細胞/24h)。在此基礎上，與抗腺病毒和CD40的雙特異性抗體偶聯，製備CD40靶向性的人GM-CSF重組腺病毒。
在製得本發明的人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子重組腺病毒之後，就可以將所需純度的重組腺病毒與任選的生理上可接受的載體、賦形劑、或穩定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.，Ed.，)，以凍幹形式或水溶液形式進行混合，可以製得本發明的重組腺病毒的治療製劑。可接受的載體、賦形劑或穩定劑對接受者而言在所用的劑量和濃度下應是無毒的，並且可含有緩衝液如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸緩衝液；抗氧化劑如維生素C；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子如鈉；和/或非離子型表面活性劑如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。作為例子，水和生理鹽水就可作為本發明重組腺病毒製劑中的載體。
本發明製備的靶向性的複製缺陷型人GM-CSF重組腺病毒具有巨大的應用價值和優勢，主要體現在以下幾方面(1).體外感染腫瘤細胞(如B淋巴瘤等)，製備GM-CSF基因轉染的腫瘤瘤苗，進行腫瘤的主動免疫治療，腫瘤細胞可來源於腫瘤患者的新鮮瘤體標本或腫瘤細胞株。
(2).體外靶向性感染經腫瘤抗原刺激的抗原提呈細胞(如樹突狀細胞或巨噬細胞)，進行腫瘤的主動免疫治療，其中樹突狀細胞可從患者的外周血單核細胞或CD34+造血幹細胞擴增。
(3).體外感染自體皮膚成纖維細胞等載體細胞，藉助於載體細胞將GM-CSF導入機體，促進造血恢復。
(4).作為佐劑與抗原一起注射，增強免疫效果。
(5).通過瘤體內或感染部位直接注射GM-CSF重組腺病毒等體內途徑直接導入體內，用於腫瘤、感染等疾病的治療。
(6)治療成本低，比直接注射GM-CSF進行治療低至少50％，較佳地可低至少80％。
(7)注射次數稍少，通常只需數周(如1-2周)注射一次，從而減少了進行注射治療的痛苦，並便於使用。
(8)通過感染細胞而在細胞內較長時期地局部表達GM-CSF，與生理條件下生物體局部分泌GM-CSF的情況更為接近，從而可高效和長期地發揮GM-CSF的功效(尤其在需要局部施用GM-CSF的場合，如腫瘤治療時)。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，比如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1.人GM-CSF cDNA的克隆通過RT-PCR從活化的人T淋巴細胞中擴增人GM-CSF cDNA。首先用人T細胞分離柱(Biotex公司)從健康人外周血中分取T細胞，體外經有絲分裂原ConA(10μg/ml，Sigma公司)刺激培養24小時後，用Trizol試劑(Gibco公司)提取細胞總RNA；用AMV逆轉錄酶(Promega公司)合成cDNA第一鏈，以其為模板進行PCR擴增。
PCR擴增採用的上遊引物和下遊引物序列為5』cggaattctagaccaccATGTGGCTGCAGAGCCTG 3』(SEQ ID NO4)5』cgggatccTCACTCCTGGACTGGCTCCC 3』(SEQ ID NO5)在上遊引物中設計了EcoRI和XbaI位點，下遊引物中設計了BamHI位點。所擴增產物包括人GM-CSF的全部編碼序列，預計大小為456bp。PCR反應體積為50μl，其中引物濃度為0.3μM，擴增參數為94℃1』、58℃1』、72℃2』，20個循環後產物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產物經EcoRI和BamHI酶切後，定向克隆至pGEM-3Z載體(Promega公司)，連接產物轉化大腸桿菌DH5α(Stratagene公司)，得到的重組載體記為pGEM-hGM，用M13-21和SP6引物進行全自動測序(ABI373，PE公司)。經測序分析，所擴增到的人GM-CSFcDNA序列完全正確，包含全部編碼序列(圖1，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
實施例2.IRES cDNA的克隆以質粒pIRES-hrGFP(Stratagene公司)為模板進行PCR擴增。上遊引物為5』gg GGA TCC cgg GAC GAC TGC ATA GGG TTAC(SEQ ID NO6)，其中設計了BamHI位點；下遊引物為5』gGAA TTC CTG CAG CCA TTA TCA TCG TGTTTTTC(SEQ ID NO7)，其中設計了EcoRI位點；所擴增產物預計大小為620bp。PCR反應體積為50μl，其中引物濃度為0.3μM，擴增參數為94℃1』、52℃1』、72℃2』，25個循環後產物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產物經EcoRI和BamHI酶切後，定向克隆至pBluescript II-KS載體(Stratagene公司)，連接產物轉化大腸桿菌DH5α(Stratagene公司)，得到的重組載體記為pKS-IRES，用T7和T3引物進行全自動測序(ABI373，PE公司)。經測序分析，所擴增到IRES序列完全正確(對應於圖2中間小寫字母部分)(SEQ ID NO3)。
實施例3.雙拷貝人GM-CSF融合基因的構建首先從pGEM-hGM載體中切出GM-CSF的XbaI/BamHI片段，插入pKS-IRES，使GM-CSF cDNA位於IRES的上遊，得到重組載體pKS-GM-IRES；再從pGEM-hGM載體中切出GM-CSF的EcoRI/SalI片段，插入pKS-GM-IRES，使該GM-CSFcDNA位於IRES的下遊，這樣得到GM-CSF雙拷貝融合基因，重組載體命名為pKS-GM-DC，融合基因序列及其編碼胺基酸見圖2。
