酶法水解黃芪皂苷糖基製備黃芪甲苷的方法

2023-06-07 23:32:01 1

專利名稱：酶法水解黃芪皂苷糖基製備黃芪甲苷的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備低糖基黃芪皂苷的方法，尤其是一種用能水解黃芪皂 苷糖基的酶處理黃芪皂苷糖基，以提高黃芪甲苷含量的酶法水解黃芪皂苷糖基 製備黃芪甲苷的方法。
背景技術：
-黃芪是常用中藥之一，具有提高人體免疫力、補氣、降壓、強心、消炎去 腫、抗病毒等功效。目前我國藥用的主要品種是蒙古黃芪C^^^"^膨w6ra"acews [Fisch.] Bge var. wo"g/zo//cw1s)禾口膜莢黃甚(JWraga/ws 膨w6ra"acews [Fisch.] Bge [Phaca膨附Z)ra"ctcea Fisch.]。黃芪中的主要有效成分為黃芪皂苷(新鮮黃芪根中皂苷糖基上往往帶有乙醯基，但在加工生曬過程 中將乙醯基去掉，但是黃芪中含量高的皂苷十三根和四個糖基的皂苷，藥效顯 著的戀歌糖基的黃貧甲苷含量卻低《餘瑛、楊勝華華西藥學雜誌，8 (3)， 165-166， 1993》)。黃芪甲苷其學名為3-0-(l3-D-木糖基)，6-0-(3-D-葡萄糖基黃 芪苷元，其化學分子結構為黃芪皂苷中大多是三個和四個糖基的皂苷即在黃芪甲苷3-O-Xyl (木糖 基)上結合葡萄糖基(Glc)或者鼠李糖基(Rha)，成為雙糖3-O-Xyl-Glc或 3-OXyl-Rha，其化學分子結構為
或者在黃芪甲苷3-O-Xyl (木糖基)結合葡萄糖基(Glc)或者鼠禮糖基 (Rha)，或者第25碳的羥基上屆和葡萄糖基(Glc)等，其化學分子結構如下:O-Glc本發明用酶法水解黃芪中含量高的三個和四個糖基的黃芪皂苷的部分糖 基，轉化成藥效高的黃芪甲苷，可製備高含黃芪甲苷的黃芪製品(黃芪片或者 粉末)、高含黃甚甲苷的總皂苷，或者由此提高黃貧甲苷的提取率。

發明內容
本發明是為了解決現有技術中所存在黃芪甲苷含量低的技術問題，提供一 種酶法水解黃芪中含量高的皂苷糖基(含三個和四個糖基)，製備黃芪甲苷的方 法，無汙染、目的性強、轉化率高。本發明的技術解決方案是 一種酶法水解黃芪中含量高的三個和四個糖基 的皂苷，轉化成含兩個糖基的黃芪甲苷的方法，其特徵在於用酶水解黃芪皂 苷糖基轉化成黃芪甲苷。所述的酶是以黃甚皂苷或黃酮或異黃酮為發酵產酶誘導物，由細菌、鏈黴 所述的酶是以黃芪皂苷或黃酮或異黃酮為發酵產酶誘導物，產出能水解黃芪皂 苷糖基的酶，並大大提高其產酶量。該酶由細菌、鏈黴菌、黴菌、酵母菌、擔 子菌發酵方法製備；發酵方法可用液態發酵法或固態發酵法。固態發酵產酶之 後，用醋酸緩衝液、磷酸緩衝液、Tris緩衝液等常規緩衝液提取酶，即成發酵 酶液；液體發酵產酶、除菌除雜、即成發酵酶液；將其發酵酶液中加入硫酸銨 或者乙醇沉澱酶蛋白，收集沉澱，用1A0體積的緩衝液溶解沉澱，除雜，即得 濃縮的粗酶液；該粗酶液經酶蛋白分離中常用的離子交換樹脂柱，色譜主或者 電泳方法分離得到經黃芪皂苷轉化為黃芪甲苷的純酶。上述酶處理黃芪總皂苷，使3個和4個糖基的黃芪皂苷轉化成黃芪甲苷而 提高黃芪總皂苷中的黃芪甲苷的含量4 6倍以上；上述酶液處理黃芪、黃芪片、 黃芪粉末，提高黃芪中的黃芪甲苷含量4 6倍以上的黃芪製品；由此從酶處理 的黃芪、黃芪總皂苷中分離提取黃芪皂苷，提高黃芪甲苷的提取率。其酶的反 應溫度為4 60"C， PH值為3 10,反應時間為4 40小時。本發明同現有技術相比，最大的特點是在細菌、鏈黴菌、黴菌、酵母菌、 擔子菌等微生物發酵中加入了黃芪皂苷或黃酮或異黃酮等產酶誘導物，大大提 高能水解黃芪皂苷糖基酶的產量。用產出的酶(粗製酶或純化酶)處理黃芪， 使3個和4個糖基的黃甚皂苷轉化成黃芪甲苷而提高了黃芪甲苷的含量，可制 備黃芪甲苷含量高的黃芪片、粉末等其他製品。用產出的酶(粗製酶或純化酶) 處理黃芪總皂苷，使3個和4個糖基的黃芪皂苷轉化成黃芪甲苷，而提高黃芪 總皂苷中的黃芪甲苷的含量，由此提高了黃芪甲苷的提取率；克服了酸鹼法處 理糖基所存在的對皂甙破壞性大、汙染嚴重、目的性差等缺點，具有無汙染、 目的性強、轉化率高的優點。
