一種光致電化學測定穀胱甘肽的方法與流程

2023-06-08 09:55:06 3

本發明屬於分析化學領域，具體涉及一種光致電化學測定穀胱甘肽的方法。
背景技術：
：n-(n-l-γ-穀氨醯-l-半胱氨醯)甘氨酸，即穀胱甘肽，是一種非常重要的硫醇化三肽和內源抗氧化劑，廣泛存在於細胞內環境中，是機體內重要的活性物質之一。它在人體生理學中起關鍵作用。例如，異生生物代謝、對氧化應激的保護、內源性毒性代謝物解毒、酶活性以及硫和氮代謝等。然而，異常水平的穀胱甘肽直接與許多疾病相關，包括癌症、阿爾茨海默氏病和心血管疾病。因此穀胱甘肽含量的檢測具有重要的化學與生理學意義。目前，已經開發了許多分析方法來檢測穀胱甘肽濃度，包括發光分析法[fruehaufjp,jrmf.reactiveoxygenspecies:abreathoflifeordeath[j].clinicalcancerresearch,2007,13(3):789-794.]，螢光測定法[niuly,guanys,chenyz,etal.bodipy-basedratiometricfluorescentsensorforhighlyselectivedetectionofglutathioneovercysteineandhomocysteine[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2012,134(46):18928-18931.]，比色法[durochers,rezaeea,hammc,etal.disulfide-linked,goldnanoparticlebasedreagentfordetectingsmallmolecularweightthiols[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2009,131(7):2475-2477.]，電化學方法[wangy,luj,tangl,etal.grapheneoxideamplifiedelectrogeneratedchemiluminescenceofquantumdotsanditsselectivesensingforglutathionefromthiol-containingcompounds[j].analyticalchemistry,2009,81(23):9710-9715.]，核磁共振波譜法[opstadks,provenchersw,b.a.bell,etal.detectionofelevatedglutathioneinmeningiomasbyquantitativeinvivo1hmrs[j].magneticresonanceinmedicine,2003,49(4):632-637.mandalpk,tripathim,sugunans.brainoxidativestress:detectionandmappingofanti-oxidantmarker『glutathione』indifferentbrainregionsofhealthymale/female,mciand1lzheimerpatientsusingnon-invasivemagneticresonancespectroscopy[j].biochemical&biophysicalresearchcommunications,2012,417(1):43-48.]和表面增強拉曼散射法[huanggg,hossainmk,hanxx,etal.anovelreversedreportingagentmethodforsurface-enhancedramanscattering；highlysensitivedetectionofglutathioneinaqueoussolutions[j].theanalyst,2009,134(12):2468-2474.huanggg,hanxx,hossainmk,etal.developmentofaheat-inducedsurface-enhancedramanscatteringsensingmethodforrapiddetectionofglutathioneinaqueoussolutions.[j].analyticalchemistry,2009,81(14):5881-5888.]等。然而，這些方法都具有靈敏度低，選擇性差，檢測時間長，費力和昂貴，以及臨床應用的可靠性差等缺點。因此，開發新型便捷的檢測方法是科研工作者的目標之一。鑑於現有技術的不足，本發明基於聚苯胺和納米二硫化鉬納米複合材料開發了一種新型的光致電化學傳感器用於穀胱甘肽的高靈敏度檢測，方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡單的特點。