雙軸旋轉式細胞/組織三維培養器的製作方法

2023-06-08 02:38:26 2

專利名稱：雙軸旋轉式細胞/組織三維培養器的製作方法
技術領域：
本發明涉及於生物醫學工程中使用的裝置，特別是用於生物醫學工程的前沿一組織工程(Tissue Engineering)領域中的雙軸旋轉式細胞/組織三維培養器。
『組織工程』一詞是在美國國家自然科學基金會(NSF)1987年8月召開的一次學術討論會上提出來的。1988年由NSF的一個工作小組對它的內涵作了界定，即「應用工程科學和生命科學的原理和方法，來解釋哺乳動物組織的結構——功能關係，並且發展具有活性的工替代物，來恢復、維持或提高組織的功能」。其核心是通過哺乳動物(包括人，乃至患者自身)細胞的離體培養，生長了具有特定功能的活組織或具它生物替代物，應用於臨床。組織工程涉及的科學問題很多，細胞/組織三維培養器是其關鍵技術之一。它和現代生物化學工程(如發酵工程、製藥工業等)中所用的生物反應器以及傳統的細胞培養方法有本質的差別。如一般發酵工業、製藥業等所用的生物反應器藉助於機械攪拌(包括實驗室用的搖瓶、搖床等)或吹入氣體引起強迫對流等方法避免培養物沉降，並改善營養供應，這在微生物培養(如抗生素生產)中是成功的，但對於哺乳動物細胞培養來說是不適宜的。因為(1)哺乳動物細胞培養比微生物『嬌嫩』得多，機械攪拌造成的流動剪切和直接作用很容易損傷乃至破壞細胞，造成壞死。(2)機械攪拌造成的流動剪世使得細胞難以(甚至不能)聚集，而細胞聚集是從細胞培養成組織的第一步。
另外，傳統細胞培養方法在90年代中期以前，醫學界未能培養出具有與在體組功能相同或相似的生物組織來。其主要原因是不可避免的重力作用使得細胞(或微載體)沉降於培養器底部，細胞在培養器器壁之間的接觸抑制使得所培養的細胞不能真正三維生長，從而限制了細胞功能分化，長不成所需要的組織。而空間微重力環境為細胞三維生長創造了條件。美國宇航局(NASA)從80年代中期就著手發展空間生物反應器。90年代初期，NASA Johnson中心在這方面取得了重大進展，發展了旋轉管式生物反應器(RWV)。並在1995年太空梭搭載實驗中成功地培養出結腸癌組織，組織切片觀察表明它具有和在體組織相似的機構。而且其尺寸比用傳統方法培養的大30倍，達2釐米。1997年又進行了關節軟骨組織培養實驗，成功地培養出了和在體軟骨組織相似的並節軟骨組織，尺寸為釐米量級。這種新型的生物反應器在地面運行時，也可以藉助反應器內培養液流動的流體力學效應而避免重力沉降，從而確保細胞三維生長。如參考文獻[1]Culturing a Future，Fall 1998，Microgravity News但是這種新型的生物反應器也是有缺點的，其一是培養室內介質應力水平不可調控；其二是培養器使用時實際上懸浮物在細胞培養室內的運動是三維的，但在接近端部時它將向內筒表面收斂而造成細胞/組織三維培養極為不利；帶來不利於細胞三維生長的端部效應問題，如

圖1所示。圖中D＝6cm，d＝1.5cm，L＝6cm；N1＝5rad/s，N2＝1.25rad/s，k＝0.3；起始點X＝1，Y＝2.0cm，Z＝0.2cm.。
本發明的目的在於克服已有技術的缺點，為了解決已有的培養器使用時出現的不利於細胞三維生長的端部效應問題，即由有限長度端部效應引起的培養物沉降問題；和為了實現培養室內介質應力水平可以調控，從而提供一種應用同軸旋轉的雙圓筒之間粘性流體運動產生的流體動力克服重力沉降，使培養物(或微載體或細胞聚集體等)處於三維懸浮狀態，在培養器雙圓筒既可做同軸旋轉又可做差動旋轉的基礎上，還可做橫向擺動，以獲得最佳三維生長條件的雙軸旋轉式細胞/組織三維培養器。
