外源性乳酸菌株用於預防與內氏放線菌有關的疾病的用途的製作方法

2023-06-08 06:41:36 4

專利名稱：外源性乳酸菌株用於預防與內氏放線菌有關的疾病的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及摻入到口腔微生物區系中的外源性乳酸菌株，其可調節內氏放線菌的定居並減輕與內氏放線菌有關的疾病的嚴重程度。
背景技術：
口腔(口腔)含有定居和非-定居的微生物區系。前者包括能夠在口腔表面或多或少建立永久居所的微生物。這些細菌主要集中在舌，口腔黏膜和牙齒上，而牙齦，唇，頰，顎及口腔底部僅有非常稀少的微生物區系生長。
牙菌斑是一層在牙齒表面形成的膜，其由細胞外多糖和唾液產物的基質中的細菌細胞組成。牙齒長出後，立即被無定形的唾液層覆蓋，所得釉質表膜(AEP)約厚1.3μm，且不會通過普通的刷牙而除去。AEP形成之後，細菌立即在牙齒上沉積，且在8-12小時內，牙菌斑由於其多層結構而變得明顯。第一層由主要通過特異性粘附-受體識別而粘附在牙齒上的細菌(最早定居的細菌)組成；它為通過類似的特異性結合或通過簡單並列而相互粘附的第二層定居細菌建立了基礎。
在舌和頰黏膜上，天然的定居微生物區系包括選自鏈球菌屬，韋榮氏球菌屬，擬桿菌屬和嗜血菌屬的微生物。在牙齒上，鏈球菌屬和放線菌屬佔優勢，但也可找到各種革蘭氏陽性和陰性球菌及桿菌。
這些微生物大多數均是無害的共生體，但其中許多已經被認為是相當多疾病的病原體(Hill，M.J.和Marsh，P.D.編輯Human MicrobialEcology，1990，CRC出版社，Boca Raton Florida，USA)。
特別是，內氏放線菌基因種1(原來為內氏放線菌)和2(原來為粘放線菌)是人牙菌斑的共有成員。它們是形成牙菌斑的最強口腔菌株，這是因為它們具有堅固地粘附牙齒並與許多其它細菌種類共同聚集的能力，因此在口腔中建立了它們的居所。此外，在稍晚的時候，通常可在根齲處將它們分離出來，且據信它們是這種疾病的主要病原體(Bowden，G.H.等，1999，源於釉質及牙齒健康和齲根表面的樣品中的內氏放線菌基因種1和2主要核糖型的差異和分布，J.Dent.Res.78，1800-1809)。
暫居微生物區系包括臨時存在於口腔中，但不會建立永久居所(即使反覆口服給予這些細菌)的外源性細菌。所有的食用細菌，特別是乳酸菌是這種暫居微生物區系的一部分。
這些外源性乳酸菌的一部分已經顯示出能夠粘附牙齒的表膜。例如，WO 00/09080(Sociétédes Produits Nestlé)公開了不是口腔定居微生物區系一部分的乳酸菌株，其低度酸化且能夠直接粘附牙齒的表膜。這些細菌特別用於治療或預防由生齲微生物，如變異鏈球菌和表兄鏈球菌所引起的齲齒及牙周感染。
外源性細菌還可產生抑制口腔中定居微生物區系生長的因子。例如EP759469(Sociétédes Produits Nestlé)描述了由變化微球菌產生的細菌素用於抑制口腔病原體表兄鏈球菌，血鏈球菌，變異鏈球菌和粘放線菌發展的用途。細菌素的應用也是所研究戰略其中之一，可用於減少齲齒。這些分子作為預期的抗齲藥劑和在調節口腔微生物定居中發揮重要作用的因子吸引了人們的興趣。
值得注意的是，現有技術沒有提供任何有關下面這種菌株的信息，即該菌株可通過直接粘附於牙齒表膜而在口腔中定居，並產生因子，如生長抑制因子，從而調節內氏放線菌的定居，減輕與內氏放線菌有關的疾病的嚴重程度。
發明概述因此，本發明的目的是提供對於口腔微生物區系是外源性的乳酸菌在製備用於減少哺乳動物牙菌斑並治療或預防根齲或其它與內氏放線菌有關疾病的組合物中的用途，其中所述乳酸菌具有粘附牙齒表面並產生生長抑制因子的能力。
所述乳酸菌可選自嗜熱鏈球菌，乳酸乳球菌乳亞種，和乳酸乳球菌乳亞種biovar diacetylactis，特別是可選自菌株CNCMI-1984，CNCMI-1985，CNCMI-1986，CNCMI-1987。
因此，通過在牙齒表膜定居並產生生長抑制因子，這種乳酸菌可顯著減少內氏放線菌的程度，從而減少牙菌斑，根齲及其它與內氏放線菌有關的感染。