技術實現要素：本發明旨在發明一種方法簡單、靈敏度高的測定穀胱甘肽的方法。鑑於現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種光致電化學測定穀胱甘肽的方法。實現本發明目的技術方案是：一種光致電化學測定穀胱甘肽的方法。其原理是利用聚苯胺和nanomos2複合材料修飾金電極，研製了一種新型的光致電化學傳感器，用於穀胱甘肽的傳感檢測。首先，利用液相超聲剝離法將本體mos2超聲剝離成nanomos2，由化學氧化法聚合苯胺單體得到pani。然後將pani與nanomos2用共混法混合成納米複合材料。將納米複合材料修飾到金電極表面，製備一種新型的光致電化學傳感器，實現對穀胱甘肽的高靈敏度檢測。本發明是通過以下措施來實現的：一種光致電化學測定穀胱甘肽的方法，其特徵是包括以下步驟：(1)pani與nanomos2的製備；(2)修飾電極的製備；(3)光致電化學檢測；優選的，所述的pani與nanomos2的製備包括以下步驟：稱取0.0500g本體mos2分散於dmf中，攪拌10min，超聲波震蕩0.2到12個小時將本體mos2進行剝離，形成濃度為0.1mg/ml～10.0mg/ml的mos2懸濁液，得到nanomos2，放置於4℃冰箱內保存備用。苯胺使用前，通過減壓蒸餾除去雜質純化苯胺本體。量取12.3ml苯胺本體，置於含10ml～100ml1mol/lhcl溶液的三口燒瓶中。在冰浴條件下攪拌0.2h～2h。同時，量取5.7050g的過硫酸銨置於含10ml～100ml三次蒸餾水中的燒杯中，冰浴1h。然後將引發劑過硫酸銨溶液緩慢滴加入到苯胺溶液中，繼續攪拌混合液1h，控制反應溫度在4℃。反應結束後得到鮮綠色的聚苯胺沉澱，過濾收集。用hcl洗滌沉澱。將洗滌後的沉澱置於乾燥箱中乾燥。將得到的聚苯胺研磨成粉末，收集起來放置在4℃冰箱內保存備用。優選的，所述的修飾電極的製備包括以下步驟：金電極的預準備：金電極經粒徑為1.0μm、0.3μm、0.05μm的α-al2o3拋光粉拋光後，用三次蒸餾水衝洗乾淨，經乙醇，三次蒸餾水分別超聲清洗3-5min，高純氮氣吹乾備用。nanomos2修飾金電極的製備：取2μl～50μlnanomos2懸濁液滴加到經α-al2o3拋光粉拋光後的金電極表面，在室溫條件下自然乾燥並過夜，得到nanomos2/ge。pani修飾金電極的製備：用三次蒸餾水將pani配成0.1mg/ml～4mg/ml的分散液，超聲半小時，得到懸濁液。然後，取2μl～50μl滴加到金電極表面上，在室溫條件下自然乾燥並過夜，得到pani/ge。pani/nanomos2納米複合材料修飾金電極的製備：將nanomos2與pani按一定比例混合，分散在三次蒸餾水中，超聲半小時得到懸濁液，然後取2μl～50μl的懸濁液滴加到金電極表面，在室溫條件下自然乾燥並過夜，得到nanomos2/pani/ge。光致電化學檢測包括以下步驟：開啟電化學工作站，50s後打開led燈，每10s自動控制開關一次led燈，偏壓設置為-0.1-0.5v。採用三電極體系，將ge、nanomos2/ge、pani/ge、pani/nanomos2/cpe等工作電極插入含有穀胱甘肽的pbs溶液中，以光致電化學方法為檢測手段，實現對穀胱甘肽的高靈敏度檢測。發明的優點與效果當穀胱甘肽的濃度0.1nmol/l到100μmol/l之間時，隨著穀胱甘肽濃度的變化，光致電化學信號有明顯變化。其光致電化學信號與穀胱甘肽濃度的對數成良好的線性關係：δi/μa＝0.1676log(c/m)+1.9628，其中相關係數r2＝0.9982，δi＝i–i0，i和i0是pani/nanomos2/ge工作電極在含穀胱甘肽和不含穀胱甘肽的光致電化學信號。實驗檢出限為3.1×10-11mol/l。對該方法的重現性進行了評價研究，通過用10根不同的pani/nanomos2/ges對濃度為2.0×10-8mol/l穀胱甘肽檢測，10次測量結果的相對標準偏差(rsd)在3.2％，表明本發明的測定方法有較好的重現性。附圖說明圖1pani/nanomos2納米複合材料的製備示意圖及其對穀胱甘肽的光致電化學檢測。圖2不同工作電極的光致電化學信號圖。a圖為光致電化學信號曲線圖；b圖為光致電化學信號柱狀圖。a,ge；b,pani/ge；c,nanomos2/ge；d,pani/nanomos2/ge。圖3穀胱甘肽的濃度與光致電化學信號關係圖。a圖為光致電化學信號曲線圖；b圖為光致電化學信號與濃度線性關係。從a到h穀胱甘肽濃度依次為0m,0.1nm,1nm,10nm,100nm,1μm,10μm,100μm。具體實施方式下面的實例將進一步說明本發明的操作方法，但不構成對發明的進一步限制。