通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法

2023-06-07 17:51:51

專利名稱：：通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法
技術領域：
：本發明屬於植物組織培養
技術領域：
，具體是一種通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法。
背景技術：
：臺灣金線蓮(Anoectochilusformosa皿sHayata)是一種瀕危珍稀的藥用植物。藥用全草，素有"藥王"之稱，是我國傳統的珍貴藥材。其性平味甘，具有清熱涼血、祛風利溼的功效，主治咯血、支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、風溼性關節炎、小兒急驚風、毒蛇咬傷等。2005版中國藥典尚未對金線蓮進行收載。臺灣金線蓮是一種前景可喜的中藥免疫增強劑，並具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抗誘變等作用，受到國內外學者的高度重視。自然條件下臺灣金線蓮種子難以萌發(萌發率低於5%)。臺灣金線蓮植株矮小，根系不發達，再生能力差。臺灣金線蓮由種子到開花需要34年，常需與某些真菌共生才能萌發，很難有實生苗栽培。而傳統的分株扦插等無性繁殖方式的成活率低、生長速度慢、繁殖率低，加之近年來人們對野生臺灣金線蓮資源的掠奪式採挖，其生境被嚴重破壞，致使野生臺灣金線蓮瀕臨滅絕。目前，國內外學者開展了對野生臺灣金線蓮的初步研究，包括化學成分，藥理活性，人工種植等方面的研究，研究成果不多。而臺灣金線蓮的培養主要集中在組織誘導、基本培養條件篩選和理化因子的考查等方面。還沒有找到一個切實有效地培養技術用以解決臺灣金線蓮誘導和增殖中存在的疑點和難點，從而影響了臺灣金線蓮的深入研究和應用。天然臺灣金線蓮已作為瀕臨滅絕的植物種受到保護，嚴禁採摘。為此研究臺灣金線蓮的人工培養技術，實現產業化顯得十分重要。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種繁殖速度快，總黃酮含量高的通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法。本發明的目的是這樣實現的一種通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理選擇68月份生長的的臺灣金線蓮(Anoectochilusformosa墜Hayata)野生植物，除去根和葉進行清洗和無菌處理，將莖段剪成O.51.5cm帶莖節的臺灣金線蓮小段組織；b、叢生芽誘導培養將經過無菌處理後的臺灣金線蓮小段組織在誘導培養基中進行組織誘導培養叢生芽，培養周期1060天，培養溫度1035t:，光照時間024小時/天，光照強度0100iimol/m2*s;所述的誘導培養基為H培養基+蔗糖1050g/L+a-萘乙酸0.13.Omg/L+6-節氨基嘌呤0.15.0mg/L，pH值為5.07.0;c、大規模培養將誘導出的叢生芽在大規模培養基中進行大規模培養，培養周期1060天，培養溫度1035"，光照時間024小時/天，光照強度0100iimol/m2*s;所述的大規模培養基為B5培養基+蔗糖1050g/L+瓊脂410g/L+活性炭0.15.Og/L+a-萘乙酸0.13.Omg/L+6-節氨基嘌呤0.15.Omg/L，pH值為5.07.0。作為本發明通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法更優化的技術方案，對培養基的配方比例和培養條件進行優化選擇。所述的叢生芽誘導培養培養周期2050天，培養溫度203(TC，光照時間816小時/天，光照強度50100iimol/m2s;所述的誘導培養基為H培養基+蔗糖2040g/L+a-萘乙酸1.02.Omg/L+6-節氨基嘌呤2.03.Omg/L，pH值為5.56.5;所述的大規模培養培養周期2050天，培養溫度203(TC，光照時間816小時/天，光照強度50100iimol/m2s;所述的大規模培養基為B5培養基+蔗糖2040g/L+瓊脂68g/L+活性炭2.03.Og/L+a-萘乙酸1.02.Omg/L+6-節氨基嘌呤2.03.Omg/L，pH值為5.56.5。植物體的的無菌處理是本發明的重要技術環節，無菌處理的方法包括如下步驟a)將選取的臺灣金線蓮植株，用自來水衝洗乾淨除去根和葉，再用蒸餾水衝洗，置超淨工作檯內；b)將除去了根和葉的莖段植物體用7080%的酒精浸泡2040秒進行表面滅菌，再用無菌水清洗乾淨；c)將經過酒精滅菌的莖段植物體用0.30.8%次氯酸鈉溶液浸泡消毒36分鐘，用無菌水衝洗45次，再用濾紙吸乾無菌水；d)無菌條件下將氯酸鈉消毒的莖段剪成0.51.5cm帶莖節的小段。