丹參素在製備治療腦血管疾病的藥物中的應用的製作方法
2023-06-07 23:27:51
專利名稱：丹參素在製備治療腦血管疾病的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及丹參素在製備治療腦血管疾病的藥物中的應用。
背景技術：
隨著人口老齡化進程的加速以及生活方式的改變，腦血管疾病已成為一個全球性的健康問題，腦血管意外的死亡率在世界範圍居第2位，極大的危害人民的健康。新型有效的防治腦血管病藥物的開發已是臨床亟需。
丹參素為中藥丹參的水溶性成分，具有擴張血管、增加冠脈血流量、抗血栓形成等作用，為複方丹參滴丸、丹參注射液等的有效成分。
丹參素結構式中藥丹參廣泛的應用於心腦血管疾病治療，大量的文獻資料報導了丹參對心肌缺血、腦缺血以及再灌注損傷的保護作用韓暢，王孝銘，張國義.丹參對缺血和再灌注損傷心肌脂質過氧化和局部血流量的影響.哈爾濱醫科大學學報.1990，24(4)262～267；徐洪濤，陳士良，李蘭蓀.丹參對冠狀動脈狹窄時左心室舒張功能的影響中西醫結合雜誌，1990，10(12)737～739；鄭若玄，方三曼，韓寶銘.丹參水提物對化學引起大白鼠心肌缺血的保護作用.中西醫結合雜誌.1990，10(10)609～611；陶月玉，郭松鐸，盧步峰，等.複方丹參對缺血心肌磷脂肌醇代謝的影響.中國中西醫結合雜誌.1993，13(6)354～355；李承珠等報導了丹參素的抗凝血作用李承珠，楊詩春，趙鳳娣.丹參素抗凝血作用的研究.中西醫結合雜誌.1983，3(5)297-299；李躍華等報導了丹參素對實驗性肝損傷的保護作用李躍華，吳翠貞，闕玲莉.丹參素增強肝細胞生長及其在藥物性肝細胞損傷中的保護作用.南京醫科大學學報.1996，16(4)346～348；李菁，李躍華，薛隆翠等丹參素對實驗性肝細胞損傷的防護作用.中西醫結合肝病雜誌.1996，6(3)29～30；匡培根等研究發現丹參可能通過影響HSP70的表達從而對局灶性缺血再灌注損傷具有保護作用匡培根，吳衛平，劉軍，等.局灶性缺血再灌注時丹參對熱休克蛋白70的影響—免疫細胞化學及病理學研究.卒中與神經疾病.1995，3(2)61～64。但關於丹參素在體內具有治療腦血管疾病的作用未見報導；鑑於此，本發明人通過大量的實驗研究，發現丹參素具有治療腦血管疾病的醫藥用途。
發明內容
本發明提供了丹參素在製備治療腦中風的藥物中的應用。
本發明提供了丹參素對腦缺血、NMDA受體誘導腦神經細胞損傷的保護作用。
本發明提供了丹參素在製備治療腦缺血/再灌注損傷的藥物中的應用。
本發明提供了丹參素在製備治療腦外傷的藥物中的應用。
本發明提供了以丹參素為活性成分的用於治療腦血管疾病的藥物組合物。
本發明所述的丹參素在用於上述任一用途時，其使用劑量範圍為10mg～1000mg/天，優選劑量範圍為100mg～500mg/天。
本發明中使用的丹參素按文獻鄧喜玲，陳學敏.丹參素的合成和藥理作用.農墾醫學.2002，24(5)362～364所述方法製備。
本發明中使用的丹參素可以單獨使用或以藥物組合物形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的丹參素及藥用載體，該藥物組合物含有50mg～200mg單位劑量的丹參素和藥用載體，優選為含有50mg～100mg單位劑量的丹參素和藥用載體。該藥物組合物可以通過口服、舌下、經皮、經肌肉或皮下、皮膚黏膜、靜脈途徑給藥。藥物組合物可以以粉針劑、注射液、片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸或口服液的形式存在。本發明所提供的各種藥物劑型均可以以藥學常規方法製備而成。
本發明人通過下列試驗證實了丹參素具有治療腦血管疾病的作用，下面的實施例用來更詳細的說明本發明，但並不意味著本發明僅限於此。試驗所用的丹參素由山東省天然藥物工程技術研究中心現代中藥研究室按文獻鄧喜玲，陳學敏.丹參素的合成和藥理作用.農墾醫學.2002，24(5)362～364所述方法製備，經HPLC檢測含量＞95％。
具體實施例方式
製備例1丹參素凍乾粉針的製備精密稱取丹參素原料20.0g及藥用甘露醇40.0g，溶於1000ml注射用水中，充分攪拌使溶解，補加注射用水至2000ml，加入針用活性碳2.0g，加熱至60℃攪拌30分鐘，碳棒過濾，濾液經0.25μm微孔濾膜過濾除菌，分裝於1000支西林瓶中，裝量2.0ml/支，冷凍乾燥，即得。每支含丹參素20mg。
製備例2丹參素注射液的製備精密稱取丹參素原料20.0g，溶於1000ml注射用水中，充分攪拌使溶解，補加注射用水至2000ml，加入針用活性碳2.0g，加熱至60℃攪拌30分鐘，碳棒過濾，濾液經0.25μm微孔濾膜過濾除菌，分裝於1000支西林瓶中，裝量2.0ml/支，封口，滅菌，即得。每支含丹參素20mg。