實例1：一種光致電化學測定穀胱甘肽的方法1.實驗部分1.1儀器與試劑1.1.1儀器設備將自製的光源系統與電化學工作站chi-830d聯用(上海辰華儀器有限公司)作為pec檢測系統；採用三電極系統進行測試，參比電極是232型飽和甘汞電極(sce)，輔助電極是213型鉑絲電極(上海雷磁儀器廠)。電子天平(fa1004n型，上海精密科學儀器有限公司)；高速離心機(anke-tgl-16c飛翁牌，上海市安亭科學儀器廠)；超聲波清洗器(kq-50e型，500w，崑山市超聲儀器有限公司)。1.1.2試劑本體mos2(天津巴斯夫化工有限公司)；苯胺(國藥集團化學試劑有限公司)；n,n-二甲基甲醯胺(dmf，天津富宇精細化工有限公司)；濃鹽酸(天津迪博化工股份有限公司)；過硫酸銨(天津廣成化學試劑有限公司)；氨水(天津市大茂化工試劑廠)；穀胱甘肽(國藥集團化學試劑有限公司)；十二水合磷酸氫二鈉(天津迪博化工股份有限公司)；二水合磷酸二氫鈉(天津市鼎盛鑫化工有限公司)；實驗室所用試劑均為分析純，實驗用水為三次蒸餾水。0.1mol/l磷酸鹽緩衝溶液(pbs)由0.2mol/l十二水合磷酸氫二鈉和0.2mol/l二水合磷酸二氫鈉按比例配製，其中含有0.1mol/l氯化鉀。將穀胱甘肽溶解於0.1mol/l的pbs溶液中配製成穀胱甘肽的標準液。1.2pani與nanomos2的製備稱取0.0500g本體mos2分散於20mldmf中，攪拌10min，超聲波震蕩4個小時將本體mos2進行剝離，形成濃度為2.5mg/ml的mos2懸濁液。得到nanomos2。放置於4℃冰箱內保存備用。苯胺使用前，首先通過減壓蒸餾除去被氧化的雜質純化苯胺本體。量取12.2826ml苯胺本體，置於50ml1mol/l的hcl溶液的三口燒瓶中。在冰浴條件下攪拌1h。同時，量取5.705g的過硫酸銨(aps)置於50ml三次蒸餾水中，冰浴1h。然後將引發劑過硫酸銨溶液緩慢滴加入到苯胺溶液中，繼續攪拌混合液1h，控制反應溫度在4℃。反應結束後得到鮮綠色的聚苯胺沉澱，過濾收集。用1mol/l的hcl洗滌沉澱。將洗滌後的沉澱置於乾燥箱中乾燥。將得到的聚苯胺研磨成粉末，收集起來放置在4℃冰箱內保存備用。1.3修飾電極的製備金電極的預準備：金電極(ge)經粒徑為1.0μm、0.3μm、0.05μm的α-al2o3拋光粉拋光後，用三次蒸餾水衝洗乾淨，經乙醇，三次蒸餾水分別超聲清洗3-5min，高純氮氣吹乾備用。nanomos2修飾的金電極(nanomos2/ge)的製備：取10μl懸濁液滴加到經α-al2o3拋光粉拋光後的金電極表面，在室溫條件下自然乾燥並過夜，得到nanomos2/ge。pani修飾的金電極(pani/ge)的製備：用三次蒸餾水將pani配成0.4mg/ml的分散液，超聲半小時，得到懸濁液。然後，取10μl滴加到金電極表面上，在室溫條件下自然乾燥並過夜，得到pani/ge。pani/nanomos2納米複合材料修飾的金電極(pani/nanomos2/ge)的製備：將nanomos2與pani按一定比例混合，分散在三次蒸餾水中，超聲半小時得到懸濁液，然後取10μl的懸濁液滴加到金電極表面，在室溫條件下自然乾燥並過夜，得到nanomos2/pani/ge。1.4光致電化學檢測開啟電化學工作站，50s後打開led燈，每10s自動控制開關一次led燈，偏壓設置為-0.1-0.5v(vs-sce)。採用三電極體系，將ge、nanomos2/ge、pani/ge、pani/nanomos2/cpe等工作電極插入含有穀胱甘肽的pbs溶液中，以光致電化學方法為檢測手段，實現對穀胱甘肽的高靈敏度檢測。實例2：不同工作電極的光致電化學信號比較將ge、nanomos2/ge、pani/ge、pani/nanomos2/cpe等工作電極插入含有1μm的穀胱甘肽的pbs溶液中，進行光致電化學測定，發現ge、nanomos2/ge、pani/ge、pani/nanomos2/cpe對應信號分別為46na、412na、198na、716na(圖2)，說明pani/nanomos2/cpe測定穀胱甘肽的光致電化學具有高的信號響應。實例3：樣品測定將含穀胱甘肽的樣品溶液進行光致電化學測定，根據光致電化學信號和上述所得標準曲線可以獲取穀胱甘肽的含量。根據發明的方法對血液中穀胱甘肽含量進行了測定，並採用標準加入法對方法進行了評價，測定結果如表1所示，樣品測定回收率為99.5-102.7％，本發明的方法在穀胱甘肽檢測中具有精密度高的特點。表1.樣品分析測定結果編號含量a,b加入量總量回收率112.2910.0022.45101.6％213.5010.0023.77102.7％314.0110.0023.9699.5％a7次測量結果b單位：nm。當前第1頁12