本發明的優點在於該方法易操作，生產成本低，不汙染環境，可以實現批量生產。選用配方合理的誘導培養基，誘導出的叢生芽比例達到98%以上，通過兩段培養的方式再生植株產量大幅度提高，和野生臺灣金線蓮比較總黃酮含量提高5倍以上。通過本發明方法生產臺灣金線蓮，不變性，產量大，成本低，周期短，極具市場競爭力。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。實施例1:一種通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理a)選擇7月份生長的的臺灣金線蓮(Anoectochilusformosa皿sHayata)野生植物，用自來水衝洗乾淨除去根和葉，再用蒸餾水衝洗，置超淨工作檯內；b)將除去了根和葉的莖段植物體用75%的酒精浸泡30秒進行表面滅菌，再用無菌水清洗乾淨；c)將經過酒精滅菌的莖段植物體用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒5分鐘，用無菌水衝洗5次，再用濾紙吸乾無菌水；d)無菌條件下將氯酸鈉消毒的莖段剪成lcm左右帶莖節的臺灣金線蓮小段；b、叢生芽誘導培養將經過無菌處理後的臺灣金線蓮小段組織在誘導培養基中進行組織誘導培養叢生芽，培養周期30天，培養溫度28。C，光照時間24小時/天，光照強度100iimol/m2s;所述的誘導培養基為H培養基+蔗糖45g/L+a-萘乙酸2.Omg/L+6-苄氨基嘌呤2.5mg/L，pH值為5.0;c、大規模培養將誘導出的叢生芽在大規模培養基中進行大規模培養，培養周期45天，培養溫度28t:，光照時間24小時/天，光照強度100ymol/m2s;所述的大規模培養基為B5培養基+蔗糖15.Og/L+瓊脂4.5g/L+活性炭2.Og/L+a-萘乙酸1.Omg/L+6-苄氨基嘌呤2.Omg/L，pH值為5.0。實施例2:—種通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理a)選擇8月份生長的的臺灣金線蓮(Anoectochilusformosa皿sHayata)野生植物，用自來水衝洗乾淨除去根和葉，再用蒸餾水衝洗，置超淨工作檯內；b)將除去了根和葉的莖段植物體用78%的酒精浸泡28秒進行表面滅菌，再用無菌水清洗乾淨；c)將經過酒精滅菌的莖段植物體用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡消毒4分鐘，用無菌水衝洗4次，再用濾紙吸乾無菌水；d)無菌條件下將氯酸鈉消毒的莖段剪成lcm左右帶莖節的臺灣金線蓮小段；b、叢生芽誘導培養將經過無菌處理後的臺灣金線蓮小段組織在誘導培養基中進行組織誘導培養叢生芽，培養周期40天，培養溫度25"，光照時間15小時/天，光照強度80iimol/m2s;所述的誘導培養基為H培養基+蔗糖35g/L+a-萘乙酸1.8mg/L+6-苄氨基嘌呤3.0mg/L，pH值為6.0;c、大規模培養將誘導出的叢生芽在大規模培養基中進行大規模培養，培養周期40天，培養溫度3(TC，光照時間15小時/天，光照強度50Pmol/m2s;所述的大規模培養基為B5培養基+蔗糖22g/L+瓊脂7.0g/L+活性炭3.0g/L+a-萘乙酸2.Omg/L+6-苄氨基嘌呤3.Omg/L，pH值為6。實施例3:對野生臺灣金線蓮、實施例1和實施例2培養得到的臺灣金線蓮再生植株總黃酮進行檢測，具體檢測方法包括如下步驟(1)對照品溶液的製備精密稱取乾燥至恆重的蘆丁對照品9.9mg，置5mL容量瓶中，加乙醇溶解並定容至刻度，搖勻，得濃度為1.98mg*mL—1的蘆丁對照品溶液，備用。精密量取對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置25mL帶刻度試管中，加水補至5mL;加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，混勻，放置6分鐘；加10%硝酸鋁溶液1.0mL，放置6分鐘；加4%氫氧化鈉溶液lO.OmL，加水定容至刻度，混勻，放置15分鐘。於510nm波長處測定吸光度。以吸光度(A)對濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程A=0.0097C+0.0037(r=0.9999)。蘆丁檢測濃度在7.9279.20iig/mL範圍內線性關係良好。(2)供試品溶液的製備臺灣金線蓮試管苗經乾燥後粉碎，過80目篩，稱取0.25g，置索氏提取器中，加20mL石油醚提取3小時，棄去石油醚提取液，藥渣晾乾，用20mL70%乙醇回流提取3次，每次1小時，合併提取液，旋轉蒸發至小體積，用70%乙醇定容至10mL，作為供試品溶液，備用。(3)測定方法精密量取供試品溶液3mL，置25mL帶刻度試管中，按對照品的測定方法於510nm波長處測定樣品的吸光度。