使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡製備誘導多能性幹細胞的方法
2023-06-07 21:04:36
使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡製備誘導多能性幹細胞的方法
【專利摘要】本發明提供一種使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡使體細胞去分化的方法。具體而言，本發明提供一種製備誘導多能性幹細胞的方法，所述方法包括用包含胚胎幹細胞衍生的微囊泡的組合物處理體細胞。根據本發明的製備誘導多能性幹細胞的方法，使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡可使體細胞的去分化有效進行而無副作用，並且，預見到本發明的方法在研發具有個體免疫相容性的細胞療法產品方面非常有用。
【專利說明】使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡製備誘導多能性幹細胞的方
法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種通過使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡使體細胞去分化來製備誘導多能性幹細胞的方法。
【背景技術】
[0002]去分化是成熟體細胞恢復為較年輕的幹細胞的過程並且去分化涉及體內再生，這種體內再生在昆蟲體內、兩棲動物體內、植物體內發生。所述去分化不會自然地發生在諸如人之類的哺乳動物體內，只是通過人工方法在諸如人之類的哺乳動物體內發生。細胞去分化的方法以使用細胞融合的方法為開端。本領域中發現的使體細胞去分化的第一種方法是使用如下特徵的方法:當胚胎幹細胞(ESC)與體細胞融合時胚胎幹細胞成為佔主導地位的細胞。此後，通過將體細胞與除了 ESC之外的具有類似於ESC的能力的幹細胞融合使在誘導體細胞去分化方面的研究取得了長足發展，所述具有類似於ESC的能力的幹細胞例如，胚胎生殖細胞(EGC)或胚胎癌細胞(ECC)。
[0003]然而，進行細胞融合的細胞會隨機分裂或維持在融合狀態而不進行分裂。發生分裂的細胞(雜合體)具有一個細胞核，而沒有發生分裂的細胞(異核體)具有兩個不同細胞的細胞核。由於這個原因，大多數細胞成為癌細胞，只有一些細胞具有正常功能。
[0004]此外，檢查細胞融合(細胞、細胞質)的方法具有以下不足之處:許多細胞由於使用聚乙二醇(PEG)誘導融合而死亡，聚乙二醇可損傷細胞以幫助大尺寸的細胞進行融合。為了解決這個問題，僅使細胞的一部分而非全部胚胎幹細胞去分化的常規研究取得了進展。一項研究工作通過從細胞中僅分離細胞質而在融合過程中排除細胞核。用化學物質(鏈球菌溶血素)處理體細胞以使細胞膜具有滲透性並嵌入從胚胎幹細胞衍生的細胞質的方法得到使用。然而，截止2010年，在使用細胞質去分化的情況下，還沒有成功的去分化實例產生與胚胎幹細胞類似的性質。
[0005]此外，本領域還存在特異性因子的遞送系統。2006年，日本東京大學的Yamanaka研究組發現了可僅通過胚胎幹細胞中的四個基因進行去分化。將這四個基因(0ct-4、klf4、Sox2和c-Myc)引入小鼠皮膚細胞，從而製備誘導多能性幹細胞(iPS)。這項研究開創了合成細胞的一部分用於嵌入而不是融合整個細胞這一概念。iPS技術採用了一種通過在起始階段利用病毒的能力將基因嵌入基因組並強制表達RNA生產蛋白質的方法。然而，由於病毒的特性，基因被整合在若干位點，從而形成不理想的修飾。目前，為了解決這個問題，使用mRNA遞送方法或者遞送蛋白質本身的方法。然而，本領域技術人員發現mRNA易於降解並且合成過程有難度，會誘導RNA的免疫反應，而且僅遞送蛋白質無法實現完全去分化。