本發明的另一個目的是提供一種通過減少內氏放線菌的定居而保持口腔健康的組合物，所述組合物含有一種外源性細菌，其具有粘附牙齒表面並產生生長抑制因子的能力。
這種組合物至少含有104-109cfu/g的乳酸菌。
本發明還提供一種預防或治療哺乳動物與內氏放線菌有關的感染，特別是牙菌斑程度及根齲的方法，該方法包括給予哺乳動物至少含一種乳酸菌株的組合物的步驟，其中所述乳酸菌株具有粘附牙齒表面並產生生長抑制因子的能力，所述組合物可減少內氏放線菌的定居。
發明詳述在下列描述中，將所述口腔定義為人或動物，如寵物的口腔，其包括口腔黏膜(牙齦，唇，頰，顎和口腔底部)，舌和牙齒(包括人造結構)。
將術語「生長抑制因子」定義為任何由粘附的外源性乳酸菌產生的細胞外物質，其可使外源性乳酸菌抑制內氏放線菌的生長。
本發明的第一個目的涉及外源性乳酸菌在製備用於減少牙菌斑並治療或預防根齲或其它與內氏放線菌有關疾病的組合物中的用途，其中所述乳酸菌具有粘附牙齒表面並產生生長抑制因子的能力。
所述乳酸菌可選自嗜熱鏈球菌，乳酸乳球菌乳亞種，和乳酸乳球菌乳亞種biovar diacetylactis，特別是可選自菌株嗜熱鏈球菌(NCC 1529)(CNCMI-1984)，嗜熱鏈球菌(NCC 1561)(CNCMI-1985)，乳酸乳球菌乳亞種(NCC 2211)(CNCMI-1986)，乳酸乳球菌乳亞種biovar dioacetylactis(NCC 2225)(CNCMI-1987)。
所述乳酸菌優選是乳源性(即，來源於奶或奶酪)的。
本發明的乳酸菌是「低度酸化」的，也就是說它比病原菌的酸化程度要小。因此，它可使口腔的pH值約為5.5-7。
這些菌株是在具有粘附於牙齒表膜能力的乳酸菌株中選擇的，它們的最佳生長溫度約為37℃，這是口腔的溫度。它們還能夠產生生長抑制因子，這一點與它們的粘附性結合，可使它們顯著降低內氏放線菌基因種1和2的定居程度。
此外，它們能夠發酵葡萄糖和蔗糖，且不合成生齲菌株的致病因子——葡聚糖。
還可將至少一種乳酸菌株與細菌素聯合使用。
所述乳酸菌株可包括在食品，寵物食品，化妝用或藥用組合物中。因此，這些組合物優選牙膏，漱口水，口香糖，噴霧劑，飲料，糖果，嬰兒代乳品，冰淇淋，冷凍甜食，甜色拉調味品，奶製品，奶酪，夸克，酸乳酪，酸奶，咖啡酪或生奶油。
所用外源性乳酸菌的量至少為104-109cfu/g。
在口腔微生物區系中摻入上述細菌的作用是在大鼠模型中測試的。菌株CNCMI-1985和CNCM-1986能夠調節口腔微生物的生態學，顯著減少總CFU數。特別是，所述菌株能夠顯著降低已感染大鼠的內氏放線菌基因種2的定居程度(見實施例)。
所選菌株的生化特性發酵模式用api 50 CH bioMerieux帶試驗(bioMérieux SA，69280Marcy-l′Etoile，法國)對49種單糖進行測試，結果在表1中給出。
表1.乳酸乳球菌CNCMI-1987(A)，乳酸乳球菌CNCMI-1986(B)，嗜熱鏈球菌CNCMI-1984(C)，嗜熱鏈球菌CNCMI-1985(D)的糖發酵。
+，++，+++，++++表示3，6，24或48小時後開始發酵所述菌株嗜熱鏈球菌(NCC 1529)，嗜熱鏈球菌(NCC 1561)，乳酸乳球菌乳亞種(NCC 2211)，乳酸乳球菌乳亞種biovar dioacetylactis(NCC2225)是根據布達佩斯條約，於1998年3月3日，在位於法國巴黎25ruedu docteur Roux，75724的國立微生物保藏中心(保藏號分別為CNCMI-1984，CNCMI-1985，CNCMI-1986和CNCMI-1987)保藏的。
本發明的第二個主要目的涉及一種通過減少哺乳動物中內氏放線菌的定居而保持口腔健康的組合物，所述組合物含有一種外源性的乳酸菌，其具有粘附牙齒表面並產生生長抑制因子的能力。
這些組合物特別用於預防或治療牙菌斑及與內氏放線菌感染有關的疾病，如根齲。
本發明的乳酸菌株選自嗜熱鏈球菌，乳酸乳球菌乳亞種和乳酸乳球菌乳亞種biovar diacetylactis，優選菌株CNCMI-1984，CNCMI-1985，CNCMI-1986和CNCMI-1987。