通過該方法對野生臺灣金線蓮與兩個實施例樣品檢測結果如下野生臺灣金線蓮與兩個實施例總黃酮含量的比較檢測對象總黃酮含量(mg/g)野生臺灣金線蓮3.30實施例1樣品18.50實施例2樣品18.53試驗結果證明，採用本發明的方法生產的臺灣金線蓮試管苗比野生臺灣金線蓮的總黃酮含量高出5倍左右。實施例4:採用MS培養基、B5培養基和本發明的誘導培養基分別對經過無菌處理後的臺灣金線蓮小段組織在誘導培養基中進行組織誘導培養叢生芽，試驗結果如下不同培養基誘導比較tableseeoriginaldocumentpage6試驗結果證明，採用本發明的誘導培養基對過無菌處理後的臺灣金線蓮小段組織進行誘導培養，叢生芽鮮重和誘導率顯著提高。實施例5:分別採用單純的誘導培養基、單純的大規模培養基和本發明的誘導培養基+大規模培養基兩步法培養方法，進行組織培養生產臺灣金線蓮試驗，除了培養基和培養周期不同以外，其它試驗條件與實施例1相同，試驗結果如下採用不同方式的培養基對臺灣金線蓮產量的影響tableseeoriginaldocumentpage6試驗證明，採用本發明的通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法比單純使用誘導培養基培養、單純使用大規模培養基培養產量增加12倍。權利要求一種通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理選擇6～8月份生長的的臺灣金線蓮野生植物，除去根和葉進行清洗和無菌處理，將莖段剪成0.5～1.5cm帶莖節的臺灣金線蓮小段組織；b、叢生芽誘導培養將經過無菌處理後的臺灣金線蓮小段組織在誘導培養基中進行組織誘導培養叢生芽，培養周期10～60天，培養溫度10～35℃，光照時間0～24小時/天，光照強度0～100μmol/m2·s；所述的誘導培養基為H培養基+蔗糖10～50g/L+α-萘乙酸0.1～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值為5.0～7.0；c、大規模培養將誘導出的叢生芽在大規模培養基中進行大規模培養，培養周期10～60天，培養溫度10～35℃，光照時間0～24小時/天，光照強度0～100μmol/m2·s；所述的大規模培養基為B5培養基+蔗糖10～50g/L+瓊脂4～10g/L+活性炭0.1～5.0g/L+α-萘乙酸0.1～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值為5.0～7.0。2.按照權利要求1所述的通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法，其特徵在於所述的叢生芽誘導培養培養周期2050天，培養溫度203(TC，光照時間816小時/天，光照強度50100iimol/m2*S;所述的誘導培養基為H培養基+蔗糖2040g/L+a-萘乙酸1.02.Omg/L+6-苄氨基嘌呤2.03.Omg/L，pH值為5.56.5;所述的大規模培養培養周期2050天，培養溫度203(TC，光照時間816小時/天，光照強度50100iimol/m2*s;所述的大規模培養基為B5培養基+蔗糖2040g/L+瓊脂68g/L+活性炭2.03.Og/L+a-萘乙酸1.02.Omg/L+6-節氨基嘌呤2.03.Omg/L，pH值為5.56.5。3.按照權利要求1或2所述的通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法，其特徵在於植物體的無菌處理方法包括如下步驟a)將選取的臺灣金線蓮植株，用自來水衝洗乾淨除去根和葉，再用蒸餾水衝洗，置超淨工作檯內；b)將除去了根和葉的莖段植物體用7080%的酒精浸泡2040秒進行表面滅菌，再用無菌水清洗乾淨；c)將經過酒精滅菌的莖段植物體用0.30.8%次氯酸鈉溶液浸泡消毒36分鐘，用無菌水衝洗45次，再用濾紙吸乾無菌水；d)無菌條件下將氯酸鈉消毒的莖段剪成0.51.5cm帶莖節的小段。全文摘要本發明公開了一種通過組織培養生產臺灣金線蓮的方法，它包括植物體的選擇及無菌處理、叢生芽誘導培養和大規模培養三個環節，其技術的關鍵在於導培養和大規模培養兩個階段採用了兩種不同的培養基，誘導培養基為H培養基+蔗糖10～50g/L+α-萘乙酸0.1～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值為5.0～7.0；大規模培養基為B5培養基+蔗糖20～40g/L+瓊脂6～8g/L+活性炭2.0～3.0g/L+α-萘乙酸1.0～2.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L，pH值為5.5～6.5。該方法易操作，生產成本低，產量高，品質好，不汙染環境，可以實現批量生產。文檔編號A01H4/00GK101715732SQ20101000076公開日2010年6月2日申請日期2010年1月19日優先權日2010年1月19日發明者賈景明申請人:煙臺匯鵬生物科技有限公司