試驗例1丹參素對N-甲基-D-門冬氨酸所致大鼠神經細胞損傷的保護作用(1)材料丹參素按文獻鄧喜玲，陳學敏.丹參素的合成和藥理作用.農墾醫學.2002，24(5)362～364所述方法製備，用時以生理鹽水稀釋至合適濃度。多聚賴氨酸為Sigma公司產品。DMEM培養基為Gibco公司產品；其餘試劑均為分析純。
實驗動物普通級Sprague Dawley大鼠18隻，♂，體重250g-280g，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供，合格證號魯動質字200106005號。
(2)方法(2.1)神經細胞原代培養懷孕15d大鼠水合氯醛麻醉，75％乙醇消毒胸腹部，在無菌條件下取出胎鼠，剝出，分離兩側皮層組織，用手術刀切成糜狀，移入含0.125％胰蛋白酶的磷酸緩衝液中消化30min(37℃)後棄去消化液，加入含10％胎牛血清，10％馬血清，100μ/ml青黴素，100μ/ml鏈黴素的DMED培養液，用小口徑吸管反覆吹打分散，200目細胞篩過濾後，以DMEM調整細胞濃度至106個/ml，接種至預先塗有0.01％多聚賴氨酸的35mm培養皿中，每皿2ml，置CO2培養箱中37℃孵育，於培養第3天在培養液中加入細胞分裂抑制劑阿糖胞普儲備液(6μl/皿)以抑制非神經元細胞的過度增殖，作用48h後換新鮮培養液，以後每周換液2次，每次更換半量液。
(2.2)NMDA誘導神經細胞損傷細胞培養至d14後，隨機分正常對照組，NMDA 50μmol·L-1組， 丹參素組(10、100μmol·L-1)；各組換以含不同藥物的低血清DMEM(5％胎牛血清，5％馬血清，30mmol·L-1HEPES)繼續培養6h，再加50mmol·L-1NMDA，孵育12h後按文獻閻超華，馮亦璞.丁基苯酞對低糖低氧誘導的大鼠皮層神經細胞損傷的保護作用.藥學學報.1998，33(7)486-492.所述方法觀察細胞形態，計算細胞死亡率。
(2.3)統計學處理數據用x±SD表示，組內給藥前後、組間均以參比差值法(ANOVA)進行統計學處理。
(3)結果(3.1)對培養神經細胞形態變化的影響正常神經細胞培養至d14時，生長良好，胞體呈錐形、梭形或三角形，突觸粗而長，呈樹根狀交織成網；當細胞在含50μmol·L-1NMDA的培養基中孵育12h時，細胞出現腫脹、輪廓模糊，神經元突觸斷裂、消失、甚至細胞崩解；如細胞同時與10、100μmol·L-1丹參素孵育，則細胞損傷程度明顯減輕，細胞形態基本保持完整，但細胞密度有所降低，仍可見突觸斷裂等現象；表明丹參素對NMDA誘導的大鼠神經細胞損傷有顯著的保護作用。
(3.2)對培養神經細胞死亡率的影響神經細胞在含50μmol·L-1NMDA的培養基中孵育12h後，臺盼藍染色著色細胞明顯增多(NMDA 50μmol·L-1組86％vs正常對照組10％，P＜0.001)，提示細胞死亡率增加；於培養基中同時加入10、100μmol·L-1丹參素(分別為38％、24％)可明顯降低細胞死亡率，與NMDA50μmol·L-1組相比有顯著差異。
試驗例2丹參素對大鼠局部腦缺血導致神經細胞損傷的影響(1)材料丹參素注射劑按製備例1方法製備。紅四氮唑美國Sigma公司產品，臨用前用生理鹽水配成4％溶液。實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重280g-350g，山東省天然藥物工程技術研究中心動物實驗中心提供。合格證號魯動質字200106005號。
(2)方法與結果動物隨機分為假手術組(等容量溶劑)，模型對照組(等容量溶劑)，尼莫地平組(Nim，1.5mg/kg)，丹參素1mg/kg組，丹參素5mg/kg組，丹參素10mg/kg組，丹參素25mg/kg組，丹參素50mg/kg組，丹參素100mg/kg組，每組10隻。禁食12小時後，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分離右側頸總動脈，夾閉頸內、頸總動脈，頸外動脈近心端及遠心端結紮，中間剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內動脈成一條直線，將栓線(選用直徑0.24mm尼龍線，長度5.0cm)由頸外動脈插入至顱內，遇輕微阻力時停止，插入深度約為2cm。結紮頸外動脈開口，並打開頸總動脈動脈夾，消毒縫合傷口，造成左側大腦中動脈缺血模型；假手術組僅進行右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈的分離(以上實驗均在23℃～25℃進行)。