具體實施例方式實施例1:a. 黑麴黴菌(Ap^7/w "/gw)在含5%麥芽水浸出物、1%產酶誘導物一 一黃芪水浸出物的培養基中，在溫度28~30°C條件下攪拌通風培養50~100小時， 離心除菌得上清液(含酶混合液)，在上清液中用60~75%飽和度的硫酸銨沉澱 酶蛋白、收集蛋白，溶於1/10發酵液體積的常用的醋酸緩衝液(0.02M，pH 5.0)、 或者磷酸緩衝液、Tris緩衝液中，透析除去硫酸銨，離心除渣，即為酶液；b. 用50毫升上述酶液、3克黃芪皂苷和100毫升醋酸緩衝液(0.02M，pH5.0) 混合均勻，在溫度20 55'C條件下反應6 24小時，再加入l/3體積的正丁醇萃取 皂甙三次，減壓蒸乾，得到黃芪皂苷粗品。用矽膠柱分離方法(文獻3)得到 0.5 0.8克的黃芪甲苷，黃芪甲苷的轉化率達到60 卯％，比從原3克黃芪皂苷中 直接提取黃芪甲苷提高了 6倍。上述酶液DEAE-Cellulose離子交換樹脂柱方法和BioRed蛋白製備色譜儀 (文獻5)分離提純黃甚甲苷酶蛋白，用SDS電泳方法(文獻6)測定分子量， 酶的分子量為5.0萬。
實施例2:a. 米麴黴菌(^y/ eg/〃^ 07加e)在含5%麥麩水浸出物、0.02%產酶誘導物 一大豆異黃酮或者含黃酮類的蘆丁、或者0.6%其黃酮類來源植物-槐花的水浸出 物的培養基中，在溫度28 3(TC條件下攪拌通風培養50 100小時，離心除菌得 上清液(含酶混合液)，在上清液中用60~75%飽和度的硫酸銨沉澱酶蛋白、收 集蛋白，溶於1/10發酵液體積的的常用的醋酸緩衝液(0.02 M， pH5.0)、或者 磷酸緩衝液、Tris緩衝液中，透析除去硫酸銨，離心除渣，即為酶液；b. 用酶液按實施例l的方法處理黃芪皂苷，提純和檢測酶反應產物的結果 是產物主要是黃芪甲苷，黃芪皂苷中黃芪甲苷的轉化率達到60%以上。上述酶液經DEAE-Cellulose離子交換樹脂柱方法和BioRed蛋白製備色譜儀 (文獻5)分離提純黃芪甲苷酶蛋白，用SDS電泳方法(文獻6)測定分子量， 酶的分子量為5.3萬。 實施例3:用實施例1或實施例2的方法製備40毫升酶液，加入到10克黃芪片、或者粉 末中，在溫度35 4(TC條件下浸泡黃芪片4 40小時，乾燥黃芪片，用高效液相 色譜法(文獻7)測定黃芪片中的黃芪甲苷含量，比原黃芪片、或者粉末中的黃 芪甲苷含量提高6倍以上。實施例4:細菌a. 以高溫好氧菌&"7/w spJF2菌(文獻l)在含1%大豆浸出物、1%可溶性 澱粉、產酶誘導物一O.l %黃芪水浸出物、0.0P/。MgSO4培養基中，在溫度6(TC 條件下通風培養30 40小時，離心除菌得上清液(含酶混合液)，往上清液上加 入65%飽和度的硫酸銨沉澱酶蛋白，用0.02M、 pH5醋酸緩衝液透析，離心除雜，凍幹，得到黃芪皂甙酶；b. 將3克上述黃芪皂苷酶、IO克黃芪皂苷、IOOO毫升醋酸緩衝液(0.2 M， pH5.0)和150毫升乙醇混合均勻，在溫度40'C條件下攪拌反應12 24小時。反 應後加入6000毫升乙醇，過濾除去蛋白沉澱，濾液減壓蒸乾，得到10克黃芪甲 苷粗品，用薄層層析法(文獻2)檢測結果黃芪甲苷含量提高5倍。上述酶液DEAE-Cellulose離子交換樹脂柱方法和BioRed蛋白製備色譜儀 (文獻5)分離提純黃芪皂苷酶蛋白，用SDS電泳方法測定分子量(文獻6)，酶 的分子量為6.0萬。