[0006]因此，本領域亟需研發一種可克服上述問題的製備去分化的多能性幹細胞的方法。
【發明內容】
[0007]【技術問題】
[0008]為了解決現有技術中的問題，本發明的發明人進行研究發現，體細胞的去分化可通過使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡而有效且穩定地進行。
[0009]因此，本發明意在提供一種使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡使體細胞有效地進行去分化而不產生副作用來製備誘導多能性幹細胞的方法，並且本發明還提供通過上述方法製備的誘導多能性幹細胞。
[0010]然而，技術問題不限於上面描述的那些，本領域普通技術人員根據下面的描述會清楚地理解本文沒有描述的其他技術問題。
[0011]【技術方案】
[0012]本發明一方面提供一種製備誘導多能性幹細胞的方法，所述方法包括使用包含胚胎幹細胞衍生的微囊泡的組合物處理體細胞。
[0013]本發明另一方面提供通過如下方法製備的誘導多能性幹細胞，所述方法包括使用包含胚胎幹細胞衍生的微囊泡的組合物處理體細胞。
[0014]本發明的再一方面提供一種包含誘導多能性幹細胞的細胞療法產品。
[0015]【有益效果】
[0016]根據本發明可知，使用融合微囊泡遞送細胞質的方法不需要使用在細胞融合過程中所需的聚乙二醇(PEG)或不需要使用注入細胞質時所用的諸如鏈球菌溶血素之類的細胞毒性物質，因此，對細胞的損傷較小。此外，在遞送細胞質的過程中，微囊泡具有較高的遞送效率，並且更有效地保護遞送的內容物，因此能夠特異性地遞送細胞質。根據細胞質遞送方面的常規研究可知，細胞質的遞送效率隨著細胞核內待表達的蛋白質的量的減少而減少，因此，無法進行完全去分化。 然而，基於本發明的製備方法，本發明的微囊泡可自由地控制細胞質的濃度並且防止融合過程中細胞內物質的損失，這樣，使用細胞質使體細胞去分化的效率可增加。
[0017]此外，根據使用本發明的微囊泡的方法可知，靶向誘導體內去分化的目標是可能的。具體而言，因為在患者的受損器官中產生的信號是主要靶向因子，所以，可預見到的是，體外去分化會成為能夠在體內進行的新的去分化方式。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1表示通過擠壓製備的胚胎幹細胞衍生的微囊泡的透射電子顯微鏡(TEM)圖像。
[0019]圖2為表示通過擠壓製備的胚胎幹細胞衍生的微囊泡的尺寸的圖。
[0020]圖3為表示胚胎幹細胞特異性蛋白質(即，0ct3/4)存在於胚胎幹細胞和胚胎幹細胞衍生的微囊泡中的圖。
[0021]圖4為表示胚胎幹細胞特異性基因(即，0ct3/4和Nanog)存在於胚胎幹細胞和胚胎幹細胞衍生的微囊泡中的圖。
[0022]圖5表示在使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡使小鼠成纖維細胞(NIH3T3細胞)去分化之後產生的細胞集落。
[0023]圖6表示在使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡使小鼠成纖維細胞(NIH3T3細胞)去分化並隨時間進行增殖之後產生的細胞集落。[0024]圖7表示在使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡使GFP轉染的小鼠成纖維細胞(NIH3T3-GFP細胞)去分化之後產生的細胞集落。
[0025]圖8為表示胚胎幹細胞特異性基因(即，0ct3/4和Nanog)在去分化的小鼠成纖維細胞(NIH3T3去分化的細胞)中表達的圖。[0026]圖9表示去分化的小鼠成纖維細胞(NIH3T3去分化的細胞)具有分化能力。