本發明的目的是這樣實現的本發明提供的雙軸旋轉式細胞/組織三維培養器包括培養液流動室、細胞培養室、氣室三層同心園筒套裝構成培養器主體。內筒為培養液流動室，內筒(內筒的半徑為R1)壁面是一支撐用的鏤空的金屬架上固定液/液交換膜，中間筒(中間筒的半徑為R2)是細胞培養室，其外壁是一支撐用的鏤空的金屬架上固定液/氣交換膜，兩者安有軸均可旋轉，外筒(外筒的半徑為R3)是氣室，細胞培養室的外壁是氣室的內壁，外筒壁是固定不動的；控制器匹配調控的兩組由馬達和變速器組成的轉動機構，分別與內筒和中間筒的軸相連接。馬達固定在底座的支架上，兩組馬達一變速器組成的轉動機構，使得內筒和中間筒既可同步旋轉(ω1＝ω2)，亦可差動旋轉(ω1≠ω2)，(ω3＝0)。ω1(t)＝ω2(t)時，圓筒R1、R2同步旋轉；ω1(t)≠ω2(t)時，培養液流動室(內圓筒R1)、細胞培養室(中間筒R2)差動旋轉。內筒端軸上裝有分離部件，其上有培養液進口和培養液出口，其作用是(1)使培養液進、出口和旋轉內筒軸分離開來，不隨之而轉動；(2)把流進新鮮培養液和流出培養液隔離開來。供液系統中的輸液泵的液管與培養液存貯器相連，再通過多孔管管道先穿過出口處阻尼器後，進入細胞培養室至細胞培養室終端，細胞培養室的輸出管道相連在培養液透析器，它分別與培養液回收器和代謝產物收集器相通；供氣系統中的氣室進氣口與氣源通過氣管上的穩壓，調壓閥連接；氣室的出氣口通過排氣管連接在餘氣收集器上。其特徵在於還包括橫向擺動支架固定在整體支座上，另一馬達安裝在橫向擺動支架內側，該馬達的軸穿過橫向擺動支架與另一滑杆B固定在一起；通過橫向轉動框架內側上的兩個橫向擺動轉軸將培養器主體固定，橫向擺動轉軸上又固定一滑杆A；兩根滑杆通過其上的槽滑動相配合，橫向擺動調幅、限幅部件(如一螺栓)穿過一滑杆A固定在滑杆B。通過橫向轉動力矩馬達帶動滑杆做橫向擺動運動，其中橫向擺動調幅在8°-20°之間；培養液流動室連接有軸，軸通過轉速調節機構與一馬達連接；細胞培養室連接有另一軸，並通過轉速調節機構與另一馬達連接，氣室上進氣口與供氣系統的氣管連接；培養液進口和一出口分別與供液輸運路徑上的進口和出口連接；在生長過程中(1)在細胞培養室中部，培養物懸浮的條件主要由旋轉角速度(ω1＝ω2＝ω時)、培養室內液相介質粘度、培養物和培養液密度差等決定。隨著培養物尺度(用當量球徑d表示)增大，為避免重力沉降所需要的角速度也增高。圖2是培養物尺度與懸浮培養最低轉速關係示例。
(2)實際上懸浮物的運動是三維的，如圖1所示，在接近端部時它將向內筒表面收斂，這對於細胞/組織三維培養是不利的，當培養物尺度較大時尤其如此。本發明是為了克服細胞在三維培養器內生長時，在接近培養器端部時它將向內筒表面收斂，造成培養物沉在培養器底部帶來不利。本發明是在生長細胞時培養物放在細胞培養室內，由供液系統和供氣系統向培養液流動室供液和向氣室供氣，通過液/液交換膜或氣/液交換膜進行交換，對細胞培養室內培養物提供氧和必要的營養，同時培養器主體中的兩個圓筒在兩個馬達的帶動下，最初做同軸轉動然後在做差動旋轉，使細胞在培養室內懸浮生長，培養室內的應力分布也是可調控的；由於多一個橫向擺動的軸，雙軸旋轉，增加了一個調控因素，大大地有利於培養室內物質輸運和力學環境的調控。但是橫向擺動轉軸的安裝位置必須通過與氣室/培養室/培液流動室一體化結構和旋轉框架橫向轉動平臺的質心(重心)，擺動速度才能均勻。另外，橫向擺動的幅度以8°-20°為宜。
本發明的效果和優點本發明提供的雙軸旋轉式細胞/組織三維培養器的細胞培養室、氣室和培養液流動室的配置既可同步調速，亦可差動調節，培養室內的應力分布是可調控的；由於雙軸旋轉，通過繞橫軸的低速擺動，消除端部效應，能顯著改善端部效應引起的培養物向內管壁面聚集的傾向，增加了一個調控因素，有利於培養室內物質輸運和力學環境的調控，營造一個更有利於細胞、細胞聚集體和組織三維生長的環境。同時，更有利於培養室內氧、CO2營養物和代謝物的輸運，且為培養室內力學環境的調控增添了一條途徑。
