利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法

2023-07-03 20:16:06 1

專利名稱：利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法
技術領域：
本發明涉及麻瘋樹的組織培養技術領域及基因工程領域，尤其是指利用卡那黴素作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法。
背景技術：
能源危機是當今世界面臨的巨大挑戰。中國的石油儲量僅佔全世界的2%，消費量卻居世界第二，因此，迫切地需要尋找一種新型的能源來替代目前廣泛使用的化石能源。與化石資源相比，種植能源植物獲取生物柴油具有可再生的優勢，是解決能源危機的根本途徑。目前已發現的能源植物，主要集中在夾竹桃科、大戟科、蘿摩科、菊科、桃金孃科以及豆科等。麻瘋樹OaioMa curcas L.)，又名小桐子、柴油樹，為大戟科，麻瘋樹屬，多年生落葉灌木或小喬木。小桐子種仁含油量高達61. 5%，可作為生產生物柴油的原料，是最有可能成為未來替代化石能源的樹種，具有巨大的開發潛力。小桐子耐乾旱貧瘠，分布於熱帶、 亞熱帶和雨量稀少、條件惡劣的乾熱河谷地區，主要分布於中國雲南、貴州、四川、廣東、廣西、海南等地。植物轉基因技術可將外源基因導入植物，定向改造植物性狀而日益受到人們的重視。根癌農桿菌介導法是最常用的植物基因轉化方法之一。根癌農桿菌含有Ti質粒，其上有一段T-DNA區，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞後，可將T-DNA插入到植物基因組中， 並且可通過減數分裂穩定的遺傳給後代，這一特性成為農桿菌介導法植物轉基因的理論基礎。Ti質粒上含有另一個重要的區域，是Vir區，它編碼實現質粒轉移所需的蛋白質。我們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，藉助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然後通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。然而，麻瘋樹的研究工作起步較晚，關於麻瘋樹組織培養和遺傳轉化技術的報導還很少。2010年，Pan等在African Journal of Biotechnology上發表文章，以卡那黴素作為篩選劑，利用農桿菌介導法對麻瘋樹進行轉化。該方法是在篩選階段不添加卡那黴素而獲得轉基因植株，然而120株再生植株只有1株生根，成功率太低而不具有實用性。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，以便高效地獲得轉基因植株。為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案一種利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，包括以下步驟
步驟(1)，分別製備麻瘋樹外植體以及農桿菌菌液，再將外植體經農桿菌液浸染後進行
共培養；
步驟(2)，將共培養後的外植體脫菌後接入篩選培養基C13KC進行培養，從而獲得抗性愈傷組織，所述篩選培養基C13KC是含有1. 0-3. Omg/L的6-苄基嘌呤、0. 25-1. Omg/L的 3-吲哚丁酸、1-50 mg/L的卡那黴素以及50-200mg/L的特美汀的MS培養基；
步驟(3)，將抗性愈傷組織轉入分化培養基SR13KC進行培養，分化出抗性不定芽，所述分化培養基SR13KC是含有1. 0-3. Omg/L的6-苄基嘌呤、0. 25-1. Omg/L的3-吲哚丁酸、 l-50mg/L的卡那黴素以及50-200mg/L的特美汀的MS培養基；以及