[0027]圖10為表示分化特異性基因(即，AFP、Foxfl和β -1II微管蛋白)在去分化的小鼠成纖維細胞(ΝΙΗ3Τ3去分化的細胞)分化時表達的圖。
[0028]圖11表示在通過胚胎幹細胞衍生的微囊泡與布雷菲德菌素A (BFA)聯合處理使小鼠成纖維細胞(ΝΙΗ3Τ3細胞)去分化之後產生的細胞集落。
【具體實施方式】
[0029]本發明提供一種製備誘導多能性幹細胞的方法，所述方法包括使用包含胚胎幹細胞衍生的微囊泡的組合物處理體細胞，從而使體細胞去分化。
[0030]本發明使用的胚胎幹細胞可來源於人類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛，但是本發明不限於此。
[0031]本文使用的「微囊泡」被脂質雙層分為內側和外側，所述脂質雙層由衍生的細胞的細胞膜成分構成，所述微囊泡包括所述細胞的細胞膜脂質、細胞膜蛋白質、核酸和細胞成分，並且所述微囊泡的尺寸比原始細胞的尺寸小，但是本發明不限於此。
[0032]本發明的微囊泡可通過如下方法由包含胚胎幹細胞的懸浮液製備，所述方法選自:擠壓、超聲處理、細胞溶解、同質化、冷凍-解凍、電穿孔、機械降解以及用化學物質處理，但是本發明不限於此。
[0033]在本發明的一種實施方式中，微囊泡的膜還可包含不同於胚胎幹細胞的細胞膜的成分。
[0034]不同於細胞膜的成分可包括靶向分子、細胞膜與靶細胞融合所必需的物質(融合劑)、環糊精、PEG，等等。此外，不同於細胞膜的成分可通過各種不同的方法添加，所述方法包括細胞膜的化學修飾。
[0035]例如，微囊泡的膜成分可通過使用巰基(-SH)或氨基(-NH2)的化學方法或通過將PEG化學連接至微囊泡被化學修飾。
[0036]本發明可進一步包括在製備本發明的微囊泡的過程中對微囊泡的膜成分進行化學修飾。
[0037]此外，本發明的胚胎幹細胞包括轉化的細胞。具體而言，所述轉化的細胞包括被轉化為表達細胞膜與特定蛋白質、靶分子或靶細胞融合所必需的物質的細胞，並且所述轉化的細胞還包括由至少兩種轉化的細胞組合構成的轉化的細胞，但本發明並不限於此。
[0038]胚胎幹細胞可通過物質的處理或轉導被轉化，並且所述胚胎幹細胞可被轉化至少兩次。
[0039]在本發明的另一實施方式中，胚胎幹細胞可被轉化為抑制至少一種特定蛋白質的表達。
[0040]在本發明的又一實施方式中，胚胎幹細胞可被轉化為表達選自細胞粘附分子、抗體、靶向蛋白、細胞膜融合蛋白以及它們的融合蛋白中的至少一種。[0041]在本發明的又一實施方式中，胚胎幹細胞可被轉化為過表達胚胎幹細胞特異性蛋白質，即，0ct3/4、Nanog或者Sox_2蛋白質。
[0042]在本發明的又一實施方式中，本發明的組合物還可包括不同於胚胎幹細胞衍生的微囊泡的成分。
[0043]例如，包含胚胎幹細胞衍生的微囊泡和刺激體細胞去分化的物質的組合物可用於處理體細胞。額外的物質包括布雷菲德菌素A (BFA)、BiP誘導物X (BIX)和丙戊酸(VPA)。
[0044]下文中提供示例性的實例以幫助理解本發明。然而，本發明提供的下列實例可能更加易於理解本發明，但是本發明的範圍不限於實施例。
[0045]實施例1.胚胎幹細胞衍生的微囊泡的製備
[0046]以5X IO6個細胞/ml的濃度將小鼠胚胎幹細胞重懸於3ml磷酸緩衝鹽水(PBS)溶液中。使重懸液流過孔徑為IOym的膜過濾器10次，流過孔徑為5μπι的膜過濾器10次。將lml50%0ptiPr印?、lml5%0ptiPr印"和3ml流過膜過濾器的細胞懸浮液放置於5ml超速離心管中。隨後，在100，OOOXg的條件下進行超速離心處理持續2小時。在50%0ptiPi^p?和5%0ptiPrep?之間的層中獲得微囊泡。
[0047]實施例2.胚胎幹細胞衍生的微囊泡的性質分析