下面結合實施例和附圖對本發明進行詳細地說明附圖1是培養器有限長度引起的端部效應圖附圖2是本發明的培養器培養物尺寸(d)和懸浮培養所需最低轉速附圖3是本發明的雙軸式旋轉式細胞/組織三維培養器結構示意圖附圖4是本發明的雙軸式旋轉式細胞/組織三維培養器供液輸運路徑示意圖附圖5是本發明的雙軸式旋轉式細胞/組織三維培養器供氣輸運路徑示意圖實施例1按圖3-5製作一臺本發明的雙軸式旋轉式細胞/組織三維培養器，在圖中1該三維培養器包括一培養液流動室(3)/細胞培養室(1)/氣室(7)三個同心圓圓筒，套裝成的一體化培養器主體結構，培養器主體結構用聚碳酸脂材料製作圓筒，三個同心圓圓筒之間的用市售的液/液交換膜或氣/液交換膜隔開；馬達(11)固定在橫向轉動框架(38)一端，馬達(11)的軸通過齒輪(10)與齒輪(14)咬合，培養液流動室(3)的軸穿出橫向轉動框架(38)外，該軸在框架(38)內末段有一齒輪(5)，該軸露出橫向轉動框架(38)外段上套一聚碳酸脂材料製作的分離通道(6)，它與培養液流動室(3)連通，分離通道(6)上有一進液口、(14)和一出液口(15)，分離通道(6)內安有一密封圈，隔離新鮮培養液與流出的培養液；培養器主體兩端固定在不鏽鋼的橫向轉動框架(38)上，橫向轉動框架(38)固定在橫向擺動支架(34)上，橫向擺動支架(34)安在整體支座(35)；在橫向轉動框架(38)兩側各通過一橫向擺動轉軸(30)將培養器主體三者固定在一起，即橫向擺動轉軸的安裝位置必須通過與氣室/培養室/培液流動室一體化結構和旋轉框架橫向轉動平臺(7)的質心(重心)；橫向擺動轉軸(30)上又固定一滑杆B(37)，橫向擺動支架(34)內側固定一馬達(33)並與橫向擺軸(30)相連，馬達(33)的軸穿過橫向擺動支架(34)與滑杆(36)固定在一起；滑杆B(36)與滑杆B(37)上有槽，兩者滑動相配合，一螺栓(31)穿過滑杆並與滑杆B(36)上固定，但是螺栓(31)可以在滑杆B(37)的槽內滑動。
(6)用聚碳酸脂做的分離通道；(38)為不鏽鋼材料的橫向轉動框架；(8)、(9)為細胞培養室內、外筒壁連接的轉速調節機構；(10)、(11)為驅動馬達、分別與轉速調節機構(8)、(9)相連；(12)、(13)和(14)、(15)分別為氣室(7)上的氣體進、出口和培養液流動室(3)上的培養液進、出口，分別與供氣部分和培養液供液輸運路徑相連接；(30)是橫向擺動轉軸，橫向擺動轉軸的安裝位置必須通過與氣室/培養室/培液流動室一體化結構和旋轉框架橫向轉動平臺(7)的質心(重心)；，(31)是用一螺栓做橫向擺動調幅、限幅部件，(32)是橫向擺軸；(33)是橫向轉動力矩馬達，安裝在支架架(34)內側，圖中看不出；(34)是橫向擺動支架，橫向轉動框架(38)通過橫向擺動轉軸(30)固定其上；(35)是整體支座，上述(30)-(35)均用不鏽鋼製作；(36)滑杆A；(37)滑杆B；使用不鏽鋼製作的兩條帶滑槽的配合件，兩者之間靠滑動槽滑動調整兩條部件的交叉角度，即橫向擺動的幅度，調整好交叉角度後用螺栓(31)鎖住滑杆A，但螺栓(31)可以帶動滑杆A(36)在滑杆B(36)槽內滑動。在滑杆B(36)的一端安有一擺動用橫向擺軸(32)，在滑杆A(37)的一端通過一擺動用橫向擺軸(30)將其固定在橫向擺動支架(34)上。
本實施例的培養液輸運系統，如圖4所示，在圖中(18)為新鮮培養液存貯器；(19)為流量、壓力可調的輸液泵；；(20)為輸入培養液用多孔管道，經出口段阻尼器進入培養室至培養室終端。