步驟(4)，將抗性不定芽轉入生根培養基R2KC中進行培養，從而獲得轉基因植株，所述生根培養基R2KC是含有0. 1-1. Omg/L的3-吲哚丁酸，l_50mg/L的卡那黴素，50_200mg/L 的特美汀的1/2MS培養基。進一步地，步驟(1)中，共培養時採用C13A固體培養基，該C13A固體培養基是指含 1. 0-3. 0mg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. 0mg/L 3-吲哚丁酸，50-200 μ M 乙醯丁香酮，20-30 g/L 蔗糖，7 g/L瓊脂的MS培養基，pH 5. 8-6. 0。進一步地，步驟(1)中，麻瘋樹外植體的製備經由以下步驟挑選麻瘋樹種子經消毒後，取出完整的胚和子葉，接種於MS培養基培養萌發，獲得子葉，切製成外植體，本步驟中採用的MS培養基含有20-30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH5. 8-6. 0。 進一步地，步驟(1)中，製備麻瘋樹外植體時，將完整的胚和子葉接種於MS培養基後先暗培養2-4天，再光照培養10-12天，種子即萌發，光照培養條件是溫度23-26°C，光照12-16小時/天，光照強度1800-2000 Ix0進一步地，步驟(1)中，準備農桿菌菌液、浸染及共培養的具體步驟為
(a)挑取農桿菌的單克隆於含有抗生素的YEP液體培養基中J8°C，200rpm震蕩培養 20-M小時，然後按照1 100的體積比轉接，震蕩培養至對數生長期，OD600=O. 8-1.0，將菌液轉入50ml離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，採用C13A液體培養基重新懸浮離心收集的農桿菌，調至0D_=0. 3-0. 震蕩培養1-2個小時，獲得農桿菌菌液備用， 採用的C13A液體培養基是指含有1. 0-3. 0mg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. 0mg/L 3-吲哚丁酸， 50-200 μ M 乙醯丁香酮，20-30g/L 蔗糖的 MS 培養基，ρΗ5· 8-6. 0 ；
(b)將切好的外植體放入容器中，加入準備好的菌液進行，置於搖床以不高於100轉/ 分的速度震蕩5-15分鐘進行浸染；以及
(c)取出浸染過的材料，將其置於無菌濾紙上吸除多餘的菌液後再接入C13A固體培養基，置於23-26°C黑暗共培養2-4天。進一步地，步驟(2)進一步包括以下工藝步驟
(a)取出共培養後的外植體，置於滅菌後的無菌吸水紙上，吸去菌液；
(b)將吸去菌液的外植體接入篩選培養基CUKC進行培養，所述篩選培養基C13KC是指 MS培養基，含有1. 6-3. 0mg/L6-苄基嘌呤、0. 25-1. 0mg/L的3-吲哚丁酸、l_50mg/L卡那黴素、50-200mg/L特美汀、2-3%蔗糖及0. 7%瓊脂，且ρΗ5· 8-6. 0 ；以及
(c)置於23-26°C暗培養14-21天，獲得抗性愈傷組織。進一步地，步驟(3)採用的分化培養基SR13KC是指MS培養基，其含有 0. 25-1. ang/L6-苄基嘌呤、0. 1-1. 0mg/L3_ 吲哚丁酸、0. 01-0. ang/L 赤黴素、l_50mg/L 卡那黴素、50-200mg/L特美汀、20_30g/L蔗糖以及7g/L瓊脂，且pH5. 8-6. 0 ；接好的抗性愈傷組織在23-26°C，光照培養30-60天即可得到抗性不定芽，培養條件為，光照12-16小時/天， 光照強度1800-2000 Ix。
進一步地，步驟(4)中，首先將抗性不定芽在0. 1-1. Omg/L的3_吲哚丁酸溶液中浸泡2-10分鐘後，再接種到R2KC培養基進行生根培養，培養30-60天即可生根獲得轉基因植株，生根培養條件為2316°C，光照12-16小時/天，光照強度1800-2000 Ix0進一步地，所述生根培養基R2KC是含有0. 1-1. 0mg/L3-昭丨哚丁酸、l_50mg/L卡那黴素以及50-200mg/L特美汀的1/2MS培養基。進一步地，所述農桿菌攜帶有目的基因。本發明的有益效果如下本發明利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記，對麻瘋樹進行基因轉化，以獲得轉基因植株，轉化率可達1-5%左右(轉基因植株數佔外植體總數的比例)。因農桿菌介導的轉化方法具轉化的基因多為單拷貝，且有明確的邊界序列，遺傳穩定，多數符合孟德爾遺傳規律，價格低廉等，為利用植物基因工程技術對麻瘋樹進行遺傳改良，獲得高產，高油，抗寒等新品種奠定了良好的基礎。本發明選擇了麻瘋樹的成熟種子萌發後的子葉作為外植體，不僅抗性愈傷組織得出率和分化率較高，且不受季節的限制，為大批量進行農桿菌轉化奠定了良好的基礎。本發明在抗性愈傷組織階段，分化階段及生根階段，分別選擇了合適的篩選劑濃度，既避免了非轉化愈傷的逃逸及後期大量的分子檢測工作，又獲得了大量抗性愈傷組織， 保證了抗性植株的正常生長和分化。