[0048]將根據實施例1所述的方法由胚胎幹細胞製備的微囊泡吸附在輝光放電碳包被的銅網上持續3分鐘。用蒸餾水洗滌所述網並且用2%乙酸鈾醯染色I分鐘，使用透射電子顯微鏡JEMlOl (Jeol，Japan)觀察到的結果如圖1所示。
[0049]如圖1的TEM圖像所示 ，可以看到通過擠壓由胚胎幹細胞製備的微囊泡由脂質雙層構成，並且通常形成尺寸為IOOnm至200nm的球形。
[0050]將實施例1所述的由胚胎幹細胞製備的微囊泡稀釋於Iml PBS中，使其濃度達到5ug/mL.將含有微囊泡的Iml PBS放置於比色皿中並使用動態光散射粒度分析儀進行分析，結果如圖2所示。
[0051]圖2所示的結果證實了微囊泡的尺寸為50nm至IOOnm,平均尺寸為70nm。
[0052]根據實施例1所述的方法由胚胎幹細胞製備50 μ g微囊泡，並製備10 μ g胚胎幹細胞的全細胞裂解物，加入5X上樣染料(250mM Tris-HCl, 10%SDS, 0.5%溴酚藍，50%甘油)，使上樣染料的終濃度為IX上樣染料，在100°C下處理得到的溶液5分鐘。製備8%聚丙烯醯胺凝膠，隨後上樣。在80V的條件下對樣品進行電泳分離持續2小時，並在400mA的條件下將蛋白質轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜持續2小時。將脫脂牛奶溶於PBS中，使濃度達到3%，並在該溶液中封閉所述膜2小時。在4°C條件下用0ct3/4和β-肌動蛋白的抗體處理所述膜12小時。用PBS洗滌得到的膜兩次，在室溫下再用連接有過氧化物酶的二抗處理所述膜I小時。得到的膜用PBS洗滌30分鐘並使用增強化學發光(ECL; Amersham C0.N0.RPN2106)底物進行鑑定，結果如圖3所示。
[0053]圖3所示的結果證實了由胚胎幹細胞製備的微囊泡中存在胚胎幹細胞特異性蛋白質，即0ct3/4。
[0054]使用RNeasy'kMini試劑盒(QIAGEN, Cat.N0.74104),從根據實施例1所述的方
法由胚胎幹細胞製備的微囊泡和胚胎幹細胞中提取總基因(RNA)。使用特異性基因引物和PCR試劑盒(BIOLAB，Cat.N0.E5000)從提取的RNA中獲得多種cDNA，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，並且使用溴化乙錠(ETBR)染色進行鑑定。為了保證使用相同量的RNA作為陽性對照(胚胎幹細胞)，還一同鑑定了管家基因(甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH))。使用5』 -AGACCATGTTTCTGAAGTGC-3』作為胚胎幹細胞特異性基因(即，Oct-3/4)的正義引物，使用5』 -GAACCATACTCGAACCACA-3』作為胚胎幹細胞特異性基因(即，Oct-3/4)的反義引物。使用5』 -CTAGTTCTGAGGAAGCATCG-3』作為另一胚胎幹細胞特異性基因(即，Nanog)的正義引物，使用5』 -TCTCAGTAGCAGACCCTTG-3』作為該胚胎幹細胞特異性基因(即，Nanog)的反義引物。圖4所示的基因表達圖像用於胚胎幹細胞衍生的微囊泡的性質分析。
[0055]圖4所示的結果證實了胚胎幹細胞特異性基因(B卩，0ct3/4和Nanog)在胚胎幹細胞製備的微囊泡中表達。
[0056]實施例3.使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡使體細胞去分化
[0057]用0.1%的明膠包被6孔平板並在該平板上接種8 X IO4個NIH3T3細胞，孵育細胞24小時。隨後，用PBS洗滌每個孔，將2ml根據實施例1所述的方法由胚胎幹細胞製備的微囊泡稀釋於成纖維細胞培養基(DMEM，10%FBS, 100U/ml青黴素-鏈黴素)中，使其濃度達到100 μ g/ml,隨後用其處理孵育的NIH3T3細胞。48小時後，識別出每孔大約2個細胞集落至3個細胞集落，並且每個細胞集落的尺寸為約10 μ m至100 μ m。使用電子顯微鏡觀察細胞集落，結果如圖5所示。
