禾長蠕孢菌孢子的培養方法
2023-06-07 23:40:26
專利名稱：禾長蠕孢菌孢子的培養方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，具體涉及禾長蠕孢菌孢子的培養方法。
背景技術：
稗草是稻田惡性雜草，若不防除將嚴重影響水稻產量，目前主要通過化學除草劑 防除。化學除草劑雖然可以快速防除稻田稗草，但是，長期大量使用也帶來很多負面影響， 如稗草抗藥性生物型增加，局部地區農田和水環境被汙染，對環境和生態安全以及農業可 持續發展構成潛在威脅等。微生物除草劑是利用生物活體或生物活性物質開發的生物制 劑，具有對環境無汙染、無殘留且不易使作物產生抗藥性等優點，因而是化學除草劑很好補 充和替代品，受到各國科學家的普遍重視。禾長蠕孢菌是從自然感病稗草上分離得到雜草 生防潛力菌，對水稻、小麥、玉米、棉花和油菜等作物安全。禾長蠕孢菌孢子懸浮劑對稗草最 高防效可達到85. 2 %，對鴨舌草、野荸薺、陌上菜等其它雜草的防效也在80 %以上。因此 禾長螺孢菌有潛力開發成防除稗草的真菌除草劑，其孢子可作為真菌除草劑的主要活性成 分。目前，禾長蠕孢菌大面積推廣應用的關鍵在於其孢子批量生產技術。因此，研製開 發成本低廉的培養基配方及簡便易行的生產工藝是禾長蠕孢菌開發真菌除草劑的重要課 題。
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於設計提供一種禾長蠕孢菌孢子的培 養方法的技術方案，該方法簡單易行，成本低廉，且能大批量的得到禾長蠕孢菌孢子。所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於包括以下工藝步驟1)接種體的製備將4°C斜面保存的出發菌株禾長蠕孢菌轉接到新鮮PDA培養基上，在27 29°C黑 暗條件下活化培養6 8天後，取直徑為4. 5 6. 5mm的菌塊，接種於PDB培養基中，在溫 度27 29°C，轉速100 250r/min條件下振蕩培養2 4天，然後取8 12mL處於對數 生長期的菌懸液接種於IOOmL新鮮PDB中，在溫度27 29°C，轉速100 250r/min條件下 振蕩培養2 4天後，備用；2)禾長蠕孢菌孢子生產培養基的製備以珍珠巖、稻殼或麥秸稈為底物基質，然後以底物基質體積為基準，加入佔底物基 質體積3% 8% (w ν)的燕麥粉、米粉或小麥粉，0.5% 1.5% (w ν)的豆粕粉、大豆 蛋白粉或大豆粉，0. 1 0.2% (w v) &MgS04，0.1 0.2% (w ν)的 Na3PO4 和 30% 50% (w ν)的水分，混合均勻後121°C高壓滅菌20min，冷卻後備用；3)禾長蠕孢菌孢子的培養取步驟2)得到的禾長蠕孢菌孢子生產培養基，再在培養基中接種佔培養基重量 6% 8%的步驟1)得到的禾長蠕孢菌菌絲體懸液接種體，然後在25 28°C、黑光燈或紫外燈12小時循環光照條件下培養7 14天，得到孢子物。所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟1)中出發菌株禾長 蠕孢菌轉接到新鮮PDA培養基後，在28°C黑暗條件下活化培養7天。所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟1)中取直徑為5. 5mm 的菌塊，接種於PDB培養基中，在溫度28°C，轉速150r/min條件下振蕩培養3天。所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟1)中取10mL處於對 數生長期的菌懸液接種於lOOmL新鮮PDB中，在溫度28°C，轉速150r/min條件下振蕩培養 3天。所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟2)中以底物基質體 積為基準，加入佔底物基質體積4% 7%的燕麥粉、米粉或小麥粉， 1. 5%的豆粕粉、 大豆蛋白粉或大豆粉，0. 15 0. 2%的MgS04，0. 15 0. 2%的Na3P04和35% 45%的水 分。所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟2)中麥秸稈為加工 至粉末狀的麥秸稈。所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟2)中在培養基中接 種7%的禾長蠕孢菌菌絲體懸液接種體，然後在26 27°C、黑光燈或紫外燈12小時循環光 照條件下培養9 12天。