具體實施例方式本發明利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，主要涉及以下步驟
步驟(1)又包括如下子步驟種子的消毒及萌發、農桿菌準備、農桿菌轉化和共培養； 步驟(2)抗性愈傷組織的誘導； 步驟(3):分化出不定芽； 步驟(4):生根培養。此外，還可進行移栽及檢測步驟。下面對各步驟作進一步的具體描述。步驟(1)的具體工藝步驟如下 1、種子的消毒及萌發
首先採集麻瘋樹種子，挑取飽滿的種子，剝去外殼，經消毒處理後剝去胚乳，將完整的胚和子葉接種在MS培養基上萌發，得到無菌苗。MS培養基配方及pH值為20-30g/L蔗糖及7g/L瓊脂，pH 5. 8-6. 0。種子的消毒方法包括以下工藝步驟
(1)75% (體積比)乙醇浸泡30秒；
(2)無菌水洗2-3次；
(3)0.1%升汞浸泡3-5分鐘；
(4)倒出升汞，用無菌水洗4-6次，每次5分鐘；
(5)加入無菌水，浸泡2-4小時；
(6)剝去胚乳，取完整的胚和子葉，接種於MS培養基(20-30g/L蔗糖，7g/L瓊脂， PH5. 8-6. 0)中，每瓶培養基接2-3顆；(7)接好的材料先在暗培養2-4天，然後光照培養10-12天。種子萌發的培養條件是，溫度23_26°C，光照12_16小時/天，光照強度1800-2000 Ix02、農桿菌菌液的準備
挑取農桿菌的單克隆，如EHA105，LBA4404，GV3101等，分別含有表達載體pBI 121，於含有相應抗生素的YEP液體培養基中，28°C，200rpm震蕩培養20- 小時，然後按照體積比為 1 :100轉接YEP液體培養基中，震蕩培養至對數生長期，農桿菌的濃度為OD6tltl=O. 8-1.0。將菌液轉入50mL離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，用C13A液體培養基重新懸浮農桿菌，調至OD6tltl=O. 3-0. 6J8°C培養1-2個小時，即獲得農桿菌菌液備用。其中，所用YEP液體培養基配方及pH值為10g/L蛋白腖，5g/L酵母提取物，IOg/ L氯化鈉，pH7. 0。C13A液體培養基是指含有1. 0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤、0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸、50-200 μ M乙醯丁香酮及20-30g/L蔗糖的MS培養基，pH5. 8-6. O。3、農桿菌轉化和共培養具體包括如下工藝步驟
(1)取滅菌的盤，中間墊上兩層濾紙；
(2)取出無菌苗，用剪刀剪下長勢較好的子葉，放入盤中；
(3)然後加入少量水，用刀將其切成0.5X0.5cm大小；
(4)將切好的葉片放入50或IOOmL三角瓶中，加入準備好的菌液，置於搖床以不高於 100轉/分的速度震蕩5-15分鐘；
(5)取出浸染過的材料，倒掉菌液，將葉片放在濾紙上，吸去多餘的菌液，接入C13A固體培養基，其中C13A固體培養基是指含1. 0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤、0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸、50-200 μ M乙醯丁香酮、20-30g/L蔗糖及7g/L瓊脂的MS培養基，pH 5. 8-6. O ；
(6)接好的材料在23-26°C暗培養2-4天。步驟(2)的具體工藝步驟如下
(1)取出共培養後的材料，置於無菌的吸水紙上，吸去多餘的菌液；
(2)將材料接入篩選培養基C13KC進行培養，該篩選培養基C13KC是指MS培養基，含有 1.0-3. Omg/L 6-苄基嘌呤、0.25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸、l_50mg/L 卡那黴素、50-200 mg/ L 特美汀、20-30 g/L 蔗糖及 7g/L 瓊脂，pH 5. 8-6. O ；