實施例4.雙拷貝人GM-CSF腺病毒載體的構建所採用的腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV購自Stratagene公司，含有Ad5腺病毒的左右同源臂，其中含有多個供外源基因插入的克隆位點(圖3)。從pSK-GM-DC載體中切出雙拷貝GM-CSF融合基因的NotI/XhoI片段，克隆至pShuttle-CMV的NotI/XhoI位點，連接產物轉化DH5α菌，得到重組腺病毒穿梭載體pShuttle-GM-DC。
重組腺病毒穿梭載體pShuttle-GM-DC經PacI線性化和去磷酸化處理後，取1μg與100ng的pAdEasy-1載體(Stratagene公司，圖4)混合，電穿孔法共轉化BJ5183感受態細菌(Stratagene公司)，經BJ5183細菌的同源重組(圖5)，得到GM-CSF的重組腺病毒，陽性克隆經PacI酶切鑑定後，記為pAd.GM-DC。
陽性克隆pAd.GM-DC進一步轉化XL-10感受態細菌(Stratagene公司)，進行DNA的大量擴增。用高濃度肉湯TB培養基500～1000ml大量擴增陽性克隆菌，鹼裂法抽提粘粒DNA，溶於4ml TE中，加入44.4g CsCl(Gibco公司)、0.4ml溴化乙錠(10mg/ml)混合，置5ml離心管(Beckman)梯度離心(VTi65.1轉頭，55,000rpm，20℃，16h)，收集超螺旋條帶，用等體積Butanol(Sigma)抽提4～6遍，4℃下用TE透析過夜，或直接加入3倍體積無菌去離子水、8倍體積無水乙醇，於4℃沉澱DNA(3～5小時)，乾燥後DNA溶於無菌TE，用分光光度計檢測其濃度和純度。
實施例5.重組腺病毒的包裝重組腺病毒DNA載體pAd.GM-DC經磷酸鈣DNA共沉澱法轉染293細胞(ATCC公司)，經胞內包裝產生人GM-CSF重組腺病毒(圖5)。轉染前一天，待轉染的293細胞更換新鮮培養基。於500μl體積中將5μg經PacI線性化處理的重組腺病毒載體pAd.GM-DC、CaCl2(終濃度為0.25M)混合後，加入500μl的2×BBS緩衝液(50mM BES(N，N-bis(2-hydroxyethl)-2-aminoethane-sulfonicacid)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4(pH6.95))，混合後置室溫作用10～20分鐘，逐滴加入293細胞，置37℃、5％CO2培養12～24小時。將共轉染的293細胞與未經轉染的293細胞按1∶1、1∶10和1∶100等不同比例混合，分別接種至96孔培養板(100μl/孔)，此後的第4天和第8天各補加DMEM培養基(50μl/孔)。於轉染後的第12~14天，收集陽性克隆孔的細胞及其培養液，超聲破碎後的病毒上清為第一代種子病毒(1st seed)，於-80℃保存。第一代種子病毒用病毒上清(10μl/孔)感染24孔培養板中的293細胞，每個克隆設2個復孔；3～4天收集一個復孔的細胞行細胞基因組DNA的酶切分析，另一復孔中的細胞經超聲破碎後收集病毒上清，為第二代種子病毒(2nd seed)，留作擴增用。結果，在轉染的12～14天，在1∶10的96孔培養板中收集到病變死亡的293細胞克隆95個，經酶切鑑定得到雙拷貝GM-CSF的重組腺病毒克隆。
實施例6.重組腺病毒的擴增、純化與滴度檢測酶切鑑定正確的重組克隆的第二代種子病毒上清(2nd seed)，用於感染293細胞擴增病毒，3～4天後，超聲破碎細胞，離心去除細胞碎片，病毒上清經CsCl梯度離心(25,000rpm，4℃，2h)，濃縮的病毒液進行第二次CsCl梯度離心(35,000rpm，4℃，3h)純化，最後將收集病毒液對含10％甘油的PBS緩衝液透析過夜，過濾除菌後分裝，速凍保存於-80℃。
以293細胞為靶細胞、用微量細胞病變法檢測病毒滴度。96孔板中先加入50ml培養液/孔，前8孔加入25ml經104稀釋的病毒液，開始行3倍的倍比稀釋，共11個稀釋度，每一稀釋度設8復孔，每孔加50μl 293細胞，FCS的終度為5％，同時設細胞對照，此後第4天和第8天分別補加50μl含10％FCS的DMEM培養基，12～14天後判定結果。對其中的一個陽性克隆進行擴增，所擴增的人GM-CSF重組腺病毒滴度為7.67×1010pfu/ml。用注射用水稀釋、分裝成5×1010pfu/ml，保存於-80℃。
該腺病毒被命名為「雙拷貝表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC」，2001年4月11日保藏於中國典型培養物保藏中心(中國，武漢)，保藏編號為CCTCC No.V200103。
實施例7.抗腺病毒和人CD40分子雙特異性抗體的製備小鼠抗Ad5腺病毒纖維蛋白(fiber)單抗1D6.14和抗人CD40單抗G28.5分別從其雜交瘤細胞株(ATCC公司)的培養上清中，經Protein A(Pharmacia公司)親和層析純化製備後，用木瓜蛋白酶(Pierce公司)消化、Protein A(Pharmacia公司)親和層析純化抗體的Fab片段。這兩種單抗的Fab片段用N-succinimidyl 3-(2-pyridldithio)propionate(SPDP)偶聯，製備得到抗Ad5腺病毒和人CD40的雙特異性抗體。具體方法參照文獻(Production ofbispecific antibodies.in Current Protocols in Immunology，New York，1997；p2.13.1)。