術後各組動物靜脈注射相應藥物(給藥體積1ml/200g)。24小時後按文獻劉小光，徐理納，一種能評價溶栓和抗溶栓的大鼠腦中動脈模型，藥學學報，1995，30662所述方法及標準觀察並記錄大鼠的行為障礙(A)提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面，計為0分，如手術對側前肢出現腕屈曲計為1分，肘屈曲計為2分，肩內旋計為3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩內旋者，計為4分。(B)將動物置於平地面上，分別推雙肩向對側移動，檢查阻力。如雙側阻力對等且有力，計為0分，如向手術對側推動時阻力下降者，根據下降程度不同分為輕、中、重三度，分別計為1，2和3分。(C)將動物雙前肢置一金屬網上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者計為0分。同樣根據手術對側肌張力下降程度不同計為1，2和3分。(D)動物有不停地向一側轉圈者，計為1分。根據標準評分，滿分為11分，分數越高，表示動物行為障礙越嚴重。
行為評分後處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦幹，冠狀切成5片，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，正常組織經染色後呈紅色，梗塞組織呈白色，染色後照相，用中國航空航天大學病理圖像分析軟體求梗塞面積比。數據用X±s表示，以組間t檢驗進行統計學處理。
結果如表1所示，缺血24小時後，大鼠表現出明顯的行為障礙，大鼠腦組織也出現明顯的灶狀缺血區，達到全腦的25％左右；給予不同劑量的丹參素，動物行為障礙有不同程度的減輕，大鼠腦缺血區也有明顯好轉，且呈劑量依賴性。
丹參素50mg/kg抗腦缺血作用強於25mg/kg(P＜0.05)，但是與100mg/kg比較無明顯差別(P＞0.05)。提示當劑量≥50mg/kg時，藥效並沒有繼續增加。
表1 丹參素對大鼠局部腦缺血損傷的影響(χ±SD，n＝10)
與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與50mg/kg組比較ΔP＜0.05，#P＞0.05。
試驗例3丹參素對大鼠腦缺血/再灌注導致神經細胞損傷的影響
(1)材料丹參素注射劑按製備例2方法製備。紅四氮唑美國Sigma公司產品，臨用前用生理鹽水配成4％溶液。實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重280g-350g，山東省天然藥物工程技術研究中心動物實驗中心提供。合格證號魯動質字200106005號。
(2)方法與結果動物隨機分為假手術組(等容量溶劑)，模型對照組(等容量溶劑)，尼莫地平組(Nim，1.5mg/kg)，丹參素1mg/kg組，丹參素5mg/kg組，丹參素10mg/kg組，丹參素25mg/kg組，丹參素50mg/kg組，丹參素100mg/kg組，每組10隻。禁食12小時後，按實驗例1所述方法造成左側大腦中動脈缺血；術後10min各組動物靜脈注射相應藥物(給藥體積1ml/200g)。缺血2小時後，抽出尼龍線，造成大鼠腦缺血/再灌注損傷；再灌24h後處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦幹，冠狀切成5片，腦片置10％福馬林中固定，經脫水、浸蠟、包埋、切片等步驟後，製成8um厚的組織切片，甲苯胺藍染色，選擇每隻大鼠視交叉與漏鬥柄連線中點處按文獻劉小光，馮亦璞.丁基苯酞對局部腦缺血大鼠行為和病理改變的保護作用.藥學學報.1995，30(12)896-903所述方法用細胞計數器進行細胞計數，細胞核消失、細胞體暗染作為神經元壞死的指標，計算壞死神經元數佔總神經元數的百分比。
數據用x±SD表示，組內給藥前後、組間均以參比差值法(ANOVA)進行統計學處理。
結果顯示，模型對照組大鼠神經元周圍間隙擴大，出現散在的暗染神經元，神經細胞出現不同程度的皺縮。給予丹參素組動物有不同程度的減輕。我們以相同切面的腦片半影區來進行細胞計數。由表2可見，不同劑量丹參素治療組皮層、紋狀體神經元壞死百分比明顯減少，與模型對照組比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。
丹參素50mg/kg抗腦缺血/再灌損傷作用強於25mg/kg(P＜0.05)，但是與100mg/kg比較無明顯差別(P＞0.05)。提示當劑量≥50mg/kg時，藥效並沒有繼續增加。