這種組合物可至少含有104-109cfu/g的乳酸菌。
此外，還可通過加入至少一種細菌素而製備協同組合物，其具有抗革蘭氏陽性口腔細菌的活性。如果是這樣的話，所述口腔衛生組合物含有佔組合物重量0.00001-50％，優選0.00001-15％的純細菌素。所述細菌素優選variacin(EP 0 759 469)。
為了防止所述組合物降解，還可含有油溶性抗氧化劑。適宜的抗氧化劑包括「維生素E」，丁基-羥基茴香醚(BHA)，丁基-羥基甲苯(BHT)，和棕櫚酸抗壞血酸酯。所述油溶性抗氧化劑的量佔組合物重量的0.005％-0.5％，優選0.005％-0.01％。
用於本發明牙膏組合物的適宜研磨劑包括碳酸鈣，鋁矽酸鈣，氧化鋁，水合氧化鋁，正磷酸鋅，塑料顆粒，和二氧化矽，二氧化矽是優選的研磨劑。
本發明組合物所具有的pH值是口腔可接受的，且不會損害所述乳酸菌的活性。該pH值為3.0-9.5，優選3.5-6.5。
這些組合物可通過常規方法製備，該方法包括將所述成分以適當的相對量混合在一起，最後，如果需要，調節pH至所需要的值。
內氏放線菌基因種1(原來為內氏放線菌)和2(原來為粘放線菌)是形成牙菌斑的最強口腔菌株。通常可在根齲處將它們分離出來，特別是在40歲以上的人中，據信它們是這種疾病的主要病原體。
因此，本發明還提供一種預防或治療哺乳動物與內氏放線菌有關的感染，特別是牙菌斑程度和根齲的方法，該方法包括給予哺乳動物至少含一種乳酸菌株的組合物的步驟，其中所述乳酸菌株具有粘附牙齒表面並產生生長抑制因子的能力。
所給予的量至少約為104-109cfu/g乳酸菌。
本發明並不局限於此處所述具體實施方案的範圍內。事實上，除此處所述的那些之外，根據前面的描述，本發明的各種改變對於本領域的那些技術人員而言也是顯而易見的。這種改變落在權利要求的範圍之內。此處引證了各種出版物，其公開至理解本發明程度的全部內容均引入此處作為參考。
實施例1體外試驗在體外，將菌株嗜熱鏈球菌NCC 1561(CNCMI-1985)和乳酸乳球菌乳亞種NCC2211(CNCMI-1986)(以下稱為乳酸乳球菌NCC2211)摻入到體外模擬牙菌斑的生物膜中。
口腔菌株內氏放線菌基因種1(原來為內氏放線菌)OMZ745和內氏放線菌基因種2(原來為粘放線菌)OMZ105是從Institute für OraleMikrobiologie und Allgemeine Immunologie，University of Zürich獲得的，且37℃時，在FUM培養基中厭氧培養它們(GasPackSystem，BBL)。
所有菌株均是-20℃時，在甘油中保藏的，且在使用前，在它們特定的最佳溫度下預培養14小時。將兩種所選菌株乳酸乳球菌NCC2211和嗜熱鏈球菌NCC1561接種到體外系統中，使其在唾液-包被的羥基磷灰石盤上生長，其中所述體外系統是一種生物膜，其由通常在40歲以上人的口腔中找到的細菌組成。特別配製所用的生長培養基，即Fluid Universal Medium(FUM)，使其緩衝由所測試菌株產生的酸度，且因此繼續生長(牙菌斑發展)，就像在口腔中一樣(Gmur and Guggenheim，1983)。該試驗是一式三份進行的，平行測試有或沒有乳品菌株的混合物。使用表2所列的菌株。
表2.體外牙菌斑實驗中使用的菌株及適用的培養條件
過程-唾液表膜的形成用800μl人的唾液覆蓋10mm直徑的合成羥基磷灰石盤(HY-APATITE TM，Euro-Crystals，Landgraaf，TheNetherlands)，並在室溫時振蕩培養4小時(在24孔無菌Nunclon平板中，1盤/孔)。
-細菌共生體的製備37℃時，使嗜熱鏈球菌NCC1561，乳酸乳球菌乳亞種NCC2211，表兄鏈球菌OMZ176，口腔鏈球菌OMZ607，內氏放線菌OMZ745，殊異韋榮氏球菌OMZ493和具核梭桿菌OMZ596在FUM-葡萄糖中(嗜熱鏈球菌NCC1561在FUM-乳糖中)厭氧生長過夜，用FUM調節OD550至1，並將2ml各口腔細菌的混懸液與2ml嗜熱鏈球菌NCC1561或乳酸乳球菌乳亞種NCC2211混合。對照混合物僅含5種口腔菌株。