實施例8.CD40靶向性腺病毒的製備GM-CSF重組腺病毒中加入10ng/106pfu雙特異性抗體，於4℃孵育1小時，雙特異性抗體通過其抗腺病毒的結合位點與GM-CSF重組腺病毒結合，而其中的抗CD40的結合位點仍然預留著，能與細胞膜表面的人CD40分子特異性結合，這樣就製備成功CD40靶向性的人GM-CSF重組腺病毒，記為Ad.GM-CSF/CD40。
實施例9.人GM-CSF重組腺病毒的體外表達用重組人GM-CSF和IL-4(Sigma公司)培養人外周血單核細胞，製備樹突狀細胞。收集培養第7天的人樹突狀細胞，棄培養液、洗兩遍後，按不同的重複感染度(Multiplicity of Infection，MOI)加入雙拷貝的人GM-CSF的重組腺病毒或CD40靶向性的雙拷貝人GM-CSF重組腺病毒，1小時後洗棄病毒液，加入正常培養液，48小時後收集培養上清，用ELISA試劑盒(美國RD公司)檢測GM-CSF含量，以ng/106細胞/24小時表示。
表1.GM-CSF重組腺病毒感染人樹突狀細胞後分泌GM-CSF水平分組 GM-CSF水平(ng/106細胞/24h)MOI＝5 MOI＝20 MOI＝100LacZ對照腺病毒未檢出 未檢出 未檢出Ad.GM-DC 49±4.5 163±18 359±13Ad.GM-CSF/CD40106±11 472±16 889±45檢測結果表明，未感染腺病毒樹突狀細胞的培養上清中未檢測出GM-CSF(＜5pg/ml)，CD40靶向性的雙拷貝人GM-CSF重組腺病毒(Ad.GM-CSF/CD40)感染樹突狀細胞後，能比雙拷貝的人GM-CSF的重組腺病毒(Ad.GM-DC)產生更高水平的人GM-CSF(100-800ng/106細胞/24h)，而且GM-CSF的表達水平與感染時的MOI值呈正相關，表明所製備的CD40靶向性人GM-CSF重組腺病毒能更有效介導人樹突狀細胞的基因轉移與表達，在樹突狀細胞介導的免疫治療中具有應用價值。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海華康生物技術有限公司120靶向性、高表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒及其製法和用途1300119751607170PatentIn version 3.02101211456212DNA213Homo sapiens220221CDS222(16)..(450)4001gaattctaga ccacc atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc act gtg51Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val1 5 10gcc tgc agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc acg cag 99Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln15 20 25ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac147Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn30 35 40ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc195Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile45 50 55 60tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg243Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu65 70 75gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc291Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly
80 85 90ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc339Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr95 100 105ccg gaa act tcc tgt gca acc cag act atc acc ttt gaa agt ttc aaa387Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys110 115 120gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag435Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu125 130 135 140cca gtc cag gag tga ggatcc 456Pro Val Gln Glu2102211144212PRT213Homo sapiens4002Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile1 5 10 15Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His20 25 30Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp35 40 45Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe50 55 60Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys65 70 75 80Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met85 90 95Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