[0058]圖5所示的結果證實了使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡使NIH3T3細胞去分化，從而誘導細胞集落。用PBS洗滌每個孔，並加入400 μ 10.1XTE (胰蛋白酶-EDTA)。I分鐘後，使用移液器將10μ IlXTE加至細胞集落中，並將移液器的尖端置於細胞集落周圍進行抽吸。將取出的細胞集落稀釋於500 μ I胚胎幹細胞培養基(knock-out DMEM，15%knock_outFBS, 10ng/ml LIF，0.lmM2-巰基乙醇，4mM L-穀氨醯胺，10 μ g/ml 慶大黴素，100U/ml 青黴素-鏈黴素)中，接種於0.1%明膠包`被的24孔平板中，並孵育5天或更長時間。
[0059]在細胞生長至80%匯合或更高程度匯合時，使用I X TE將全部體細胞稀釋於2ml胚胎幹細胞培養基中，並且在0.1%明膠包被的6孔平板中傳代培養。通過上述相同的方法，在細胞生長至80%匯合時，將細胞稀釋於8ml培養基中，在0.1%明膠包被的IOOmm培養皿中傳代培養，並且每兩天至三天重複一次傳代培養。
[0060]如圖6所示，通過5天或更長時間的觀察結果證實了細胞集落連續增殖。
[0061]實施例4.誘導多能性幹細胞的來源的確定
[0062]使用逆轉錄病毒(pMSCV)，將GFP基因注入NIH3T3細胞的基因組。轉化的細胞表現出綠色螢光，但是形成微囊泡的胚胎幹細胞未顯示出螢光。6孔平板包被有0.1%的明膠並且接種有8 X IO4個NIH3T3GFP細胞，孵育細胞24小時。隨後，用PBS洗滌每個孔，將實施例1中製備的胚胎幹細胞衍生的微囊泡稀釋於2ml成纖維細胞培養基(DMEM，10%FBS,100U/ml青黴素-鏈黴素)中，使其濃度達到100μ g/ml，並將其用於處理NIH3T3GFP細胞。48小時後，識別出每孔約2個細胞集落至3個細胞集落，並且細胞集落的尺寸為約10 μ m至100 μ m，通過電子顯微鏡觀察到的結果如圖7所示。
[0063]根據常規研究可知，去分化需要經歷一段很長的時間段，例如至少7天至30天，但是，如圖6和圖7所示，在使用本發明的胚胎幹細胞衍生的微囊泡的情況下，僅僅在48小時內就形成細胞集落，因此去分化的時間可顯著縮短。
[0064]實施例5.誘導多能性幹細胞的性質確認
[0065]通過洗滌劑相容性蛋白分析(DC)對根據實施例3所述的方法增殖了 40天的細胞集落(NIH3T3衍生的去分化細胞)、胚胎幹細胞和NIH3T3細胞的全細胞裂解物進行定量分析，分別製備50 μ g的根據實施例3所述的方法增殖了 40天的細胞集落(NIH3T3衍生的去分化細胞)、50μ g胚胎幹細胞和50μ g [!1313細胞的全細胞裂解物，並加入5\上樣染料，使上樣染料的終濃度為I X上樣染料，並在100°C下處理5分鐘。製備8%的聚丙烯醯胺凝膠，並上樣。在80V條件下使樣品進行電泳分離持續2小時，在400mA條件下將蛋白質轉移至PVDF膜持續2小時。根據待施加的抗體使用不同的封閉緩衝液封閉膜。在使用肌動蛋白抗體的情況下，將脫脂牛奶溶於PBS中，使脫脂牛奶的濃度為3%，在使用Oct3/4抗體的情況下，將脫脂奶粉溶於PBS中，使其濃度為5%，在使用Nanog抗體的情況下，將10%脫脂奶粉溶於PBS中，使其濃度為10%，並且在該溶液中封閉膜2小時。在4°C條件下使用0ct3/4、Nanog和β-肌動蛋白的抗體處理所述膜12小時，用PBS洗滌膜兩次，在室溫下用連接有過氧化物酶的二抗處理所述膜I小時。用PBS洗滌得到的膜30分鐘，使用ECL底物進行鑑另IJ，結果如圖8所示。