上述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，設計合理，發明中涉及的生產培養基組成簡 單，成本低廉，涉及的孢子培養和生產方法簡單易行，其孢子產量可以達到0.213士0.0145 億孢子/g底物基質，使得禾長蠕孢菌孢子製劑的開發成為可能。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步說明本發明。實施例11)接種體的製備將4°C斜面保存的出發菌株禾長蠕孢菌轉接到新鮮PDA培養基上，在27°C黑暗 條件下活化培養8天後，取直徑為6. 5mm的菌塊，接種於PDB培養基中，在溫度27 V，轉速 100r/min條件下振蕩培養2天，然後取8mL處於對數生長期的菌懸液接種於lOOmL新鮮PDB 中，在溫度27°C，轉速lOOr/min條件下振蕩培養2天後，備用；2)禾長蠕孢菌孢子生產培養基的製備以珍珠巖為底物基質，添加珍珠巖體積4%的小麥粉、珍珠巖體積0. 5%的豆粕 粉、珍珠巖體積0. 1 %的MgS04、珍珠巖體積0. 2%的Na3P04和珍珠巖體積50%自來水；混合 均勻後培養基在121°C高溫滅菌20min ；3)禾長蠕孢菌孢子的培養取步驟2)得到的禾長蠕孢菌孢子生產培養基，再在培養基中接種佔培養基重量 6%的步驟1)得到的禾長蠕孢菌菌絲體懸液接種體，然後在25°C、黑光燈循環光照條件下 培養7天，得到孢子液，孢子液中孢子產量約為0. 187士0. 0152億孢子/克底物基質。涉及的PDA培養基含有馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L。涉及的PDB培養基含有馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L。
實施例21)接種體的製備將4°C斜面保存的出發菌株禾長蠕孢菌轉接到新鮮PDA培養基上，在28°C黑暗 條件下活化培養7天後，取直徑為5. 5mm的菌塊，接種於PDB培養基中，在溫度28°C，轉速 150r/min條件下振蕩培養3天，然後取IOmL處於對數生長期的菌懸液接種於IOOmL新鮮 PDB中，在溫度28°C，轉速150r/min條件下振蕩培養3天後，備用；2)禾長蠕孢菌孢子生產培養基的製備以珍珠巖為底物基質，添加珍珠巖體積4%的米粉、珍珠巖體積1 %的豆粕粉、珍 珠巖體積0. 的MgSO4、珍珠巖體積0. 2%的Na3PO4和珍珠巖體積40%自來水；混合均勻 後培養基在121°C高溫滅菌20min ；3)禾長蠕孢菌孢子的培養取步驟2)得到的禾長蠕孢菌孢子生產培養基，再在培養基中接種佔培養基重量 8%的步驟1)得到的禾長蠕孢菌菌絲體懸液接種體，然後在26°C、黑光燈循環光照條件下 培養11天，得到孢子培養物，孢子培養物中孢子產量約為0. 213士0. 0145億孢子/克底物基質。實施例31)接種體的製備將4°C斜面保存的出發菌株禾長蠕孢菌轉接到新鮮PDA培養基上，在28°C黑暗 條件下活化培養7天後，取直徑為5. 5mm的菌塊，接種於PDB培養基中，在溫度28°C，轉速 150r/min條件下振蕩培養3天，然後取IOmL處於對數生長期的菌懸液接種於IOOmL新鮮 PDB中，在溫度28°C，轉速150r/min條件下振蕩培養3天後，備用；2)禾長蠕孢菌孢子生產培養基的製備以粉末狀麥秸稈為底物基質，添加麥秸稈體積6%的燕麥粉、麥秸稈體積0. 5%的 大豆蛋白粉、麥秸稈體積0. 2%的MgSO4、麥秸稈體積0. 的Na3PO4和麥秸稈體積30%自 來水；混合均勻後培養基在121°C高溫滅菌20min ；3)禾長蠕孢菌孢子的培養取步驟2)得到的禾長蠕孢菌孢子生產培養基，再在培養基中接種佔培養基重量 8%的步驟1)得到的禾長蠕孢菌菌絲體懸液接種體，然後在27°C、紫外燈循環光照條件下 培養12天，得到孢子培養物，孢子培養物中孢子產量約為0. 194士0. 0122億孢子/克底物基質。實施例41)接種體的製備將4°C斜面保存的出發菌株禾長蠕孢菌轉接到新鮮PDA培養基上，在29°C黑暗 條件下活化培養6天後，取直徑為4. 5mm的菌塊，接種於PDB培養基中，在溫度29°C，轉速 250r/min條件下振蕩培養4天，然後取12mL處於對數生長期的菌懸液接種於IOOmL新鮮 PDB中，在溫度29°C，轉速250r/min條件下振蕩培養4天後，備用；2)禾長蠕孢菌孢子生產培養基的製備以稻殼為底物基質，添加稻殼體積3%的米粉、稻殼體積1. 5%的大豆粉、稻殼體 積0. 2%的MgSO4、稻殼體積0. 的Na3PO4和稻殼體積40%自來水；混合均勻後培養基在