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1.一種靶向性的、表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒，其特徵在於，該腺病毒的基因組缺失E1區和E3區，並且在E1區位置插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒，該表達盒依次包括啟動子序列，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列和聚腺苷酸化信號序列，而且，在腺病毒表面結合有雙特異性抗體，該抗體既特異性地針對腺病毒表面的結合位點，又特異性地針對細胞表面的受體分子。
2.如權利要求1所述重組腺病毒，其特徵在於，該腺病毒為Ad5型腺病毒；且所述的受體分子選自下組CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
3.如權利要求1所述的重組腺病毒，其特徵在於，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒中所含的啟動子序列包括選自下組的真核表達啟動子巨細胞病毒啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子。
4.如權利要求1所述的重組腺病毒，其特徵在於，在表達盒中有雙拷貝的人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
5.如權利要求4所述的重組腺病毒，其特徵在於，該腺病毒是重組5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC No.V200103。
6.一種藥物組合物，其特徵在於，它包括有效量的權利要求1所述的靶向性的、表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒和藥學上可接受的載體或賦形劑。
7.如權利要求6所述的藥物組合物，其特徵在於，該重組腺病毒為Ad5型腺病毒，且所述的受體分子選自下組CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
8.如權利要求7所述的藥物組合物，其特徵在於，該腺病毒是表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC No.V200103。
9.一種製備靶向性的、表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒的方法，其特徵在於，該方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP複合物，在該腺病毒DNA基因組缺失E1區和E3區，並且在腺病毒基因組DNA的兩端結合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因組的粘粒載體，在該粘粒載體中的腺病毒基因組缺失了E1區和E3區，並且在E1區位置插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒，其中該表達盒依次包括啟動子序列，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列和聚腺苷酸化信號序列；(c)將步驟(a)中的腺病毒DNA-TP複合物和步驟(b)中的粘粒載體共轉染表達E1區基因的宿主細胞；(d)篩選陽性克隆；(e)從陽性克隆中分離純化重組腺病毒。(f)將步驟(e)中的腺病毒與雙特異性抗體結合，該抗體既特異性地針對腺病毒表面的結合位點，又特異性地針對細胞表面的受體分子，從而獲得靶向性的、表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，在步驟(c)中共轉染方法是磷酸鈣DNA共沉澱轉染法，該宿主細胞是293細胞，而且人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒中所含的啟動子序列選自下組巨細胞病毒啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子；所述的受體分子選自下組CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子；表達盒中有雙拷貝的人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
全文摘要
本發明提供了一種新的靶向性的、高效表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒,該重組腺病毒的製備方法和用途,以及含有該重組腺病毒的藥物組合物。將這種新的重組腺病毒用於臨床,具有成本低、使用方便、效率高等優點,尤其適用於腫瘤、感染性疾病的免疫治療等其它GM－CSF適應症。
文檔編號A61P31/00GK1381582SQ0110597
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月13日 優先權日2001年4月13日
發明者王建莉 申請人:上海華康生物技術有限公司