一種雜交鵝掌楸LhPIN3基因及其應用的製作方法
2023-06-07 17:25:01 1
一種雜交鵝掌楸LhPIN3基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種雜交鵝掌楸LhPIN3基因及其應用，該雜交鵝掌楸LhPIN3基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明在建立成熟的雜交鵝掌楸體胚發生體系的基礎上，克隆生長素運輸蛋白基因LhPIN3，通過表達分析，證明了雜交鵝掌楸的LhPIN3基因在雜交鵝掌楸體胚發生過程中對胚性細胞發育和體胚苗生長有較大的影響，其過表達試驗發現LhPIN3的過表達會影響植株的生長發育，另外LhPIN3的表達還可以部分拯救擬南芥LhPIN3基因功能完全喪失的pin1突變體，使其恢復表型，開花並結出莢果，因此可應用於植物體胚發生、不定根誘導、不定芽的誘導和分化等，具有很好的應用前景。
【專利說明】—種雜交鵝掌楸A/^/似基因及其應用【技術領域】
[0001]本發明屬於植物基因工程【技術領域】，具體涉及一種雜交鵝掌楸基因及其應用。
【背景技術】
[0002]20世紀生物技術在林木優良材料和新品種的發現與培育中的重要進步是體細胞胚胎發生技術及再生植株培育技術的應用。體胚發生技術由於其兩極性、繁殖速度快、效率高等特點，已經成為優良林木資源快速無性繁殖的重要手段，並且它能和生物反應器結合實現大規模商業化生產。體細胞胚發生的本質是細胞分化的問題，細胞分化使體細胞發育成體細胞胚進而發育成一個完整植株。而細胞分化的分子基礎則是基因差異表達與調控的結果。所以研究這些相關基因可以使我們更好的了解體細胞發生技術的原理。
[0003]雜交鵝掌楸是我國著名林木遺傳育種家葉培忠教授利用分布在我國的中國鵝掌歌 iLiriodendron chinensis (HemsI.)Sarg.)和分布在北美的北美鶴掌揪(Zirioofeflt/ro/?tulip if era Linn.)通過人工雜交育成的種間雜種。雜交鵝掌楸不僅具有生長快，抗性強，材質好，而且其樹形美觀，花色豔麗，是一種適用於庭院栽培，道路綠化，荒山荒地造林等多種用途的優良樹種。雜交鵝掌楸雖然有許多優越性，但雜交制種受到季節和效率的限制，影響了雜交鵝掌楸的推廣應用，由於植物體細胞胚具有數量多，一旦形成體細胞胚就能夠快速發育成再生植株的特點，以體細胞胚胎發生技術快速繁殖種子來源困難的雜交鵝掌楸，具有重要的理論意義和應用價值。到目前為止，已經成功利用雜交種體細胞建立了雜交鵝掌楸體細胞胚胎發生技術和快速成苗體系，開闢了雜交鵝掌楸產業化開發的新途徑。在雜交鵝掌楸體細胞胚胎發生體系的研究中發現，體細胞胚經過了球形胚、心形胚、魚雷胚與子葉胚全過程，說明其發育過程與合子胚的發育完全相同，而且各個發育時期體細胞胚的形狀與合子胚也非常接近。因此，在研究當中，利用體胚發生系統深入研究體細胞胚發生與發育的機制對於揭示細胞分化、發育、形態發生與胚胎發生發育過程等重大理論問題的機制，以及真核細胞中基因表達和調節控制等具有十分重要的意義。
[0004]植物生長調節劑的誘導和調節是離體培養條件下體細胞轉化成胚性細胞的重要誘導因子。其中，生長素是誘導體細胞胚發生的關鍵因素。在體細胞胚的發生和發育過程中，生長素的極性運輸和組織中心細胞與幹細胞的形成起關鍵作用，它們通過啟動胚性特徵基因表達，最終決定體細胞原胚的產生，進而繼續發育形成成熟體細胞胚。造成這種極性運輸的原因是由於在 運輸生長素的細胞中生長素輸出蛋白在質膜上的極性分布所致。很多研究已表明，生長素的運輸蛋白在植物的胚後發育過程及植物的光形態建成和組織分化方面也起著非常重要的作用。生長素在植物組織中的極性分布很大程度上歸功於高度調控、極性定位的輸出載體PINs蛋白。PINs蛋白是生長素的輸出載體，能使生長素從細胞內流出。PINs蛋白家族各成員間存在功能冗餘，並受多水平調節。在特異組織細胞中表達的各種PIN蛋白形成一個具有相同生化功能的PIN蛋白系統，此系統組成一個靈活的生長素分布網，對植物體生長發育相關事件作出應答。PIN蛋白是決定生長素流方向的基礎，為植物體的各部分和細胞提供了特異的位置信息和方向信息。所以，PIN蛋白和生長素信號轉導系統共同調節植物體的生長發育。
[0005]生長素的極性運輸與植物的許多生長發育過程密切相關，但是生長素的調控機制有很多地方認識的都不夠全面。最近幾年，編碼生長素運輸蛋白的基因的克隆使人們對生長素極性運輸的研究取得了很大的進展。截止目前為止，已經從擬南芥中至少克隆出來8個基因，在水稻、玉米等植物中也得到了數個同源基因。根據這些基因在序列上的高度保守性說明在不同植物中也許在其生長發育過程中具有相同的功能。擬南芥中的/ΥΛ7、PIN2、PIN3、PIN4、PIN7已經被證實了在植物早期胚胎發育以及根的向地性、植物的伸長生長以及植物的向性反應中都具有一定的影響。