表2丹參素對局部腦缺血大鼠神經元壞死百分比的影響(χ+SD，n＝10)
與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與50mg/kg組比較ΔP＜0.05，#P＞0.05。
試驗例4丹參素對小鼠閉合性腦外傷的保護作用(1)材料丹參素注射劑按製備例2方法製備。清潔級昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山東省天然藥物工程技術研究中心動物實驗中心提供。合格證號魯動質字200106003號。
(2)方法與結果取小鼠80隻，隨機分為正常對照組(等容量溶劑)，模型對照組(等容量溶劑)，丹參素2mg/kg組，丹參素10mg/kg組，丹參素20mg/kg組，丹參素50mg/kg組，丹參素100mg/kg組，丹參素200mg/kg組，每組10隻。按文獻王超雲，蔣王林，智紅英，等.黃芩苷對腦損傷的保護作用.中草藥，2004，35(2)188～190所述方法造成小鼠閉合性腦外傷模型，各組靜脈給藥，24小時後剝取鼠腦，稱量溼重，70℃烘乾24小時，稱乾重，計算腦含水量；腦含水量高於正常值表示腦部水腫。
結果如表3所示，閉合性腦外傷造成小鼠腦嚴重水腫，給予不同劑量的丹參素，小鼠腦水腫有不同程度的減輕，且呈劑量依賴性。
丹參素100mg/kg降低腦水腫作用強於50mg/kg(P＜0.05)，但是與200mg/kg比較無明顯差別(P＞0.05)。提示當劑量≥100mg/kg時，藥效並沒有繼續增加。
表3丹參素對閉合性腦外傷的影響(χ±SD，n＝10)
與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與100mg/kg組比較ΔP＜0.05，#P＞0.05。
試驗例5丹參素急性毒性試驗(1)材料丹參素注射劑按製備例1製備。清潔級昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山東省天然藥物工程技術研究中心動物實驗中心提供。合格證號魯動質字200106003號。飼料由中國藥品生物製品鑑定檢驗所提供。
(2)方法根據預試驗設計給藥劑量並分組空白對照組、100mg/kg、150mg/kg、225mg/kg、337.5mg/kg、506.25mg/kg、759.375mg/kg、1139.0625mg/kg組，共8組，每組10隻。稱重後，按0.2ml/10g的體積靜脈注射，對照組給予等體積溶劑。給藥後密切觀察小鼠的毒性反應和7天內死亡情況，並按改進寇氏法測定LD50。
(3)結果丹參素注射劑的LD50為688.7±78.6mg/kg；LD50的95％可信限589.2～729.5mg/kg。
權利要求
1.丹參素在製備治療腦血管疾病的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，丹參素在製備治療缺血性腦中風的藥物中的應用。
3.根據權利要求1所述的應用，丹參素在製備治療NMDA受體誘導腦神經細胞損傷的藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，丹參素在製備治療由腦缺血或腦缺血再灌注引起的NMDA受體誘導腦神經細胞損傷的藥物中的應用。
5.根據權利要求1所述的應用，丹參素在製備治療腦缺血或腦缺血再灌注的藥物中的應用。
6.根據權利要求1所述的應用，丹參素在製備治療腦外傷的藥物中的應用。
7.根據權利要求1～6任一所述的應用，丹參素的使用劑量範圍為10mg～1000mg/日。
8.根據權利要求7所述的應用，丹參素的使用劑量範圍優選為100mg～500mg/日。
9.一種用於治療腦血管疾病的藥物組合物，其特徵在於含有50mg～200mg的丹參素和藥用載體。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於含有50mg～100mg的丹參素和藥用載體。
全文摘要
本發明提供了丹參素在製備治療腦血管疾病的藥物中的應用，具體地涉及丹參素在製備治療缺血性腦中風的藥物中的應用，丹參素在製備治療NMDA受體誘導腦神經細胞損傷的藥物中的應用，丹參素在製備治療腦缺血或腦缺血再灌注的藥物中的應用，丹參素在製備治療腦外傷的藥物中的應用。本發明還提供了含有丹參素的用於腦血管疾病的藥物組合物，其單元劑量為50－200mg。
文檔編號A61K31/185GK1701787SQ20051007039
公開日2005年11月30日 申請日期2005年5月9日 優先權日2004年5月24日
發明者田京偉, 王超雲, 孫芳, 張太平, 蔣王林, 傅風華 申請人:山東綠葉天然藥物研究開發有限公司