[0066]圖8所示的結果證實了胚胎幹細胞特異性蛋白質(即，0ct3/4和Nanog)在通過胚胎幹細胞衍生的微囊泡去分化的NIH3T3去分化細胞(誘導多能性幹細胞)中表達。
[0067]實施例6.誘導多能性幹細胞的自發分化的確認
[0068]本發明對通過實施例3所述的方法增殖了 40天的誘導多能性細胞自發分化為所有細胞的能力進行了確認，從而鑑定通過實施例3所述的方法增殖了 40天的誘導多能性細胞的功能。當胚胎幹細胞成為胚體時，胚體具有自發分化為所有細胞的能力。通過相同的原理，通過懸滴法誘導的細胞被誘導進行強制性聚集。使用胰蛋白酶將集落細胞懸浮並稀釋於分化培養基(IMDM, 20%FBS, 4mM L-穀氨醯胺，10 μ g/ml慶大黴素，100U/ml青黴素-鏈黴素)中，使其濃度達到3.3 X 104/ml。將30μ1 (IX IO3)各稀釋溶液施加於細菌培養皿的上表面，並且誘導聚集持續2天。用分化培養基洗滌聚集在細菌培養皿上表面的細胞以在細胞培養皿中重懸細胞，並孵育2天。圖8為在細菌培養皿中懸浮的聚集的誘導多能性幹細胞的圖像。通過相同 的方法，通過懸滴法誘導聚集ΝΙΗ3Τ3細胞和胚胎幹細胞。
[0069]將胚體稀釋於分化培養基中，達到3/ml的匯合度，隨後將2ml稀釋的胚體注入
0.1%明膠包被的6孔平板的每個孔中進行孵育。轉移新鮮培養溶液兩次，即，每隔8天轉移一次，孵育持續16天。圖9顯示誘導分化後的細胞。
[0070]使用RNeasy_?Mini試劑盒(QIAGEN，Cat.N0.74104)從分化的細胞中提取總基因(RNA)。使用特異性基因引物和PCR試劑盒(BIOLAB, Cat.N0.E5000)從提取的RNA中獲取多種cDNA，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，並通過ETBR染色進行識別。為了保證使用相同量的RNA作為陽性對照(胚胎幹細胞)，還一同鑑定了管家基因(肌動蛋白)。誘導多能性幹細胞的自發分化的結果證實了細胞被分化為NIH3T3去分化細胞的內胚層(AFP)、中胚層(Foxfl)和外胚層(b-1II 微管蛋白)。對於 AFP 而言，5』 -AACTCTGGCGATGGGTGTT-3』用作正義引物，5』 -AAACTGGAAGGGTGGGACA-3』用作反義引物。對於Foxfl而言，5』 -CGTGTGTGATGTGAGGTGAG-3』 用作正義引物，5』 -CTCCGTGGCTGGTTTCA-3』 用作反義引物。對於b-1II微管蛋白而言，5』 -TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG-3，用作正義引物，5』-GGCCCTGGGCACATACTTGTG-3』用作反義引物。圖10顯示用於檢查基因是否表達的圖像，從而證實NIH3T3去分化細胞(誘導多能性幹細胞)的自發分化能力。
[0071]圖10所示的圖像證實了內胚層、中胚層和外胚層基因在NIH3T3去分化細胞中表達，這說明NIH3T3去分化細胞具有自發分化能力。
[0072]實施例7.同時使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡和BFA進行處理使體細胞去分化
[0073]用0.1%明膠包被6孔平板，並將8 X IO4個NIH3T3細胞接種於每個孔並孵育24小時。在用PBS洗滌孔之後，將實施例1中製備的胚胎幹細胞衍生的微囊泡稀釋於2ml成纖維細胞培養基(DMEM，10%FBS, 100U/ml青黴素-鏈黴素)中，使其濃度達到100 μ g/ml，並將BFA稀釋於2ml成纖維細胞培養基(DMEM，10%FBS, 100U/ml青黴素-鏈黴素)中，使其濃度達到2 μ Μ，隨後用得到的各產物處理孵育的ΝΙΗ3Τ3細胞。48小時後，識別出每孔2個細胞集落至3個細胞集落，並且細胞集落的尺寸為約10 μ m至100 μ m。通過電子顯微鏡觀察到的結果如圖11所示。