(3)將接好的材料在23-26°C暗培養14-21天，獲得抗性愈傷組織。步驟(3)的具體工藝步驟如下
(1)將獲得的抗性愈傷組織，轉入分化培養基SR13KC；該分化培養基SR13KC是指MS培養基，含有 0.25-1. 2 mg/L 6-苄基嘌呤、0. 1-1.0 mg/L 3-吲哚丁酸、0. 01-0. 2 mg/L 赤黴素、l-50mg/L 卡那黴素、50-200mg/L 特美汀、20-30 g/L 蔗糖以及 7g/L 瓊脂，pH 5. 8-6. O ；
(2)接好的材料在23-26°C，光照培養30-60天即可得到不定芽。培養條件為，光照 12-16小時/天，光照強度1800-2000 Ix0步驟(4)的具體工藝步驟如下
將分化出的不定芽在0. 1-1. Omg/L的3-吲哚丁酸溶液中浸泡2-10分鐘後，再接種到生根培養基上30-60天即可生根。所述生根培養基是指1/2MS培養基，其含有0. 1-1.0 mg/L 3-吲哚丁酸、1-50 mg/L卡那黴素和50-200 mg/L特美汀。生根培養條件為，23- °C，光照12-16小時/天，光照強度1800-2000 Ix0通過上述步驟獲得的轉基因植株再進行移栽，通常是待再生苗根長到2 3cm時進行煉苗移栽。並且，可對成活再生轉基因植株進行⑶S染色檢測，以確認基因轉化效果，通常是取成活再生植株的葉片，置於⑶S染色液中，37°C過夜染色，藍色即為轉基因植株。通過以上的方法可以實現對麻瘋樹進行基因轉化，從而使目的基因在植物細胞中得到表達。攜帶各種不同目的基因的農桿菌，按上述方法進行介導，根據插入的目的基因不同，就可以實現對麻瘋樹進行定向改造，從而實現對麻瘋樹的遺傳改良，以提高其各種特性，如提高油含量、產量，抗寒性等。下面結合實例詳述描述本發明的實施方案。需要說明的是，下述實例是說明性的， 不是限定性的，不能以下述實例來限定本發明的保護範圍。實例 1
本實例以農桿菌介導將GUS基因轉入雲南元謀野生麻瘋樹，具體闡述本發明創造的方法，樣品的總數量以及經各處理步驟後的存活數量請參考表1。
步驟(1 )，具體操作包括
1、採集雲南元謀野生麻瘋樹種子。挑取飽滿的種子，剝去外殼，75%乙醇中浸泡30秒， 無菌水衝洗2次，然後在0. 1%氯化汞中消毒3分鐘，無菌水衝洗5次，然後用無菌水浸泡2 小時後剝去胚乳。取完整的胚和子葉，接種於MS培養基中，每瓶接2顆，23°C暗培養2天後轉入光照培養10天，得到實驗用的無菌苗。2、挑取農桿菌EHA105 (含有表達載體pBI121)的單克隆於含有抗生素利福平 (20mg/L)，慶大黴素(20mg/L)和卡那黴素(50mg/L)的YEP培養基中，28°C，200rpm震蕩培養20小時，然後按照1 :100體積比轉接至300mL YEP培養基中，震蕩培養對數生長期，農桿菌濃度為OD6tltl=O. 8-1. 0。將菌液轉入50mL離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，用 C13A液體培養基(具體配方為含有1.0mg/L 6-苄基嘌呤、0. 25mg/L 3-吲哚丁酸、50μΜ 乙醯丁香酮及20g/L蔗糖的MS培養基，pH5. 8)重新懸浮農桿菌，調至0D_=0. 3，培養 1個小時，備用。3、取滅菌的盤，中間墊上兩層濾紙。選取生長健壯，葉面平整均勻的無菌苗子葉， 加入少量水，切成0.5X0. 5cm (並不限於此尺寸)大小。將切好的葉片放入50或IOOmL三角瓶中，加入準備好的菌液，置於搖床以100轉/分的速度震蕩10分鐘。然後取出浸染過的材料，倒掉菌液，將葉片放在濾紙上，吸去多餘的菌液，接入C13A固體培養基(具體配方為 含1. Omg/L 6-苄基嘌呤、0. 25mg/L 3-吲哚丁酸、50 μ M乙醯丁香酮、20g/L蔗糖及7g/L瓊脂的MS培養基，pH5. 8)，置於23°C暗培養2天。步驟(2)取出共培養後的材料(外植體總數為1094塊)，置於滅菌後的無菌濾紙上，吸去菌液，接入篩選培養基ClIC (具體配方為含有1. Omg/L 6-苄基嘌呤、0.25mg/L 3-吲哚丁酸、lmg/L卡那黴素、50mg/L特美汀、20g/L蔗糖及7g/L瓊脂的MS培養基，pH5. 