用於診斷腎移植後急性排斥反應的試劑盒的製作方法

2023-06-08 09:57:51

專利名稱：用於診斷腎移植後急性排斥反應的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉 及一種用於診斷腎移植後急性排斥反應的試劑盒，屬於生物技術領域。
背景技術：
腎移植後排斥反應是受者免疫系統識別異體移植腎抗原後所發生的一系列體液 和細胞免疫反應，其中超急性、急性、慢性排斥反應的區分主要是根據發生時間的早晚、病 程進展的快慢。急性排斥反應可發生於移植後任何時間，並以最初一個月內最為多見。急 性排斥反應的發病機理多為遲發性過敏性細胞免疫，其病理則主要有以下兩型細胞性排 斥反應為主者多為腎間質水腫和大量免疫活性細胞浸潤，體液性排斥反應為主者多為中、 小動脈血管壁纖維蛋白樣壞死和血管炎，部分病例可兼有上述兩種反應。相比於其他各類 排斥反應，急性排斥反應的發生最多見，所有屍體腎移植和非同卵孿生親屬腎移植病人都 有可能發生急性排斥反應。由於急性排斥反應的高發生率，醫學界對於該問題一直保持著 密切的關注。除此之外，急性排斥反應還具有發生時間不定、臨床表現多樣等特點，目前臨 床上對於急性排斥反應應早期診斷、早期治療，以減輕排斥對於移植腎的損害。鑑於以上所 述幾點，探索具有診斷價值的新型簡易生物標記物不僅有益於急性移植腎排斥的早期診斷 和早期幹預，還會帶來巨大的社會效益和經濟效益。臨床上腎移植後病人多數長期使用環孢素，而使用環孢素後，多數急性排斥反應 的臨床表現多不典型，程度輕。同時，由於病理的不確定，其實驗室檢查多無特異。因此，傳 統意義上的臨床表現和實驗室檢查並不能很好的協助急性排斥反應的診斷。目前常用的診 斷方法包括移植腎細針穿刺活檢，移植腎組織穿刺活檢，移植腎都卜勒超聲腎血管阻力測 定。但血管阻力的測定只能為一輔助指標，對於確診的意義相對並沒有穿刺大。穿刺活檢 是診斷的金標準，但在目前仍有許多不便之處。首先，腎活檢有滯後性，進行腎活檢需要有 一定的指證，而這些指證的出現，往往表示腎功能的損害已經發生。其次，腎活檢多為排除 其他疾病可能後的選擇，而排除過程中的檢查和診斷又需耗去大量的時間，造成不必要的 經濟損失和醫療資源浪費。再者，腎活檢手續較為繁瑣，其前期檢查、手術操作、後期處理都 有相關的要求，施行不便，因此，定期隨訪腎活檢對於腎移植患者而言往往較難接受。綜上 所述，如能有更為靈敏、特異、方便的指標代替腎活檢進行腎移植後急性排斥反應的診斷， 將為醫護人員、病人帶來極大的便利，也必然擁有極為廣闊的應用市場。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於診斷腎移植後急性排斥反應的試劑盒
為了達到上述目的，本發明提供了一種用於診斷腎移植後急性排斥反應的試劑盒，其 特徵在於，由生物蛋白及其酶標抗體，PH值為9. 6的碳酸鹽緩衝液，pH值為7. 4的磷酸鹽 緩衝液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照血清組 成；
其中，所述的生物蛋白是包括蛋白S100-A8 (Protein S100-A8)，蛋白S100-A9(Protein S100-A9)， ITIH3 前 體(Isoform 1 of Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3 precursor)， IGFBP2 前 體(Insulin-like growth factor-binding protein 2 precursor)，血紅素結合蛋白前體(Hemopexin precursor)，AlBG 前體(alpha ΙΒ-glycoprotein precursor)，AP0A4 前體(Apolipoprotein A-IV precursor)，纖維蛋 白原 β 鏈前體(Fibrinogen beta chain precursor)，結合珠蛋白前體(Haptoglobin precursor)，C0L1A2 前 體(Collagen alpha-2 (I) chain precursor)，ITIHl 前 體(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain Hl precursor)， COLlAl 前 體 (Collagen alpha-1 (I) chain precursor)，SERPINC1 抗凝血酶 III 變異體(SERPINC1 Antithrombin III variant), SERPINC1 蛋白(SERPINC1 protein)，纖連蛋白 1 同工異型 體 4 前蛋白原(fibronectin 1 isoform 4 pr印roprotein)，SERPINA3 α-1-抗 疑乳蛋 白酶前體(SERPINA3 Alpha-l-antichymotrypsin precursor)，C3 前體(Complement C3 precursor)，C9 前體(Complement component C9 precursor)，纖維蛋白原 α 鏈同工異 型體前體(Isoform 1 of Fibrinogen alpha chain precursor)，維生素 D 結合蛋白前體 (vitamin D-binding protein precursor)在內的 20 禾中生物蛋白。本發明的優點是
1.本發明首次提出包括補體，細胞因子，纖維蛋白，結合蛋白等多種生物蛋白類別在內 的20種生物蛋白或與其它臨床指標組合可成為腎移植後急性排斥反應的主要指標。2.包括補體，細胞因子，纖維蛋白，結合蛋白等多種生物蛋白類別在內的20種生 物蛋白作為預測指標較目前用於診斷腎移植後急性排斥反應的超聲指標及其他臨床指標 更為客觀可靠，而且測定此類蛋白表達水平相較於腎穿更為簡單易行。