(21)出口阻尼器，是市售的帶有可調節螺釘的軟管夾子；用以調節輸入培養室的培養液流量，達到調節培養室內壓力(Pb(ζ))；(22)是培養液透析器；(23)是培養液回收器；(24)是代謝產物收集器；其中輸液泵(19)的液管與培養液存貯器(18)相連，再通過多孔管道的一端先穿過出口阻尼器(21)後，進入細胞培養室至培養室終端，細胞培養室的輸出管道相連培養液透析器(22)，它分別與培養液回收器(23)和代謝產物收集器(24)相通；其中氣室進氣口與氣源(25)通過氣管上的穩壓，調壓閥(26)連接；氣室出氣口通過排氣管(28)連接餘氣收集器(29)上。
本實施例的供氣——排氣系統，如圖4所示，在圖中(25)為氣源，普通的儲氣瓶；(26)為穩壓，調壓閥，通過對穩壓，調壓閥的調控作用達到調節培養室內應力的目的；(27)為進氣管(與圖-6之(9)相連)；(28)為排氣管(與圖-6之(10)相連)；(29)為餘氣收集器；其中氣室進氣口與氣源(25)通過氣管上的穩壓，調壓閥(26)連接；氣室出氣口通過排氣管(28)連接餘氣收集器(29)上。
權利要求
1.一種雙軸旋轉式細胞/組織三維培養器包括培養液流動室、細胞培養室、氣室三層同心園筒套裝構成培養器主體，內筒為培養液流動室，內筒壁面是用一支撐架上固定液/液交換膜，中間筒是細胞培養室，其外壁是用一支撐架上固定液/氣交換膜，兩者同一端安有軸，外筒是氣室，細胞培養室的外壁是氣室的內壁，外筒壁是固定不動的；控制器匹配調控的兩組由馬達和變速器組成的轉動機構，分別與內筒和中間筒的軸相連接。馬達固定在底座的支架上，兩組馬達一變速器組成的轉動機構，內筒端軸上裝有隔離機構，其上有培養液進口和培養液出口，供液系統中的輸液泵的液管與培養液存貯器相連，再通過多孔管管道先穿過出口處阻尼器後，進入細胞培養室至細胞培養室終端，細胞培養室的輸出管道相連在培養液透析器，它分別與培養液回收器和代謝產物收集器相通；供氣系統中的氣室進氣口與氣源通過氣管上的穩壓，調壓閥連接；氣室的出氣口通過排氣管連接在餘氣收集器上，其特徵在於還包括橫向擺動支架固定在整體支座上，另一馬達安裝在橫向擺動支架內側，該馬達的軸穿過橫向擺動支架與另一滑杆B固定在一起；通過橫向轉動框架內側上的兩個橫向擺動轉軸將培養器主體同定，橫向擺動轉軸上又固定一滑杆A；兩根滑杆通過其上的槽滑動相配合，橫向擺動調幅、限幅部件(如一螺栓)穿過一滑杆A固定在滑杆B。通過橫向轉動力矩馬達帶動滑杆做橫向擺動運動，其中橫向擺動調幅在8°-20°之間；培養液流動室連接有軸，軸通過轉速調節機構與一馬達連接；細胞培養室連接有另一軸，並通過轉速調節機構與另一馬達連接，氣室上進氣口與供氣系統的氣管連接；培養液進口和一出口分別與供液輸運路徑上的進口和出口連接；
2.按權利要求1所述的雙軸旋轉式細胞/組織三維培養器，其特徵在於所說的橫向擺動調幅、限幅部件包括螺栓，橫向擺動調幅為8°-20°。
全文摘要
本發明涉及組織工程中的雙軸旋轉式細胞/組織三維培養器。主要由內筒培養液流動室、細胞培養室、外側為氣室的三筒套裝一體化結構的培養器主體,培養器主體安裝在作2個自由度旋轉的橫向轉動框架上,氣室和培養液流動室分別用軸通過轉速調節機構與一馬達帶動,做同軸轉動然後在做差動旋轉,通過繞橫軸的低速擺動,消除端部效應,營造一個更有利於細胞、細胞聚集體和組織三維生長的環境。同時更有利於培養室內氧、CO
文檔編號C12M3/00GK1252437SQ99119640
公開日2000年5月10日 申請日期1999年9月23日 優先權日1999年9月23日
發明者陶祖萊, 席葆樹, 高宇欣, 邵傳平, 王戰會 申請人:中國科學院力學研究所