-生物膜的形成和回收所述過程如Guggenheim等在，1998，新生物膜模型的證實，J.Dent.Res.77，(Spec Iss A)110(Abstract#38)中所述。
-生物膜的培養分析在Columbia Blood Agar(5％羊血，BectonDickinson，Meylan Cedex，法國)上螺旋接種所述混懸液，用於計算內氏放線菌的總菌數並分化它。37℃時，厭氧培養該平板48小時。
研究期間口腔菌株與乳品菌株間的生長拮抗作用所用的菌株及培養條件在表3中列出。
表3生長拮抗作用實驗中所用的細菌菌株和培養條件
測試嗜熱鏈球菌NCC1561，嗜熱鏈球菌NCC1536和乳酸乳球菌NCC2211(殺傷菌株)對內氏放線菌OMZ745和粘放線菌OMZ105(靶菌株)的生長拮抗作用。
過程-使殺傷菌株在瓊脂平板上厭氧生長過夜，靶菌株在BHI中生長，直到穩定中期-在3ml BHI軟瓊脂(瓊脂7g/l)中稀釋20μl靶菌株，使其渦旋並將其立即傾注在BHI瓊脂平板上，其中所述BHI軟瓊脂含有葡萄糖和乳糖-室溫固化1小時，然後以十字形式從M17平板劃線殺傷菌株。平行劃線殺傷菌株和單獨作為對照的靶菌株-37℃時，厭氧培養24小時生長拮抗作用是通過十字周圍的抑制暈圈顯示的。
統計學對照組與試驗共生體間的差異是通過Student′st試驗測定的。
結果及討論可將嗜熱鏈球菌NCC1561和乳酸乳球菌NCC2211摻入到S-HA盤上的牙菌斑樣生物膜中，並在其中生長，表4給出40.5小時後它們的總CFU/盤。
表4.摻入到生物膜中的兩種乳品菌株的水平(CFU/盤)。所述值是三次實驗的平均值加它們的標準偏差。
表5和6表示摻入到生物膜中的乳品菌株對口腔物種的作用。當含有嗜熱鏈球菌NCC1561時(表5)，總菌群全面減少，它是由Columbia血瓊脂平板(CBA)上的計數表示的，平板上可見到4種口腔物種。
當把乳酸乳球菌NCC2211引入到口腔菌株共生體中時(表6)，總菌群數顯著減少(CBA上的CFU)。就內氏放線菌OMZ745而言，減少是顯著的(p＝0.021)。如果所述菌株在口腔細菌前被接種到盤上，那麼這種減少更強。
表5.嗜熱鏈球菌NCC1561對口腔菌株共生體的調節(CFU/盤)。
N＝3.*p-值是相對於對照組計算的(*p＜0.05；**p＜0.01)；°p-值是相對於「+NCC1561」治療組計算的(°p＜0.05；°°p＜0.01)。
表6.乳酸乳球菌NCC2211對口腔菌株共生體的調節(CFU/盤)。
N＝3.*p-值是相對於對照組計算的(*p＜0.05；**p＜0.01)；°p-值是相對於「+NCC2211」治療組計算的(°p＜0.05；°°p＜0.01)。
進行一些試驗來證實口腔菌株的減少是否是由於乳品菌株對它們的生長拮抗作用(表7)。菌株粘放線菌OMZ105和嗜熱鏈球菌NCC1536也包括在本試驗中，因為它們是體內模型的一部分(實施例2)。
所有四種乳品菌株均可抑制革蘭氏陰性菌株粘放線菌OMZ105的生長。這種抑制不能被歸因於乳酸的產生。粘放線菌只能在需氧條件下代謝乳酸鹽(van der Hoeven等(1990)Oral Microbiol.Immunol.5，223-225)且它非常耐酸。這些結果已經通過在有1％乳酸存在的情況下，平板接種粘放線菌但沒有觀察到抑制來證實。
表7.嗜熱鏈球菌NCC1561，嗜熱鏈球菌NCC1536和乳酸乳球菌NCC2211對口腔菌株生長的抑制。
結論嗜熱鏈球菌NCC1561和乳酸乳球菌NCC2211可被摻入到模擬牙菌斑的生物膜中，且能夠調節口腔微生物區系，顯著降低總cfu數，特別是，這些菌株能顯著降低內氏放線菌基因種2的定居程度。此外，該菌株還可抑制共培養中內氏放線菌基因種1和2的生長。
實施例2體內試驗體內研究是在大鼠模型上進行的。所選菌株的結合是在整個實驗期間，通過每天餵飼冷的乳製品而持續進行的。