【發明內容】
[0006]發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種雜交鵝掌楸LhPim基因。本發明的另一目的是提供雜交鵝掌楸基因在雜種鵝掌楸育種中的應用。
[0007]技術方案:為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下:
一種雜交鵝掌楸基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述的雜交鵝掌楸LhPim基因的表達蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]所述的雜交鵝掌楸LhPim基因在雜交鵝掌楸育種中的應用。
[0010]含有雜交鵝掌楸基因的載體或宿主細胞。
[0011]PINs蛋白是生長素的輸出載體，能使生長素從細胞內流出。在特異組織細胞中表達的各種PIN蛋白形成一個具有相同生化功能的PIN蛋白系統，此系統組成一個靈活的生長素分布網，對植物體生長發育相關事件作出應答。擬南芥與雜交鵝掌楸的基因的過量表達都導致了植株生長緩慢、發育推遲。生長素對組織中心細胞與幹細胞的形成起關鍵作用，通過啟動胚性特徵基因表達，最終決定體細胞原胚的產生，進而繼續發育形成成熟體細胞胚。繼而在植物的胚後發育過程及植物的光形態建成和組織分化方面也有重要的影響。
[0012]有益效果:與現有技術相比，本發明在建立成熟的雜交鵝掌楸體胚發生體系的基礎上，克隆了生長素運輸蛋白基因LhPIN』3，通過表達分析，證明了雜交鵝掌楸的LhPIN3基因在雜交鵝掌楸體胚發生過程中對胚性細胞發育和體胚苗生長有較大的影響，其過表達試mhPIN3的過表達會影響植株的生長發育，別\ LhPim的表達還可以拯救擬南芥中功能完全喪失的突變體，使其恢復表型，開花並結出莢果，因此可應用於植物體胚發生、不定根誘導、不定芽的誘導和分化等，具有很好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1是雜交鵝掌楸總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2 ILhPim基因全長PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖3是雙酶切反應結果的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖4是表達載體酶切驗證結果的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖5 ILhPim表達載體圖；圖6是不同時期的雜交鵝掌楸材料圖；
圖7是基因在不同時期的實時定量結果圖；
圖8是Tl代種子的篩選結果圖；
圖9是Tl、T2代陽性植株檢測結果圖；
圖10是LhPim過表達轉基因擬南芥表型圖；
圖11良LhPIN3mmjvpinl突變體表型圖；
圖12是轉基因擬南芥葉片組織培養表型圖。
【具體實施方式】
[0014]下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。
[0015]實施例1
以雜交鵝掌楸為材料，提取總RNA，並反轉成cDNA，設計相應引物進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳後，回收目的條帶，與PMD19-T載體連接，轉入大腸桿菌，測序並分析。挑取陽性克隆進行質粒抽提，加入酶切位點後與載體PBI121同時雙酶切，在T4連接酶的作用下連接後，轉入農桿菌GV3101中，待擬南芥適齡後，通過花器官浸泡轉化法進行轉化，觀察Tl，T2代和T3代轉基因純合體再生植株表型。
[0016](I)總RNA的提取
以雜交鵝掌楸的側芽為材料，按照NORGEN試劑盒(Norgen Sioid)的操作步驟進行RNA的提取，所使用的試劑和耗材均處理使其無RNA酶。雜交鵝掌楸總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，條帶清晰；測定總RNA的吸光度，OD26tZOD28tl值為1.96，OD260/OD230為
2.08，可見RNA質量較好。