[0074]圖11所示的結果證實了可誘導細胞集落產生，甚至當同時使用胚胎幹細胞衍生的微囊泡與BFA進行處理時，也會誘導細胞集落產生。
[0075]用PBS洗滌每個孔，並加入400 μ 10.1 X TE(胰蛋白酶-EDTA)。I分鐘後，使用移液器將10μ IlXTE加至細胞集落中，並將移液器尖端置於細胞集落的周圍進行抽吸。將取出的細胞集落稀釋於500 μ I胚胎幹細胞培養基(knock-out DMEM, 15%knock_out FBS, IOng/ml LIF，0.lmM2-巰基乙醇，4mM L-穀氨醯胺，10 μ g/ml慶大黴素，lOOU/ml青黴素-鏈黴素)中，接種於0.1%明膠包被的24孔平板，並孵育5天或更長的時間。
[0076]如圖11所示，證實了細胞集落連續增殖。
[0077]雖然通過本發明的一些示例性的實施方式對本發明進行了說明和描述，但是，本領域技術人員會理解的是，在不背離所附的權利要求界定的本發明的實質和範圍的條件下，可對本發明作出各種形式上 的改變並在細節上對本發明作出改變。
[0078]【工業實用性】
[0079]因為根據本發明的製備誘導多能性幹細胞的方法使用了利用微囊泡融合遞送細胞質的方法，所以，可以預見到的是，體細胞的去分化可有效進行而沒有副作用，並且本發明的方法可有效地用於研發對個體具有不同免疫相容性的細胞療法產品。
【權利要求】
1.一種製備誘導多能性幹細胞的方法，所述方法包括: 用包含胚胎幹細胞衍生的微囊泡的組合物處理體細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述胚胎幹細胞來源於選自人類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛中的一種。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述胚胎幹細胞為轉化的細胞。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述胚胎幹細胞為被轉化為過表達作為胚胎幹細胞特異性蛋白質的Oct3/4, Nanog或Sox_2蛋白質的細胞。
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述胚胎幹細胞為被轉化為表達選自細胞粘附分子、抗體、靶向蛋白、細胞膜融合蛋白以及它們的融合蛋白中的至少一種的細胞。
6.如權利要求1所述的方法，其中，所述微囊泡的膜還包括不同於胚胎幹細胞的細胞膜的成分。
7.如權利要求6所述的方法，其中，不同於細胞膜的成分為環糊精或聚乙二醇。
8.如權利要求1所述的方法，其中，所述微囊泡的膜成分被化學修飾。
9.如權利要求1所述的方法，其中，所述組合物還包括不同於胚胎幹細胞衍生的微囊泡的成分。
10.如權利要求9所述的方法，其中，所述不同於胚胎幹細胞衍生的微囊泡的成分為布雷菲爾德菌素A (BFA)，BiP誘導物X (BIX)或丙戊酸(VPA)。
11.一種根據權利要求1至10任一項所述的方法製備的誘導多能性幹細胞。
12.—種細胞療法產品，所述細胞療法產品包含權利要求11所述的誘導多能性幹細胞。
【文檔編號】C12N5/0735GK103492554SQ201280020868
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年4月19日 優先權日:2011年4月28日
【發明者】鄭多英, 金俊鎬, 樸宰成, 李南雨, 高用柗, 金潤根, 張壽哲, 崔銀廷 申請人:浦項工科大學校產學協力團