該研究進行了58天。為了在這些天內完成該實驗，必須將所述動物的活躍期整整提前7個小時；這是在第16，17和18天分三個步驟進行的，下面將進一步詳細描述這些步驟。生齲菌株是在第21和22天結合的，而乳品菌株的結合在第23天開始，一直持續到第57天。將乳品菌株作為包含在日常飲食中的酸乳酪基質的添加物餵給動物。在研究最後一天，即第58天，擦拭大鼠的牙齒。
動物及飲食本實驗使用每窩4隻共10窩的Osborne-Mendel大鼠幼仔(the Institutefür Orale Mikrobiologie und Allgemeine Mikrobiologie的動物生產部門，蘇黎士大學，蘇黎士，瑞士)。在實驗開始和結束時，稱重所有的動物。在13天大時，將母鼠和幼仔轉移到沒有墊草的篩-底不鏽鋼籠子中，並給它們提供低.氟化物的粉末狀(0.2μm)Nafag食品，從而防止裂縫嵌塞(Rat Checkers No.184，NAFAG，Gossau SG，瑞士)，且它們可隨意喝到水。大鼠進食的活躍期在晚上，即1800-0600。
為了能在正常的工作時間將食物杯再填滿，在第16-18天之間，每天三次，通過調節自動照明控制器而將大鼠活躍期提前，從而逐步逆轉了它們的晝夜生物節律。
在第16/17天，將活躍期的開始時間從1800提前到1500，即1500-0300是晚上，向前是白天。在第17/18天，將活躍期的開始時間從1500提前到1200，即1200-0000是晚上，從0000向前是白天。
最後，在第18/19天，將活躍期的開始時間從1200提前到1000，即1000-2200是晚上，從2200向前是白天。
因此，在第19天完成了大鼠活躍期從晚上到正常工作時間(1000-2200)的轉換。
在第20天，將母鼠移走，用改進的食品2000a隨意餵飼大鼠，其中所述改進的食品2000a含有40％蔗糖，28％代替脫脂奶(大豆蛋白提取物SVPRO-PP 1611 39.4％，乳糖49.3％，0.6％，L.甲硫氨酸0.3％，L-賴氨酸HCl 0.1％)，24％小麥粉，5％啤酒酵母，2％GevralTM Instant Protein(Whitehall-Robins SA，6301 Zug，Switzerland)和1％NaCl。
在結合期間(第21和22天)，用2％葡萄糖和2％蔗糖補充飲用水，從而幫助植入聯合細菌。在第23天，將這些窩大鼠分成3個治療組，在程序餵飼器中，每個籠子1隻動物，按照表1 0所示，大鼠開始接受試驗食物。所述試驗食物由18種含試驗菌株的酸乳酪組成，其與18種前述改進的食品2000a交替餵飼。
隨時提供飲用水。擦拭過程後，在第58天，通過腹膜內注射而給所述動物提供過量的硫噴妥鈉(100mg/Kg體重)，昏迷時處死它。
細菌菌株使用表8所列的菌株。
表8.本研究中所用的細菌菌株
用於聯合給予的受試LAB菌株的製備為了評估生長參數，特別是為了評估在進一步描述的特定條件下，達到穩定期所需的時間，而進行了初步研究。從而確定了嗜熱鏈球菌生長7小時，乳酸乳球菌生長6小時。通過在冷凍前後平板接種相同的細胞混懸液而研究了冷凍後乳品菌株的生存力。為了與動物結合，按照下列過程處理乳品菌株。
過程-在源於甘油休克的適宜培養基中，接種1％菌株過夜。
-將它們5％從該培養基接種到10批4升在最佳生長溫度預熱過的適宜培養基中，並使它們生長至對數期/開始穩定期結束。
-通過在M17-乳糖瓊脂上平板接種隨機選擇的兩批各含4種的菌株而測定最終的CFU/ml。厭氧過夜培養該平板。
-以6000rpm離心各批培養物10分鐘，並在150ml新鮮的培養基中重懸浮該顆粒狀物；4℃過夜保持。
-再次離心，並在冷凍的培養基(Belliker或M17中15％甘油)中重懸浮。
-等分使含有2×1011有活力的細胞/小瓶，考慮到由於冷凍造成的生存力損失，在-20℃貯藏直到需要。
動物與細菌菌株的結合將動物安排在3個治療組中(表9)。每個治療組由10隻幼仔組成，每個籠子中有1隻動物。
表9.治療的安排
所有大鼠均是在第21和22天用粘放線菌OMZ105首次感染的。
受試LAB菌株(包含在酸乳酪基質的食物中)是從第23天開始，每天結合的。將分別含2×1011個所試菌株有活力細胞的2個冷凍小瓶混合在200ml酸乳酪中，從而至少含有109CFU/ml。將嗜熱鏈球菌NCC1536，一種非S-HA粘附的菌株用作陰性對照。