[0017]RNA提取的具體過程為:加入600 μ L Lysis Solution磨樣。將裂解液轉移至新管中。混勻2min,使其徹底裂解,12000rpm離心2min,上清移至新管中。加入等體積的70%乙醇，渦旋混勻。將混合液移至柱子中(下接2mL收集管)，離心lmin，倒掉濾液，放回收集管。加入400 μ L Wash Solution，離心lmin，棄濾液，放回收集管。加入DNAI工作液，14000rpm離心lmin,將濾液吸回柱子上,25 °C-30 °C靜置15min。加入400 μ L Wash Solution,14000rpm 離心 lmin,棄濾液。第三次加入 400 μ L Wash Solution, 14000rpm 離心 lmin,棄濾液。將柱子放回收集管，HOOOrpm離心2min，棄收集管。將柱子放入1.7mL管子中加入50 μ L Elution Solution。200~2000rpm 離心 2min, 14000rpm 離心 lmin,體積不足 50 μ L，再用 14000rpm 離心 lmin。
[0018](2)cDNA 的獲得
以所提RNA為模板，反轉錄獲得cDNA,所使用的是Invitrogen公司的SuperScript?III First-Strand Synthesis Kit。實驗中的RNA使用量為I μ g，具體過程為:1)配置反應液(I μ L RNA 5μ g), I μ L Primer (Oligo dT)，I μ L IOmM dNTP mix , DEPC-TreatedWater up to 10 μ L )，短暫低速離心後，65°C 5min,立即置於冰上I~2min。2)向上一步的管中加入相應試劑(2μ L 10XRT Buffer,4μ L 25mM MgCl2,2y L 0.1M DTT, I μ L RNaseOUT(40U/y L), I μ L SuperScript III RT)，置於 PCR 儀上，反應程序為 50°C 50min,85°C 5min。3)將上一步的反應液離心,每管中加入I μ L的RNase H ,37°C 20min。
[0019](3)基因全長的獲得設計引物，進行的克隆。引物如下:
PIN3-F:5』-ATTTACCACCCTTACCCCTCCCCT-3』 ；
PIN3-R:5』-CGTCGATCTACCTCTTTTGGAACT-3』。
[0020]20μ L PCR 擴增體系:2μ L 10XPCR Buffer，。.4μ L IOmM dNTPs，1.2μ L MgSO4(25mM), IuL Forward Primer, IuL Reverse Primer, 2 μ L cDNA, 0.1 μ L Platinum Taq,12.3 μ L ddH20。
[0021]PCR 反應條件:94°C,4min ；94 °C, 30s, 58 °C, 30s, 72 °C, 2min ,36 Cycles ；72 °C,IOmin ；4°C, Forever。
[0022]LhPIN3基因全長PCR產物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳，結果如圖2所示。
[0023]將上述PCR反應產物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用AXYGEN公司的DNA凝膠回收試劑盒對PCR產物進行純化回收，具體過程為:在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體並切碎。計算凝膠重量(提前記錄1.5mL離心管重量)，該重量作為一個凝膠體積(如IOOmg=IOOmLX加入3個凝膠體積的Buffer DE-A,混合均勻後於75°C加熱，間斷混合(每2~3min)，直至凝膠塊完全熔化(約6~8min)。加1.5個凝膠體積的Buffer DE-B,混合均勻；當分離的DNA片段小於400bp時,加入I個凝膠體積的異丙醇。吸取上步中的混合液，轉移到DNA製備管(置於2mL離心管)中，12000Xg離心lmin，棄濾液。將製備管重新置回2mL離心管,加500 μ L Buffer Wl, 12000 Xg離心30s，棄濾液。將製備管重新置回2mL離心管，加700 μ L Buffer W2，12000 X g離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用700 μ L Buffer W2洗滌一次，12000 Xg離心lmin。將製備管重新置回2mL離心管，12000Xg離心lmin。將製備管置於潔淨的1.5mL離心管中，在DNA製備膜正中央加25^30 μ L ddH20，室溫靜置 lmin。12000 X g 離心 lmin 洗脫 DNA。
[0024]採用TaKaRa pMD19_T Vector (D102A)載體系統進行連接反應。反應體系如下:5 μ L Ligation Buffer, I μ L PMD19-T Vector, 4 μ L PCR純化產物(50ng), dH20 up tolO μ L。用移液器吹打混勻，16°C孵育過夜。