5121 °C高溫滅菌20min ；3)禾長蠕孢菌孢子的培養取步驟2)得到的禾長蠕孢菌孢子生產培養基，再在培養基中接種佔培養基重量 8%的步驟1)得到的禾長蠕孢菌菌絲體懸液接種體，然後在28°C、紫外燈循環光照條件下 培養14天，得到孢子培養物，孢子培養物中孢子產量約為0. 179士0. 0129億孢子/克底物基質。
權利要求
禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於包括以下工藝步驟1)接種體的製備將4℃斜面保存的出發菌株禾長蠕孢菌轉接到新鮮PDA培養基上，在27～29℃黑暗條件下活化培養6～8天後，取直徑為4.5～6.5mm的菌塊，接種於PDB培養基中，在溫度27～29℃，轉速100～250r/min條件下振蕩培養2～4天，然後取8～12mL處於對數生長期的菌懸液接種於100mL新鮮PDB中，在溫度27～29℃，轉速100～250r/min條件下振蕩培養2～4天後，備用；2)禾長蠕孢菌孢子生產培養基的製備以珍珠巖、稻殼或麥秸稈為底物基質，然後以底物基質體積為基準，加入佔底物基質體積3％～8％的燕麥粉、米粉或小麥粉，0.5％～1.5％的豆粕粉、大豆蛋白粉或大豆粉，0.1～0.2％的MgSO4，0.1～0.2％的Na3PO4和30％～50％的水分，混合均勻後121℃高壓滅菌20min，冷卻後備用；3)禾長蠕孢菌孢子的培養取步驟2)得到的禾長蠕孢菌孢子生產培養基，再在培養基中接種佔培養基重量6％～8％的步驟1)得到的禾長蠕孢菌菌絲體懸液接種體，然後在25～28℃、黑光燈或紫外燈12小時循環光照條件下培養7～14天，得到孢子物。
2.如權利要求1所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟1)中出發 菌株禾長蠕孢菌轉接到新鮮PDA培養基後，在28°C黑暗條件下活化培養7天。
3 如權利要求1所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟1)中取 直徑為5. 5mm的菌塊，接種於PDB培養基中，在溫度28°C，轉速150r/min條件下振蕩培養3 天。
4.如權利要求1所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟1)中取 IOmL處於對數生長期的菌懸液接種於IOOmL新鮮PDB中，在溫度28°C，轉速150r/min條件 下振蕩培養3天。
5.如權利要求1所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟2)中以底 物基質體積為基準，加入佔底物基質體積4% 7%的燕麥粉、米粉或小麥粉， 1.5% 的豆粕粉、大豆蛋白粉或大豆粉，0. 15 0. 2%的MgSO4,0. 15 0. 2%的Na3PO4和35% 45%的水分。
6.如權利要求1所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟2)中麥秸 稈為加工至粉末狀的麥秸稈。
7.如權利要求1所述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，其特徵在於所述的步驟2)中在 培養基中接種7%的禾長蠕孢菌菌絲體懸液接種體，然後在26 27°C、黑光燈或紫外燈12 小時循環光照條件下培養9 12天。
全文摘要
禾長蠕孢菌孢子的培養方法，屬於微生物技術領域。其包括以下步驟1)接種體的製備；2)禾長蠕孢菌孢子生產培養基的製備；3)禾長蠕孢菌孢子的培養。上述的禾長蠕孢菌孢子的培養方法，設計合理，發明中涉及的生產培養基組成簡單，成本低廉，涉及的孢子培養和生產方法簡單易行，其孢子產量可以達到0.213±0.0145億孢子/g底物基質，使得禾長蠕孢菌孢子製劑的開發成為可能。
文檔編號C12N3/00GK101886058SQ20101020959
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月24日 優先權日2010年6月24日
發明者餘柳青, 張建萍, 楊爽, 段桂芳 申請人:中國水稻研究所