以20分鐘的時間間隔，每天18次交替提供1ml和400mg的酸乳酪和食品2000a(表10)。因此，每隻動物共接受了18ml的酸乳酪和7.2g的粉末狀食品。
將所述食物分發到程序性餵飼器的食物杯中，從而在準確的時間，自動給動物提供正確的食物。
表10.進食時間
細菌學評估在第58天，擦拭每個治療組中的5隻大鼠。將所述擦拭混懸液平板接種在用於CFU(集落形成單位)計數的培養皿上或固定在用於TCN(總細胞數)計數的免疫螢光載玻片上。
CFU測定過程-用無菌棉棒擦拭大鼠的牙齒，並將棉棒立即放在5ml無菌的0.9％NaCl中-渦旋1分鐘並在50W時超聲處理5秒-在CBA，MS和HJL瓊脂上螺旋接種適當稀釋的混懸液-37℃時培養CBA和MS平板，45℃時培養HJL平板。
TCN測定過程-在24孔載玻片(Dynatech Produkte AG，Embrach Embraport，Switzerland)的各孔上，放置10μl為進行CFU測定而製備的未稀釋的擦拭混懸液，並風乾-在甲醇中浸泡2分鐘固定，並風乾-用10μl在ELISA緩衝液中稀釋的適宜抗體或血清培養(部分4.2.2.5)，並在37℃時培養30分鐘-吸出物分別從孔的側面滴下，並通過先在ELISA緩衝液中，然後在蒸餾水中浸泡而清洗載玻片，風乾-塗10μl 1∶400稀釋的山羊-抗-兔IgG(H+L)-FITC(Sigma)，37℃培養30分鐘-如前所述清洗並風乾-塗49μl封固流體(部分4.2.2.5)，用蓋玻片覆蓋，並用螢光顯微鏡數螢光細胞數統計學數據是用雙向ANOVA((Snedecor and Cochran，1980))處理的。
通過餵飼冷的乳製品而持續結合乳品菌株的結果細菌學評估(表11)-菌株的定居當用非-粘附的嗜熱鏈球菌對照組(NCC1536)補充乳製品時，形成牙菌斑的粘放線菌OMZ105數為1.7(+/-1.1)×107CFU。所述乳品菌株不能通過微生物方法計數。然而，可通過免疫螢光法嘗試定性評估。在治療組2和3的牙菌斑樣品中，可識別出所述三種粘附的乳品菌株。因為它們與其它口腔細菌和口腔殘渣共同聚集，從而產生較大的聚簇，因此不能精確地量化。
-總菌系(TF)的變化與含非-粘附的菌株嗜熱鏈球菌NCC1536的對照組相比，含受試粘附菌株嗜熱鏈球菌NCC1561和乳酸乳球菌NCC2211的三個治療組均可顯著降低CBA上的集落形成單位數(表11)。治療組2可減少CFU數，其顯著性因數PF＜0.01，治療組3可更顯著(PF＜0.001)地減少CFU數。
-用受試菌株調節粘放線菌OMZ105在牙齒上的定居對可形成牙菌斑的粘放線菌OMZ105而言，相對於顯然不太顯著的治療組1，含受試菌株的三個治療組可更顯著減少集落形成單位數(PF＜0.01)(表11)。相反，粘放線菌比總CFU數的百分比沒有顯著性差異。在所有4個治療組中，大約有50％的總CFU被確定為粘放線菌集落。
表11.大鼠總菌系(TF)和粘放線菌OMZ105的集落形成單位的平均值及其各自的百分比(N＝5)。
治療組2-3是與治療組1相比較的。SEM＝平均值的標準誤差；n.s＝不顯著；CBA＝Columbia Blood Agar；MS＝Mitis-salivarius瓊脂；OMZ105粘放線菌基因種2。
在此體內試驗中，所述菌株是每日提供的，其可顯示出對總微生物區系明確的抑制作用，CFU數顯著減少。這種減少可通過乳品菌株對口腔物種的生長拮抗作用來解釋。例如在體外，包括非S-HA粘附的嗜熱鏈球菌NCC1536在內的全部乳品菌株均可抑制粘放線菌OMZ105的生長。然而，在體內，只有S-HA粘附的菌株可顯示出這種作用，這是在與第一組相比的治療組2-4中檢測到的。
特別是，因為已經用粘放線菌OMZ105感染了動物，因此可在實驗結束時量化這種形成牙菌斑的生物體，並可精密監測其CFU的降低。
粘放線菌OMZ105比總CFU數的百分比沒有平行減少，因此推斷也可對其它物種，即韋榮氏球菌顯示生長拮抗作用，因此可觀察到它的全局作用。
所以，菌株CNCMI-1985和CNCM-1986能夠調節已感染大鼠的口腔微生物生態學，顯著降低粘放線菌基因種2的定居程度。
