一種可視化跟蹤的家蠶生物反應器快速表達ns1蛋白的方法
2023-06-07 21:06:26 1
一種可視化跟蹤的家蠶生物反應器快速表達ns1蛋白的方法
【專利摘要】本發明涉及一種可視化跟蹤的家蠶生物反應器快速表達NS1蛋白的方法，是構建攜帶有egfp表達盒和ns1基因表達盒的供體質粒，用該供體質粒轉化大腸桿菌DH10B感受態細胞，供體質粒序列上Tn7R-Tn7L之間的egfp表達盒和ns1基因表達盒可特異性轉座到Bm-Bacmid載體上，構建表達egfp和ns1基因的整合型重組真核表達載體，將其轉染昆蟲細胞後產生的重組芽生型BV病毒粒子感染家蠶，通過可視化的綠色螢光信號實時監測家蠶體內病毒增殖的情況。本發明能大規模地、實時監測外源基因在家蠶體內的表達動態情況，為揭示NS1蛋白及其它功能蛋白的特性奠定了基礎。
【專利說明】一種可視化跟蹤的家蠶生物反應器快速表達NS1蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程技術，公開了家蠶生物反應器可視化跟蹤表達系統的構建流程及其應用。具體而言，特指一種重組芽生型病毒粒子BV的製備方法、及利用這種病毒在家蠶生物反應器中快速、高效表達家蠶二分濃核病毒非結構蛋白NSl，為NSl蛋白的後續功能和結構研究奠定基礎，該方法同樣也適用於其它外源基因以及具有重要功能的重組蛋白藥物的表達。
【背景技術】
[0002]杆狀病毒-昆蟲細胞表達系統(BEVS)是當今基因工程四大表達系統之一，所利用的杆狀病毒表達載體大都是選擇苜猜丫紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)或者家蠶核型多角體病毒(BmNPV)。在眾多的表達系統中，鑑於外源基因在原核表達系統中的表達產量相對較高，因此在表達外源基因時往往首選原核表達系統，但鑑於表達產物是以包涵體形式存在，產物沒有生物活性且缺乏翻譯後修飾，限制了該系統的進一步應用；單細胞酵母表達系統是一種真核表達系統，但其只能夠對表達產物進行一些簡單的糖基化修飾，表達產物具有一定的生物活性；哺乳動物細胞是一種理想中的真核表達系統，具有對翻譯後的產物進行加工和翻譯，所產生的蛋白在活性方面遠勝於其它真核表達系統，更接近於天然蛋白質，但由於該系統中的外源蛋白表達量偏低，並且培養細胞所需要的成本很高，目前還難以滿足大規模的實際應用。而BEVS中所表達的產物不僅具有正確的摺疊，也具有翻譯後加工、糖基化和磷酸化修飾等特性，所表達的產物在生物活性、抗原性和免疫原性都接近於其對應的天然產物，這些特性使BEVS成為一種應用廣泛的表達系統(Kato et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85:459-470 ；Prabhakar et al., MolBiotechnol, 2010, 46:80 - 89)。
[0003]由於BEVS具有眾多獨.特的特性以及安全性好，現已廣泛應用於藥物研發、疫苗生產以及重組病毒殺蟲劑等眾多研究領域中，是一種非常理想的真核表達系統，但該表達系統需要在培養的昆蟲細胞中表達外源蛋白，所需費用昂貴，不適於大規模表達外源蛋白，而利用家蠶作為生物反應器則可以克服這個不利條件。家蠶是我國的一種重要經濟昆蟲，主要以桑葉為食，容易大規模飼養，所需要的培養設備簡單，成本低廉，生產周期短，非常適於大規模表達具有重要功能的重組蛋白；另外，家蠶全基因組序列測定的完成(Xia et al.，Science, 2009，326:433 - 436.)，也有助於我們對家蠶進行遺傳改造，由此可以培育出更有利於外源蛋白表達的新品種，到目前為止，全球至少已有30個實驗室在利用家蠶作為生物反應器開展蛋白藥物方面的研究，自1985年首次利用家蠶生物反應器高效表達了人幹擾素-α (IFN-α ) (Maeda et al., Nature, 1985, 315:592 - 594)以來，30多種重組蛋白包括人生長因子、人2，6-唾液酸轉移酶、人粒-巨噬細胞集落刺激因子以及人抗白蛋白免疫球蛋白Gl等功能蛋白藥物在家蠶生物反應器中都成功地獲得了表達(Kadono-Okuda et al., Biochem Biophys Res Commun, 1995, 213:389 - 396;Ogata etal.，BMC Biotechnolj 2009b, 9:54;Chen et al.，J Biotechnolj 2006, 123:236 - 247;Parket al., J Biotechnol，2009，139:108 - 114)，基於家蠶生物反應器巨大的商業前景，世界上很多國家都加大投資力度對家蠶生物反應器進行研發。