實施例5:酵母菌a.假絲酵母在含產酶誘導物一黃芪粉10%和3%槐花(含黃酮類的蘆丁) 麥麩培養基(乾物1000克)上接種，分裝在茄子瓶中3(TC、培養3 6天，收 集培養物加入6000毫升的生理鹽水，浸泡一小時，離心取上清，即得到含酶混 合液，加入飽和度60 75%的硫酸按，使酶蛋白沉澱，收集沉澱，用800毫升 的pH5、 0.02M醋酸鈉緩衝液溶解，透析出去硫酸按，離心除渣，即得1000毫 升左右的酶液；b.將上述酶液按實施例1或實施例2或實施例3的方法處理黃芪皂苷、黃芪片 或者粉末，黃芪甲苷含量提高4倍。 實施例6:擔子菌大肥蔬菌"gan'a^ Wtogi^)培養在含產酶誘導物一黃甚粉和稻皮各10% 的麥麩培養基上，在溫度25'C條件下培養6-10天，按實施例5的方法提取酶 液，按實施例4的方法處理黃芪皂苷、黃芪片或者粉末，黃芪甲苷含量提高4.3倍。實施例7:將實施例l、 2得到的黑麴黴菌、米麴黴菌等微生物培養液(酶液)接種到 水分60 70%的黃芪或者黃甚片中，在溫度3(TC條件下培養1 5天，用高效液相 色譜法(HPLC法，文獻8)乾燥測定，黃芪甲苷含量提高6倍以上。參考文獻1. Fengxie Jin， et al(金鳳燮等)J. Gen Appl. Bact.， 1990, 36, 415-424,2. 張彩霞等基層中藥雜誌2000， 14(2), 32-33。.3. 徐人生主編，天然物化學，科學出版社，1997， pl7-20.4. 韓秀文等，波譜學雜誌，1999, 16 (6)， 533-539。5. Hongshan Yu, et al(魚紅山等)Chem. Pharm. Bull" 2002， 50(2)， 175-178。6. 張龍翔等升華實驗方法和技術，高等教育出版社，1997， plOO-lll。7. 景冬櫻等中國醫院藥學雜誌，27 (3)， 248-250。
權利要求
1.一種酶法水解黃芪皂苷糖基，製備黃芪甲苷方法，其特徵在於用酶處理黃芪或者黃芪總皂苷，使含量高的三個或者三個以上糖基的黃芪皂苷糖基水解，轉化為含兩個糖基的黃芪甲苷；製備高含黃芪甲苷的黃芪製品和高含黃芪甲苷的黃芪總皂苷、或者由此分離提取製備黃芪甲苷，提高黃芪甲苷的提取率。所述的酶是以黃芪皂苷或黃酮或異黃酮為發酵產酶誘導物，由細菌、鏈黴菌、黴菌、酵母菌、擔子菌發酵方法製備；發酵方法可用液態發酵法或固態發酵法。固態發酵產酶之後，用醋酸緩衝液、磷酸緩衝液、Tris緩衝液等常規緩衝液提取酶，即成發酵酶液；液體發酵產酶、除菌、即成發酵酶液；將其發酵酶液中加入硫酸銨或者乙醇沉澱酶蛋白，收集沉澱，用1/10體積的緩衝液溶解沉澱，除雜，即得濃縮的粗酶液；該粗酶液經酶蛋白分離中常用的離子交換樹脂柱，色譜主或者電泳方法分離得到經黃芪皂苷轉化為黃芪甲苷的純酶。
2. 權利要求l所述黴菌為麴黴屬C4^^^7/w)菌。
3. 權利要求1和2所述的酶法水解黃芪皂苷糖基制。備黃芪甲苷的特徵是 上述酶處理黃芪總皂苷，使3個和4個糖基的黃芪皂苷轉化成黃芪甲苷，製備 提高黃芪甲苷的含量4 6倍以上的黃芪總皂苷；上述酶液處理黃芪、黃芪片、 黃芪粉末，製備提高黃芪中的黃芪甲苷含量4 6倍以上的黃芪製品；由此從酶 處理的黃芪、黃芪總皂苷中分離提取製備黃芪皂苷，提高黃芪甲苷的提取率。 其酶的反應溫度為4 6(TC， PH值為3 10，反應時間為4 40小時。
全文摘要
本發明公開一種酶法水解黃芪皂苷糖基製備黃芪甲苷的方法，其特徵在於用酶水解黃芪皂苷糖基製備黃芪甲苷，所述的酶是以黃芪皂苷或黃酮或異黃酮為發酵產酶誘導物，由細菌、鏈黴菌、黴菌、酵母菌、擔子菌發酵製備。用產出的酶(粗製酶或純化酶)處理黃芪或者黃芪總皂苷，水解含糖基三個和四個的黃芪皂苷糖基，提高了黃芪甲苷的含量，可製備黃芪甲苷含量高的黃芪片、粉末等其他製品，可製備黃芪甲苷含量高的總皂苷，由此可提高黃芪甲苷的提取率。克服了酸鹼法處理糖基所存在的對皂甙破壞性大、汙染嚴重、目的性差等缺點，具有無汙染、目的性強、轉化率高的優點。
文檔編號C12R1/66GK101130802SQ20071001229
公開日2008年2月27日 申請日期2007年7月30日 優先權日2007年7月30日
發明者金鳳燮, 魚紅閃 申請人:金鳳燮