8)， 230C暗培養14天，獲得抗性愈傷組織936塊，抗性愈傷組織率為85. 6%左右，見表1。步驟(3)將獲得的抗性愈傷組織，轉入分化培養基SR13KC (具體配方為MS培養基含0. 25mg/L 6-苄基嘌呤、0. lmg/L 3-吲哚丁酸、0. Olmg/L赤黴素、lmg/L卡那黴素、50mg/L特美汀、20g/L蔗糖及7g/L瓊脂，pH 5. 8)，23°C，光照培養30天即可得到抗性不定芽。培養條件為，光照12小時/天，光照強度1800 Ix0分化出芽的抗性愈傷組織為422 塊，抗性愈傷組織分化率為45. 1 %，見表1。步驟(4)將分化出的抗性不定芽(共81株)在0. 5mg/L的3_吲哚丁酸溶液中浸泡5分鐘後，接種到生根培養基1/2MS培養基上光照培養30天即可生根。待再生苗根長到2 3 cm時進行煉苗移栽至溫室。取成活再生植株的葉片，置於⑶S染色液中，37°C過夜染色，藍色即為轉基因植株。表1本發明實例中的抗性愈傷組織得出率及分化率
權利要求
1.一種利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於，包括以下步驟步驟(1)，分別製備麻瘋樹外植體以及農桿菌菌液，再將外植體經農桿菌液浸染後進行共培養；步驟(2)，將共培養後的外植體脫菌後接入篩選培養基C13KC進行培養，從而獲得抗性愈傷組織，所述篩選培養基C13KC是含有1. 0-3. Omg/L的6-苄基嘌呤、0. 25-1. Omg/L的 3-吲哚丁酸、1-50 mg/L的卡那黴素以及50-200mg/L的特美汀的MS培養基；步驟(3)，將抗性愈傷組織轉入分化培養基SR13KC進行培養，分化出抗性不定芽，所述分化培養基SR13KC是含有1. 0-3. Omg/L的6-苄基嘌呤、0. 25-1. Omg/L的3-吲哚丁酸、 l-50mg/L的卡那黴素以及50-200mg/L的特美汀的MS培養基；以及步驟(4)，將抗性不定芽轉入生根培養基R2KC中進行培養，從而獲得轉基因植株，所述生根培養基R2KC是含有0. 1-1. Omg/L的3-吲哚丁酸，l_50mg/L的卡那黴素，50_200mg/L 的特美汀的1/2MS培養基。
2.如權利要求1所述的利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於步驟(1)中，共培養時採用C13A固體培養基，該C13A固體培養基是指含 1. 0-3. 0mg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. 0mg/L 3-吲哚丁酸，50-200 μ M 乙醯丁香酮，20-30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂的MS培養基，pH 5. 8-6. 0。
3.如權利要求1所述的利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於步驟(1)中，麻瘋樹外植體的製備經由以下步驟挑選麻瘋樹種子經消毒後，取出完整的胚和子葉，接種於MS培養基培養萌發，獲得子葉，切製成外植體，本步驟中採用的MS培養基含有20-30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH5. 8-6. 0。
4.如權利要求3所述的利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於步驟(1)中，製備麻瘋樹外植體時，將完整的胚和子葉接種於MS培養基後先暗培養2-4天，再光照培養10-12天，種子即萌發，光照培養條件是溫度23-26°C， 光照12-16小時/天，光照強度1800-2000 Ix0