實施例3源於嗜熱鏈球菌NCC1561和嗜熱鏈球菌NCC1536的表面活性劑物質的產生和初步分析42℃時，使嗜熱鏈球菌NCC1561和嗜熱鏈球菌NCC1536在1升Belliker中過夜生長。使用Busscher等，在(1997)Appl.Environ.Microbiol.63，3810-3817，(Busscher等，1997)中描述的過程生產生物表面活性劑。
表面活性劑物質的製備過程-在PBS中洗細胞3次-在200ml蒸餾水或PBS中重懸浮-室溫輕輕攪拌所述混懸液2或4小時，產生生物表面活性劑-以10000rpm離心10分鐘分離細菌-以10000rpm離心上清液10min，共進行2次-冷凍乾燥並稱重顆粒狀物及表面活性劑物質的溶液首先通過SDS-PAGE分析粗的生物表面活性劑混懸液，然後測量表面張力。
SDS-PAGE過程SDS-PAGE是用預製的12.5％ExcelGel(Amersham PharmaciaBiotech)進行的。用Plusone銀染色試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)進行銀染色。
表面張力的測量過程生物表面活性劑混懸液的表面張力是用TVT1 Drop Volume張力計(Lauda，Lauda-Knigshofen，Germany)測量的，該張力計是以液滴體積原理為基礎的。簡單地說，該方法包括準確測定從毛細管滴下的混懸液滴的體積。此體積(臨界體積)與表面張力(σ)成正比，它的值可用下列關係式計算σ＝VgΔρF/2πrcap其中-σ是表面張力-V是液滴的體積-G是加速常數-Δρ是相鄰相的密度差值-F是校正因子-rcap是毛細管的半徑測量是37℃時，一式兩份在空氣中進行的。每次測量均重複10次。釋放6mg/ml粗產品的溶液，使水的表面張力從70降至51mN/m(表13)。所釋放細菌產物的SDS-PAGE分布表明，在溶液中存在多種不同蛋白質性質的物質。
表13.與水和PBS相比，生物表面活性劑混懸液的表面張力值。該值是兩次實驗的平均值，每次實驗均包括十次測量。
結果嗜熱鏈球菌NCC1561和嗜熱鏈球菌NCC1536的細胞能夠釋放具有表面活性劑活性的物質。因此，由嗜熱鏈球菌NCC1561產生的生物表面活性劑可使細菌本身及其它確定接近它的口腔菌株從牙齒表面分離。與之相比，嗜熱鏈球菌NCC1536不能顯示出這種作用，這是因為這種菌株不能粘附牙齒。
實施例4牙膏牙膏是通過將105cfu/ml冷凍乾燥形式的乳酸菌株CNCMI-1984，CNCMI-1985，CNCMI-1986，CNCMI-1987中的至少一種加入到下列混合物1.65％氯化十六烷基銨基吡啶，33.0％山梨糖醇(70％soln)，25.0％甘油，2.0％羧基甲基纖維素鈉，0.25％氟化鈉，26.3％二氧化矽(RP93)，8.1％稠化二氧化矽(Sident 22)，0.5％糖精鈉，3.2％泊咯沙姆(PluronicF108)中製備的。
此牙膏可用於預防或治療根齲，牙菌斑及其它由內氏放線菌種導致的感染。
實施例5酸乳酪將51MRS營養培養基在121℃滅菌15分鐘，然後接種5％體積，約含109cfu/ml嗜熱鏈球菌株CNCMI-1984，CNCMI-1985中至少一種的活性培養物。41℃培養8小時後，得到含4.5.108cfu/ml的起子。
將51含有10％乾燥物質的重構脫脂奶在121℃滅菌15分鐘，然後接種2％約含109細胞/ml的商用增稠嗜熱鏈球菌的活性培養物，其中所述脫脂奶中加入了0.1％的酵母提取物。41℃培養4小時後，得到含4.5.108細胞/ml的起子。
用2％體積的，菌株CNCMI-1984，CNCMI-1985中至少一種的起子，和3％體積的，增稠嗜熱鏈球菌的起子接種一批全脂奶，該全脂奶含有3.7％用2.5％脫脂奶粉強化，然後在90℃巴氏滅菌30分鐘的脂肪。將接種過的奶攪拌，倒在罐中，41℃培養4小時。
所得酸乳酪具有較好的堅實性和平滑的口感，可用於口腔保健。