具體實施例方式下面結合實施例來具體說明本發明。 實施例一種用於診斷腎移植後急性排斥反應的試劑盒，由生物蛋白及其酶標抗體，PH值 為9. 6的碳酸鹽緩衝液，pH值為7. 4的磷酸鹽緩衝液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯 苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照血清組成；
其中，所述的生物蛋白是包括蛋白S100-A8，蛋白S100-A9，ITIH3前體，IGFBP2前體，血 紅素結合蛋白前體，AlBG前體，AP0A4前體，纖維蛋白原β鏈前體，結合珠蛋白前體，C0L1A2 前體，ITIHl前體，C0L1A1前體，SERPINC1抗凝血酶III變異體，SERPINC1蛋白，纖連蛋白 1同工異型體前蛋白原，SERPINA3, C3前體，C9前體，纖維蛋白原α鏈同工異型體前體，維 生素D結合蛋白前體在內的20種生物蛋白。所述pH值為9. 6的碳酸鹽緩衝液為將1. 59克碳酸鈉和2. 93克碳酸氫鈉加至IL 蒸餾水中而得。所述PH值為7. 4的磷酸鹽緩衝液為0. 2克磷酸二氫鉀，2. 9克十二水合磷 酸氫二鈉，8. O克氯化鈉，0.2克氯化鉀，0. 5ml吐溫_20加至IL蒸餾水中而得。所述血清蛋 白稀釋液為將0. 1克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至100ml pH值為7. 4磷酸鹽緩衝液而 得。所述終止液為2M硫酸溶液。所述四甲基聯苯胺底物溶液為將0. 5ml四甲基聯苯胺的無 水乙醇溶液(10mg/5ml)，10ml pH值為5. 0底物緩衝液與32ul過氧化氫水溶液(0. 75vol%)
4混合而得，PH值為5. O底物緩衝液為含0. 2M磷酸氫二鈉和0. IM檸檬酸的蒸餾水溶液。上述試劑盒的使用方法如下
1、包被用PH值為9. 6碳酸鹽緩衝液將細胞因子稀釋至蛋白質含量為Ι-lOug/ml。在 每個聚苯乙烯的反應孔中加0. 1ml，於4°C過夜。次日，棄去孔內溶液，用pH值為7. 4的磷 酸鹽緩衝液洗3次，每次3分鐘。2、加樣分別加一定血清蛋白稀釋液稀釋後的待檢樣品、正常人血清和陽性對照 血清0. Iml至上述已包被的反應孔中，置37°C孵育1小時後用PH值為7. 4磷酸鹽緩衝液洗 3次，每次3分鐘。3、加辣根過氧化物酶標抗體在各反應孔中加入新鮮稀釋的辣根過氧化物酶標抗 體0. 1ml，37°C孵育0. 5-1小時後用PH值為7. 4磷酸鹽緩衝液洗3次，每次3分鐘。4、加底物液顯色在各反應孔中加入四甲基聯苯胺底物溶液0. lml，37°C下孵育 10-30分鐘。5、終止反應在各反應孔中加入2M硫酸0. 05ml。6、結果判定在ELISA檢測儀上，於450nm處，以空白對照孔調零後測各孔OD值。 若大於規定的陰性對照OD值2. 1倍，即為陽性。
以正常對照品蛋白表達水平作為衡量標準，腎移植後急性排斥反應患者血清蛋白譜表 達量除以此標準，從而確定患者蛋白譜相對於正常人的表達比例。其中，大於或等於2. 4為 增高，小於2. 4為降低。本發明通過收集5例腎移植後急性排斥患者血漿、8例腎移植後功 能穩定者，應用蛋白質晶片技術檢測血清內多種生物蛋白，同時以腎移植後功能穩定患者 血漿中蛋白表達水平作為衡量標準，篩選腎移植後急性排斥患者血漿蛋白譜中上調的生物 蛋白。最終確定腎移植後急性排斥患者血漿蛋白譜中有20種生物蛋白表達與腎移植後功 能穩定者血漿比較存在差異，其中包括20種生物蛋白上調的表達改變(表1)。
表1、多種生物蛋白在腎移植後急性排斥患者、腎移植後功能穩定者血漿中的表達變化
表
權利要求
一種用於診斷腎移植後急性排斥反應的試劑盒，其特徵在於，由生物蛋白及其酶標抗體，pH值為9.6的碳酸鹽緩衝液，pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照血清組成；其中，所述的生物蛋白是包括蛋白S100 A8，蛋白S100 A9，ITIH3前體，IGFBP2前體，血紅素結合蛋白前體，A1BG前體，APOA4前體，纖維蛋白原β鏈前體，結合珠蛋白前體，COL1A2前體，ITIH1前體，COL1A1前體，SERPINC1抗凝血酶III變異體，SERPINC1蛋白，纖連蛋白1同工異型體前蛋白原，SERPINA3，C3前體，C9前體，纖維蛋白原α鏈同工異型體前體，維生素D結合蛋白前體在內的20種生物蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種用於診斷腎移植後急性排斥反應的試劑盒，其特徵在於，由生物蛋白及其酶標抗體，pH值為9.6的碳酸鹽緩衝液，pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照血清組成；其中，所述的生物蛋白是包括蛋白S100-A8，蛋白S100-A9，ITIH3前體，IGFBP2前體，血紅素結合蛋白前體等的20種生物蛋白。本發明首次提出包括補體，細胞因子，纖維蛋白，結合蛋白等多種生物蛋白類別在內的20種生物蛋白或與其它臨床指標組合可成為腎移植後急性排斥反應的主要指標。
文檔編號G01N33/68GK101937001SQ20101026607
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月30日 優先權日2010年8月30日
發明者戎瑞明, 朱冬, 朱同玉, 武多嬌, 王向東, 許明 申請人:復旦大學附屬中山醫院