5.如權利要求2所述的利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於步驟(1)中，準備農桿菌菌液、浸染及共培養的具體步驟為(a)挑取農桿菌的單克隆於含有抗生素的YEP液體培養基中，28°C，200rpm震蕩培養 20-24小時，然後按照1 :100的體積比轉接，震蕩培養至對數生長期，OD600=O. 8-1.0，將菌液轉入50ml離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，採用C13A液體培養基重新懸浮離心收集的農桿菌，調至0D_=0. 3-0.6，28°C震蕩培養1_2個小時，獲得農桿菌菌液備用， 採用的C13A液體培養基是指含有1. 0-3. 0mg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. 0mg/L 3-吲哚丁酸， 50-200 μ M 乙醯丁香酮，20-30g/L 蔗糖的 MS 培養基，ρΗ5· 8-6. 0 ；(b)將切好的外植體放入容器中，加入準備好的菌液進行，置於搖床以不高於100轉/ 分的速度震蕩5-15分鐘進行浸染；以及(c)取出浸染過的材料，將其置於無菌濾紙上吸除多餘的菌液後再接入C13A固體培養基，置於23-26°C黑暗共培養2-4天。
6.如權利要求1所述的利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於步驟(2 )進一步包括以下工藝步驟(a)取出共培養後的外植體，置於滅菌後的無菌吸水紙上，吸去菌液；(b)將吸去菌液的外植體接入篩選培養基CUKC進行培養，所述篩選培養基C13KC是指 MS培養基，含有1. 6-3. 0mg/L6-苄基嘌呤、0. 25-1. Omg/L的3-吲哚丁酸、l_50mg/L卡那黴素、50-200mg/L特美汀、2-3%蔗糖及0. 7%瓊脂，且ρΗ5· 8-6. 0 ；以及(c)置於23-26°C暗培養14-21天，獲得抗性愈傷組織。
7.如權利要求1所述的利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於步驟(3)採用的分化培養基SR13KC是指MS培養基，其含有 0. 25-1. ang/L6-苄基嘌呤、0. 1-1. 0mg/L3_ 吲哚丁酸、0. 01-0. ang/L 赤黴素、l_50mg/L 卡那黴素、50-200mg/L特美汀、20_30g/L蔗糖以及7g/L瓊脂，且pH5. 8-6. 0 ；接好的抗性愈傷組織在23-26°C，光照培養30-60天即可得到抗性不定芽，培養條件為，光照12-16小時/天， 光照強度1800-2000 Ix。
8.如權利要求1所述的利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於步驟(4)中，首先將抗性不定芽在0. 1-1. Omg/L的3-吲哚丁酸溶液中浸泡2-10分鐘後，再接種到R2KC培養基進行生根培養，培養30-60天即可生根獲得轉基因植株，生根培養條件為23-26°C，光照12-16小時/天，光照強度1800-2000 Ix0
9.如權利要求1所述的利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於所述生根培養基R2KC是含有0. 1-1. 0mg/L3-吲哚丁酸、l_50mg/L卡那黴素以及50-200mg/L特美汀的1/2MS培養基。
10.如權利要求廣9中任一項所述的利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，其特徵在於所述農桿菌攜帶有目的基因。
全文摘要
本發明涉及一種利用卡那黴素抗性基因作為篩選標記對麻瘋樹進行基因轉化的方法，包括以下步驟製備麻瘋樹外植體以及農桿菌液，外植體經農桿菌浸染後進行共培養；共培養後的外植體經脫菌後接入篩選培養基C13KC進行培養，從而獲得抗性愈傷組織；將抗性愈傷組織轉入分化培養基SR13KC，分化出抗性不定芽；以及將抗性不定芽轉入生根培養基R2KC，從而獲得轉基因植株。利用本發明的方法，使利用農桿菌介導對麻瘋樹的遺傳轉化操作簡便，價格低廉，為導入功能基因對麻瘋樹進行遺傳改良，獲得高產，高油，抗寒等新品種，奠定了良好的基礎。
文檔編號A01H4/00GK102304543SQ201110237660
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月18日 優先權日2011年8月18日
發明者孫懷娟, 李耿光, 潘文歡, 王梅珍, 許文釗 申請人:普羅米綠色能源(深圳)有限公司