[0025]將上述連接產物轉入大腸桿菌中。具體過程如下:準備LB/Amp/X-gal/IPTG固體培養基(每板塗濃度為50mg/mL的IPTG溶液和20mg/mL的Χ-gal各40μ1，室溫下放置2-3小時)。從_70°C中取出感受態細胞，冰浴中融化。在無菌的1.5mL離心管中加入1~5μL連接產物。取100μL感受態細胞與連接產物輕輕混勻，冰浴中放置30min。42°C熱激90秒，然後立即冰浴2min。加入8(Κ)μL LB液體培養基(不含氨苄青黴素)，37°C，IOOrpm振蕩培養
1.5小時。4000rpm離心3分鐘，吸走800μL上清，沉澱在剩餘的上清中重懸。取適量塗布於培養基上，37°C倒置培養12~16小時。
[0026]將得到的陽性克隆進行測序分析。測序發現，LhPim基因編碼區長度為1917bp，序列如SEQ ID N0.1所示，所表達的蛋白序列如SEQ ID N0.2所示，包括628個胺基酸的開放閱讀框(0RF)。將測序所得到的序列在NCBI上進行比對。經比對發現，序列與擬南芥、楊樹等的基因同源性達到80%以上。
[0027]實施例2基因功能驗證
首先構建鵝掌楸表達載體，轉入擬南芥突變體中，觀察鵝掌楸能否使突變體恢復表型，比較兩者表型差異，推測鵝掌楸功能；構建35S: PIN3表達載體，轉入擬南芥野生型中，觀察表型，推測鵝掌楸LhPIN3功能。[0028]I)載體的構建
本發明所用大腸桿菌菌株為E.coli JM109 (寶生物工程(大連)有限公司購入)；表達載體為 pBI 121 (Biovector C0., LTD 公司購入)。
[0029]具體過程如下:
1、通過VHLhPim基因上下遊分別添加XbaI和SmaI酶切位點。PCR體系及反應條件同全長擴增，引物分別是:
PIN3-F+Xba1:5』-CCCCCGGGGGATTTACCACCCTTACCCCTCCCCT-3』 ；
PIN3-R+Sma1:5』-GCTCTAGAGCCGTCGATCTACCTCTTTTGGAACT-3』 ；
2、使用相應的內切酶進行酶切，得到含有粘性末端的並覆蓋整個ORF的基因片段。用同樣的酶切反應處理空的PBI121表達載體。
[0030]雙酶切反應體系如下:
LhPIN3 基因雙酶切體系:2μ L IOXT buffer，0.5μ L Xbal，0.5μ L Smal，2y L
0.1%BSA, I μ g 回收產物，ddH20 up to20 μ L。
[0031]37°C水浴，酶切4h。加入IOX終止液停止酶切反應，1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離。
[0032]酶切結果如圖3所 示，根據條帶大小判斷出PBI121表達載體和基因已經被正確切開。
[0033]用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (AXYGEN)進行回收並純化酶切產物，溶於20μ L的TE緩衝液中。
[0034]3、檢測所回收的酶切產物濃度，按連接體系加入各試劑(目的片段分子數:載體分子數=3:1~5:1)，16°C過夜連接。連接反應體系如下:2.5 μ L Τ4 DNA ligase buffer(lOX),
5μ L 酶切的表達載體，15.5 μ L 酶切的 PCR 產物，2 μ L Τ4 DNA ligase, ddH20 up to25 μ L。
[0035]4、連接產物轉化大腸桿菌JM109超感細胞，挑取單菌落接種到LB液體培養基中，37°C震蕩培養過夜；使用全長引物進行菌液PCR，以篩選陽性克隆，之後用AxyPrep PlasmidMiniprepKit(AXYGEN)提取質粒進行酶切驗證。同時測序檢測載體構建過程中是否發生突變或者缺失現象。
[0036]酶切驗證結果如圖4，圖中條帶大小與之前完全相符，說明基因片段已成功插入PBI121 中。
[0037]構建完成的表達載體如圖5所示，從圖中可清楚直觀看出目的基因、啟動子、終止子、標記基因的位置。
[0038]2)實時螢光定量PCR
選取固體培養的愈傷，懸浮培養的單細胞以及平板誘導的球形胚，子葉胚的材料和體胚苗的根、莖、葉、芽這8個時期進行的qRT-PCR，分喻LhPIN3在不同培養條件以及不同生長時期的表達情況。具體過程如下:
實時定量 PCR 採用 ABI 公司的 Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒，在 ABI 7500Real time PCR Systems (Applied Biosystems)上完成，每個樣品反應三次重複,數據提取分析米用 7500System SDS software (Applied Biosystems)。