實施例6口香糖用於預防或治療根齲，牙菌斑或其它與內氏放線菌有關疾病的口香糖是通過將嗜熱鏈球菌株CNCMI-1984，CNCMI-1985至少一種的活性培養物加入到下列代表性成分67.5％木糖醇，20％膠基，5％碳酸鈣，3％甘油，2％Pluronic F127，1％羧甲基纖維，0.5％Balast化合物和1％調味香料中而製備的，它大約含有104-109cfu/g。
實施例7寵物食品組合物用於口腔衛生保健的寵物食品是通過製備飼料混合物而得到的，所述飼料混合物由玉米，玉米麩質，雞肉和魚肉，鹽，維生素和礦物質組成。將所述飼料混合物投入到預處理器中，並使其溼潤。將溼潤的飼料從預處理器中取出，然後投入到擠壓機-蒸煮器中，並使其成凝膠狀。將所述凝膠狀的基質從擠壓機中取出，放入模子中施加壓力擠壓成形。將擠壓物切成適於給狗餵飼的片狀，在約110℃時乾燥約20分鐘，冷卻形成大約具有0.6水活性的顆粒狀物。
用3種塗層混合物噴淋該顆粒狀物。各塗層混合物含嗜熱鏈球菌CNCMI-1984，CNCMI-1985至少一種的活性培養物，而其中一種塗層混合物使用氫化大豆脂肪作為塗層底物，其中一種塗層混合物使用水作為塗層底物，其中一種塗層混合物使用蛋白消化液作為塗層底物。該顆粒狀物大約含有104-109cfu/g的所述菌株。
權利要求
1.對於口腔微生物區系是外源性的乳酸菌株在製備用於減少哺乳動物牙菌斑並治療或預防根齲及其它與內氏放線菌有關疾病的組合物中的用途，其中所述乳酸菌株因具有粘附於牙齒表膜並產生生長抑制因子的能力而被選擇。
2.根據權利要求1所述的用途，其中所述乳酸菌株是乳源性的。
3.根據權利要求1或2所述的用途，其中所述乳酸菌株選自嗜熱鏈球菌，乳酸乳球菌乳亞種，和乳酸乳球菌乳亞種biovar diacetylactis。
4.根據權利要求1-3其中一項所述的用途，其中所述乳酸菌株選自菌株CNCMI-1984，CNCMI-1985，CNCMI-1986，CNCMI-1987。
5.根據權利要求1-4其中一項所述的用途，其中所述組合物是一種含有效量乳酸菌的可食用組合物，可用於減少哺乳動物的牙菌斑和/或治療或預防根齲及其它與內氏放線菌有關的疾病。
6.根據權利要求1-5其中一項所述的用途，其中所述組合物至少含有104-109cfu/g的乳酸菌株。
7.根據權利要求1-6其中一項所述的用途，其中所述乳酸菌株可與細菌素聯合使用。
8.一種通過減少哺乳動物中內氏放線菌的定居而保持口腔健康的組合物，所述組合物至少含有一種對於口腔微生物區系是外源性的乳酸菌株，其因具有粘附於牙齒表膜並產生生長抑制因子的能力而被選擇。
9.一種通過減少哺乳動物中內氏放線菌的定居而保持口腔健康的組合物，所述組合物含有-至少一種因具有粘附於牙齒表膜並產生生長抑制因子的能力而被選擇的乳酸菌株，和-細菌素。
10.根據權利要求8或9所述的組合物，其至少含有一種選自嗜熱鏈球菌，乳酸乳球菌乳亞種和乳酸乳球菌乳亞種biovar diacetylactis的乳酸菌株。
11.根據權利要求8-10其中一項所述的組合物，其至少含有一種選自CNCMI-1984，CNCMI-1985，CNCMI-1986，CNCMI-1987的乳酸菌株。
12.根據權利要求8-11其中一項所述的組合物，其至少含有104-109cfu/g的乳酸菌株。
13.一種預防或治療哺乳動物與內氏放線菌有關的疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物一種組合物的步驟，其中所述組合物至少含有一種因具有粘附於牙齒表面並產生生長抑制因子的能力而被選擇的乳酸菌株。
14.根據權利要求13所述的方法，可用於減少哺乳動物的牙菌斑並治療或預防根齲。
全文摘要
對於口腔微生物區系是外源性的乳酸菌株在製備用於減少哺乳動物牙菌斑並治療或預防根齲及其它與內氏放線菌有關疾病的組合物中的用途，其中所述乳酸菌株具有粘附於牙齒表膜並產生生長抑制因子的能力。
文檔編號A23K1/00GK1444469SQ01813592
公開日2003年9月24日 申請日期2001年5月30日 優先權日2000年6月2日
發明者E·－M·科梅利, B·古根黑姆, J·－R·尼澤爾, F·斯廷格勒 申請人:雀巢製品公司