[0004]在家蠶體內表達外源蛋白，須製備具有感染性的重組病毒，而用傳統的方法製備重組病毒需要經過多輪空斑篩選，其技術操作繁瑣，僅鑑定與純化重組病毒粒子就需要耗費一個多月的時間，還容易得到假陽性重組病毒。自1993年Luckow等(Luckow et al.，JVirol, 1993,67:4566-4579)構建了一種可以在大腸桿菌細胞中進行修飾改造的家蠶穿梭表達載體(Bm-Bacmid)後,可對供體質粒(pFastBacI)進行改造並轉化含有Bm-Bacmid的大腸桿菌DHlOB細胞中，在位點特異性轉座酶的作用下，供體質粒上Tn7R-Tn7L間的DNA片段就可以特異性轉座到Bm-Bacmid上，進而將鑑定正確的重組Bm - Bacmid轉染培養的BmN細胞，收集轉染5天後的培養上清就可獲得重組芽生型病毒粒子，由此，重組病毒的構建流程得到了很大的簡化。將收集後的轉染上清感染家蠶或者繼續感染培養的BmN細胞，對感染後的家蠶或者BmN細胞總蛋白進行免疫印跡(Western blot)分析,就可以對目的蛋白是否表達進行檢測，進而縮短了靶基因在BEVS中表達所需要的時間。
[0005]然而，Bm-Bacmid的基因組較大，是以低拷貝的形式在大腸桿菌DHlOB細胞中進行複製，其次，脂質體介導的重組Bm-Bacmid轉染BmN細胞時效率又比較低，同時，研究表明還有一些具有特殊理化性質的蛋白在BEVS中往往難表達或者表達量偏低，因此，對構建的重組Bm-Bacmid轉染的細胞中是否產生了重組病毒粒子進行快速鑑定是外源基因順利表達的一個關鍵因素。以往在真核表達過程中，通過Western blot檢測不到表達的靶蛋白，會令我們懷疑整個實驗的設計及其流程，尤其會質疑重組Bm-Bacmid轉染BmN細胞後，在細胞培養上清中是否產生了具有感染性的重組芽生型病毒粒子？因為這不僅關係到靶基因在BEVS中能否快速表達，同時也是目前制約靶蛋白功能與結構研究的一個瓶頸。而僅僅通過細胞形態上的變化難免對轉染成功與否會產生誤判，因此有必要創建一個能有效跟蹤重組芽生型病毒粒子產生以及擴散的可視化信號，這樣就可避免反覆通過RT-PCR和Westernblot對目的基因轉錄以及表達與否來進行驗證，做到省時省力又節省試劑。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是:建立一種可跟蹤外源基因是否進入家蠶體內進行表達的鑑定手段。主要技術路線是通過對供體質粒pFastBacI進行改造,構建egfp表達盒和多角體啟動子控制下的可用於外源DNA片段插入的一個重組供體質粒，通過酶切連接的方式將nsl基因連接在多角體啟動子下遊，構建的該重組質粒在轉座酶的作用下，特異性地轉座到Bm-Bacmid中，通過脂質體Cellfectin介導重組的Bm-Bacmid轉染BmN細胞,利用綠色螢光信號可迅速判定轉染後的BmN細胞中重組病毒粒子產生的情況，將收集後的轉染上清對4齡家蠶進行皮下注射，創建可視化跟蹤的家蠶生物反應器大規模表達NSl蛋白。
[0007]本發明所要解決的問題是通過以下技術方案來實現的:
[0008]一種可視化跟蹤的家蠶生物反應器快速表達NSl蛋白的方法，通過構建攜帶有
egfp表達盒和nsl基因表達盒的pFastBac1-|Pie1-gg-sv40|-[Ppol-/;s1-sv40 |供體質粒，該供體
質粒轉化大腸桿菌DHlOB感受態細胞，供體質粒序列上Tn7R-Tn7L之間的egfp表達盒和nsl基因表達盒可特異性轉座到Bm-Bacmid載體上,構建表達egfp和nsl基因的整合型重組真核表達載體，將其轉染昆蟲細胞後產生的重組芽生型病毒粒子BV皮下注射家蠶，通過可視化的綠色螢光信號實時監測家蠶體內病毒增殖的情況，創建一種新穎的利用家蠶生物反應器大規模地表達NSl蛋白的方法，為進一步揭示NSl蛋白的功能與結構研究提供基礎。
[0009]所述egfp基因表達盒與nsl基因表達盒是串聯排列的。
[0010]所述的
【權利要求】
1.一種可視化跟蹤的家蠶生物反應器快速表達NSl蛋白的方法，其特徵在於，構建攜帶有egfp表達盒和nsl基因表達盒的
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的
【文檔編號】C12N15/66GK103436557SQ201310299415
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月17日 優先權日:2013年7月17日
【發明者】李國輝, 王鵬, 唐琦, 胡朝陽, 姚勤, 陳克平, 李芒芒, 徐五 申請人:江蘇大學