[0039]I )RT-PCR引物的設計:根據RT-PCR的要求，設計了 LhPIN3基因的引物，經過溶解曲線的分析，最終選擇雜交鵝掌楸中的18SrRNA作為內參，引物如下:
PIN3 F-RT:5』-CGTCCCCCTTCTGTCATTCCACTTCATCTC-3』 ；PIN3 R-RT:5』-GATCATCCATTCCAGGCTCCCGTTCCTCGT-3』 ；
2)RT_PCR反應體系:10KL 2 X Power SYBR Green PCR Master Mix, IM-L Forward Primer,IM-L Reverse Primer, IM-L cDNA, 7M-L ddH20。
[0040]3) qRT-PCR 反應條件:95°C, IOmin ；95°C, 15sec，60。。，lmin ,40 Cycles。
[0041]4)試驗材料:所使用的材料為不同時期的雜交鵝掌楸材料，如圖6所示，1-8依次為胚性愈傷組織，懸浮培養細胞，體胚誘導一周後的細胞，30天後的早期子葉胚，體胚苗的根尖(取根系茁壯的根系，從下往上取1-2釐米)，莖(除去最幼嫩的葉子，由葉原基向下取1-2釐米)，葉及側芽。
[0042]5)試驗結果:結果如圖7所示，圖中，廣8所對應的時期依次為I胚性愈傷，2懸浮培養的單細胞，3平板誘導一周的細胞，4子葉胚，5體 胚苗的根，6體胚苗的莖，7體胚苗的葉子，8體胚苗的側芽，根據實時定量PCR結果發現，基因在體胚苗的根中表達量明顯高於其他部位。在體胚發生中以及早期子葉胚中的表達也出現了區別，這證明基因在雜交鵝掌楸胚性細胞發育和體胚苗生長過程中發揮了重要作用。
[0043](4)農桿菌的轉化
1、本發明使用的農桿菌菌株為GV3101 ( Biovector C0.，LTD公司購入)。採用的是液氮凍融法將構建好的表達載體轉入農桿菌。具體過程為:冰浴融化GV3101感受態細胞，加入至少IOOng回收純化的表達載體質粒,輕輕混勻，冰浴2(T30min。液氮速凍lmin,37°C熱擊3min，迅速置於冰上I~2min。加入800 μ L無抗生素的LB培養基，28°C，200rpm復甦3.5h ；4000rpm離心3min,吸掉培養基。混勻剩餘菌液，塗抹於添加50mg.L—1卡納黴素的固體LB培基上。28°C倒置培養30~48h。PCR檢測陽性克隆，4°C保存備用。
[0044]2、待種植的健康狀態的擬南芥生長至開花。將PCR檢測的陽性克隆，搖菌至0D0.8時，進行擬南芥花器官浸泡轉化。具體過程為:將菌液5000rpm，5min離心，收集菌體，用5%蔗糖溶液懸浮；在浸泡前，加入SilwetL-77，濃度為0.05% (500yL/L);將擬南芥的地上部分在農桿菌懸浮溶液中浸泡15~30sec，期間輕輕晃動，將浸過的擬南芥平躺在託盤裡，用保鮮膜覆蓋保溼，錫箔紙密封避光24h ;揭開錫箔紙，正常條件下培養，當種子成熟時停止澆水；
(5)轉基因植株表型觀察
1、收穫乾燥的種子，將Tl代種子用50mg.L-1卡納黴素的1/2MS培養基進行篩選。篩選結果如圖8所示，圖中可發現除了陽性植株仍然正常生長，其他的陰性植株無卡納黴素抗性已經死亡。
[0045]2、將篩選出的可能的轉基因陽性植株移栽到土裡繼續培養。提取轉基因擬南芥的總DNA作模板進行PCR檢測，確定其為陽性植株。T2代陽性植株檢測方法也相同。檢測結果如圖9所示，圖中發現陰性對照無條帶，轉基因植株PCR結果條帶與陽性對照一致，確定為陽性植株。
[0046]3、分別移栽20棵C0L、20、％LhPIN3過表達T2植株，生長30天，COL已經有17棵抽苔，都有12片蓮座葉，抽苔比率為85%，而LhPim過表達T2植株僅有2棵抽苔，20棵植株都只有8片蓮座葉，抽苔比率僅為10%。結果如下表:
【權利要求】
1.一種雜交鵝掌楸基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權利要求1所述的雜交鵝掌楸基因的表達蛋白，其胺基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.權利要求1所述的雜交鵝掌楸基因在雜交鵝掌楸育種中的應用。
4.含有雜交 鵝掌楸LhPim基因的載體或宿主細胞。
【文檔編號】A01H5/00GK104004772SQ201410259910
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月12日 優先權日:2014年6月12日
【發明者】施季森, 袁夢箋, 王鵬凱, 李霞, 陳金慧, 李美平, 陸葉 申請人:南京林業大學